天津地區(qū)南美白對(duì)蝦弧菌病主要病原菌耐藥性調(diào)查

徐赟霞 楊凱 王禹 馮守明

摘 要：采用K-B紙片擴(kuò)散法和微量稀釋法對(duì)從天津地區(qū)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）中分離的弧菌進(jìn)行耐藥性調(diào)查，結(jié)果顯示2020年在養(yǎng)殖季節(jié)從天津市患病的南美白對(duì)蝦中共分離出弧菌33株，其中副溶血弧菌15株、溶藻弧菌8株、創(chuàng)傷弧菌7株、霍亂弧菌3株。在天津市南美白對(duì)蝦以副溶血弧菌污染最為嚴(yán)重，約占總數(shù)的45%左右。藥敏結(jié)果顯示分離的33株弧菌對(duì)2種及2種以上藥物耐藥的有27株，約占總數(shù)的81.8%，說明天津地區(qū)弧菌已經(jīng)出現(xiàn)了多重耐藥的現(xiàn)象;通過對(duì)33株弧菌對(duì)藥物的MIC值測(cè)定，33株弧菌對(duì)恩諾沙星、氟甲喹和鹽酸多西環(huán)素比較敏感，對(duì)磺胺類藥物比較耐藥。結(jié)果提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)天津地區(qū)南美白對(duì)蝦弧菌病主要病原菌耐藥性監(jiān)控。

關(guān)鍵詞：南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）;弧菌;耐藥性

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei），又稱凡納濱對(duì)蝦 、白腳蝦，原產(chǎn)于中、南美洲太平洋沿岸水域，是目前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的品種之一[1]。南美白對(duì)蝦作為優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，深受天津市市民的喜愛，同時(shí)也為廣大養(yǎng)殖戶帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，集約化程度的不斷提高，受外界的因素和人為的影響，南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖病害頻繁發(fā)生，給養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]?；【且环N條件致病菌，當(dāng)養(yǎng)殖水環(huán)境惡化或者其他因素影響，會(huì)使對(duì)蝦體內(nèi)機(jī)能平衡關(guān)系被打破，原來不致病的正常菌群中的細(xì)菌可成為致病菌。南美白對(duì)蝦細(xì)菌病的主要原因是弧菌病[1]，能夠引起蝦類等大量死亡。

在天津市發(fā)生上述疾病時(shí)常以藥物防控為主，主要應(yīng)用抗菌藥物進(jìn)行滅菌，藥物治療成為防治養(yǎng)殖水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的重要手段。但由于天津市南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中以小戶、散戶居多，大部分養(yǎng)殖戶在病害的防治上多是猜測(cè)著用藥、試著用藥，目前隨著治療水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌病的抗菌素類藥物使用劑量的加大，使細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性。很多細(xì)菌從原來的單一耐藥發(fā)展為多重耐藥，且耐藥性還有擴(kuò)大的趨勢(shì)，抗菌素類藥物殘留于水生動(dòng)物食品中，給水產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來巨大威脅。為此，本研究主要對(duì)天津市南美白對(duì)蝦弧菌病主要病原菌的耐藥性進(jìn)行調(diào)查，推進(jìn)天津市對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的精準(zhǔn)使用、減量使用，遏制水生動(dòng)物病原菌耐藥性的擴(kuò)大趨勢(shì)，保障天津市水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在養(yǎng)殖季節(jié)收集天津地區(qū)養(yǎng)殖的行動(dòng)緩慢、生長(zhǎng)遲緩、患紅體病等不健康的南美白對(duì)蝦作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取南美白對(duì)蝦肝胰腺接種于TCBS選擇培養(yǎng)基上，劃線分離后將培養(yǎng)皿至于恒溫培養(yǎng)箱中，于28 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）平板，純化后備用。

1.2.2 病原菌的生化鑒定 采用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對(duì)病原菌進(jìn)行生化特征分析。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

