不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)菠蘿漿品質(zhì)的影響

李依娜，鄒 穎，余元善，鄒 波，肖更生，3 *，吳繼軍

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510631）

菠蘿（pineapple）又名鳳梨、露兜子等，是鳳梨科鳳梨屬多年生草本植物。其果肉酸甜可口，氣味芳香獨(dú)特，具有生津止渴、健胃助消化的作用[1]。菠蘿原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū)，我國種植區(qū)域主要分布在廣東、福建、廣西、臺(tái)灣等省區(qū)，是目前華南主產(chǎn)區(qū)外銷水果之一[2]。菠蘿富含糖類、有機(jī)酸、維生素和礦物質(zhì)，其飽和脂肪、膽固醇和鈉含量非常低[3-4]。此外，據(jù)MHATRE M等[5-6]報(bào)道，菠蘿含有的綠原酸、沒食子酸和阿魏酸等豐富酚類化合物，已被證明具有抗氧化、抗誘變、降血脂和抗癌作用。菠蘿漿是制造菠蘿果醬和濃縮菠蘿汁的必經(jīng)中間產(chǎn)物，目前對(duì)于菠蘿的研究以菠蘿復(fù)合飲料和菠蘿果酒等加工產(chǎn)品為主，或?qū)⒉ぬ}制粉添加到餅干、糕點(diǎn)中增加風(fēng)味[7-9]。

乳酸菌（lactic acid bacteria）是發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱。目前大多數(shù)益生菌食品均以乳制品為基礎(chǔ)，但這對(duì)于乳糖不耐受或?qū)Φ鞍踪|(zhì)過敏的消費(fèi)者造成不便。相比之下，乳酸菌發(fā)酵果蔬既保留了果蔬本身豐富的營養(yǎng)物質(zhì)、增加其風(fēng)味，還賦予了飲品更高的營養(yǎng)保健價(jià)值[10]，具有改善胃腸道、抗氧化、控制血清膽固醇含量的益生作用[11]。沈燕飛[12]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為適宜蘋果原漿發(fā)酵的乳酸菌，發(fā)酵5 d具有良好的抗氧化活性和感官評(píng)價(jià)；楊立啟[13]研究表明，植物乳桿菌在柑橘全果汁中具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，其發(fā)酵體系中黃酮和多酚含量明顯高于另兩者發(fā)酵體系。菠蘿全果漿富含膳食纖維，目前對(duì)益生菌直接發(fā)酵菠蘿漿的研究并不多，隨著人們對(duì)于健康飲食關(guān)注的提高，傳統(tǒng)的菠蘿加工產(chǎn)品已不能滿足消費(fèi)者日益增長(zhǎng)的需求，因而開拓營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特的乳酸菌發(fā)酵菠蘿飲料有著廣闊的市場(chǎng)前景[14]。

乳酸菌能夠在天然菠蘿汁中良好生長(zhǎng)，無需額外補(bǔ)充營養(yǎng)素。故本實(shí)驗(yàn)直接以菠蘿漿為原料，分別接種不同乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵24 h后的酶活力、抗氧化活性和揮發(fā)性成分，以探究乳酸菌對(duì)發(fā)酵菠蘿漿品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿：市售；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，Lc）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）、腸膜狀明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，Lm）：本實(shí)驗(yàn)室保存；MRS肉湯培養(yǎng)基、酪蛋白：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活試劑盒：上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品）：美國Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)：美國VARIAN 公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；UV-1800型分光光度計(jì)：日本島津公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-5OS型立式蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SYNERGY H1多功能酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；