1.2.3.1 弧菌的藥物敏感性測(cè)定 采用K-B紙片擴(kuò)散法，將培養(yǎng)24 h的新鮮菌落用0.85%的無菌生理鹽水洗下，制成1.5×108CFU/mL的菌懸液，用滅菌的棉球蘸取菌懸液后均勻涂布于MHA平板，待菌懸液被培養(yǎng)基吸收后，再用滅菌鑷子取藥敏紙片，分別貼于接種了細(xì)菌的MHA培養(yǎng)基表面，倒置放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用直尺量取抑菌圈大小。結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[3]。藥敏紙片購(gòu)自O(shè)xoid公司，在有效期內(nèi)使用?？咕幬锏乃幟艏埰?、藥敏實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.3.2 病原菌最低抑菌濃度的測(cè)定 采用稀釋法測(cè)定抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC），采用藥敏板對(duì)病原菌進(jìn)行恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶等8種藥物MIC的測(cè)定，藥敏板購(gòu)自南京菲恩醫(yī)療科技公司。使用ATCC25922大腸埃希氏菌作為質(zhì)控菌株。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 使用SPSS軟件對(duì)MIC50、MIC90進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 弧菌在天津市南美白對(duì)蝦中的分布情況

2020年在養(yǎng)殖季節(jié)從天津市不健康的南美白對(duì)蝦中共分離出弧菌33株，經(jīng)生化鑒定，其中副溶血弧菌15株、溶藻弧菌8株、創(chuàng)傷弧菌7株、霍亂弧菌3株。在天津市南美白對(duì)蝦以副溶血弧菌污染最為嚴(yán)重，約占總數(shù)的45%左右。

2.2 病原菌藥物敏感性測(cè)定

對(duì)33株弧菌進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，結(jié)果見表2，從表2中可以看出，33株弧菌對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星等比較敏感，對(duì)新霉素、阿莫西林等耐藥。其中只有1株（3.0%）弧菌對(duì)所有抗生素都敏感，對(duì)1種抗生素耐藥的有5株（152%），對(duì)2種抗生素耐藥的有12株（303%），對(duì)3種抗生素耐藥的有10株（363%），對(duì)4種抗生素耐藥的有5株（15.2%）。

2.3 病原菌最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果

33株弧菌對(duì)8種抗菌藥物感受性測(cè)定結(jié)果見表3和圖1，從表3中可以看出33株弧菌對(duì)恩諾沙星、氟甲喹和鹽酸多西環(huán)素比較敏感，其MIC90分別為2.62 μg/mL、3.937 μg/mL和6548 μg/mL;其對(duì)磺胺類藥物比較耐藥，MIC90超過512 μg/mL;其對(duì)硫酸新霉素和甲砜霉素相對(duì)耐藥，MIC90分別為175.778 μg/mL和111.6 μg/mL。

3 討論

弧菌廣泛存在于自然界內(nèi)，可以與養(yǎng)殖動(dòng)物共存，不會(huì)引起疾病，但是當(dāng)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦水環(huán)境惡化、受傷、體弱、抗病力降低等，弧菌會(huì)乘虛而入，便會(huì)引起南美白對(duì)蝦發(fā)生嚴(yán)重疾病，甚至死亡[4]。2020年在天津市寶坻區(qū)周邊養(yǎng)殖的患病南美白對(duì)蝦中共分離出弧菌33株，其中副溶血弧菌15株，約占總數(shù)的45%左右，說明在天津市南美白對(duì)蝦細(xì)菌病中以副溶血弧菌污染最為嚴(yán)重，這與江艷華[5]等報(bào)道相一致，尤其在夏秋季節(jié)容易暴發(fā)流行。

當(dāng)前天津市南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖發(fā)生細(xì)菌性疾病時(shí)，藥物防治仍然是主要的治療手段。為了防治疾病，不少養(yǎng)殖戶在飼料中長(zhǎng)期添加抗菌藥物。在發(fā)生疾病的時(shí)候，養(yǎng)殖戶盲目亂用、濫用抗菌藥物，造成了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，而且耐藥程度不斷提高，甚至出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)象，危害嚴(yán)重。本研究考察了從天津市患病的南美白對(duì)蝦分離出的弧菌對(duì)常用的八類抗生素的耐受情況，結(jié)果顯示，分離的33株弧菌對(duì)2種及2種以上藥物耐藥的有27株，約占總數(shù)的81.8%，說明天津地區(qū)弧菌已經(jīng)出現(xiàn)了多重耐藥的現(xiàn)象;在此基礎(chǔ)之上我們又測(cè)定了33株弧菌對(duì)8種藥物的MIC值，33株弧菌對(duì)恩諾沙星、氟甲喹和鹽酸多西環(huán)素比較敏感，其MIC90分別為2.62 μg/mL、3.937 μg/mL和6.548 μg/mL;對(duì)磺胺類藥物比較耐藥MIC90超過512 μg/mL。本試驗(yàn)結(jié)果可為天津地區(qū)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦過程中出現(xiàn)的弧菌病用藥提供理論支撐。

綜上所述，在天津地區(qū)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦過程中由于抗菌藥物的不合理使用，已使大量弧菌產(chǎn)生了耐藥性，而且已經(jīng)出現(xiàn)了多重耐藥的現(xiàn)象。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生多是由于抗生素選擇的結(jié)果，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，細(xì)菌的耐藥性可通過耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移將耐藥性進(jìn)行傳遞，而水產(chǎn)養(yǎng)殖又具有擴(kuò)散性和流動(dòng)性等特點(diǎn)，因此水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌將耐藥性傳播給人類致病菌潛在危險(xiǎn)極大[6]。為了降低南美白對(duì)蝦弧菌耐藥性，可以采取以下幾種方式：在飼料中添加免疫制劑，提高對(duì)蝦抗病力，減少疾病的發(fā)生[7];在治療疾病時(shí)，從患病動(dòng)物體內(nèi)分離病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選藥，不可盲目選擇抗菌藥物;定期對(duì)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦體內(nèi)攜帶的致病菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，掌握養(yǎng)殖水體和南美白對(duì)蝦體內(nèi)致病菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥性變化[8];應(yīng)積極開展水產(chǎn)動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)和研究。

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The antimicrobial resistance investigation of Vibrio from Penaeus vannamei in Tianjin area

XU Yunxia， YANG Kai， WANG Yu， FENG Shouming

（Tian Jin Animal Disease Prevention and Control Center，Tianjin 300402，China）

Abstract：The antimicrobial resistance investigation of Vibrio was performed by K-B and Microdilution method which isolated from Penaeus vannamei cultured in Tianjin area.The results showed that 33 strains of Vibrio were isolated from the diseased Penaeus vannamei in the breeding season in 2020， including 15 strains of Vibrio parahaemolyticus， 8 strains of Vibrio alginolyticus， 7 strains of Vibrio vulnificus and 3 strains of Vibrio cholerae.Vibrio parahaemolyticus was the most of them， accounting for about 45% of the total.The drug sensitivity results showed that 27 of the 33 Vibrio strains isolated were resistant to 2 or more kinds of antibiotics， accounting for 81.8% of the total， indicating that multiple drug resistance had appeared in Tianjin.Mics showed that 33 Vibrio strains were more sensitive to enoxacin， flumequine and doxycycline hydrochloride， and more resistant to sulfonamides.The results suggested that it is necessary to strengthen the monitoring of pathogenicity and antimicrobial resistance of Vibriosis which isolated from Penaeus vannamei cultured in Tianjin.

Key words：Penaeus vannamei; Vibrio;antimicrobial resistance

（收稿日期：2020-12-21;修回日期：2021-01-07）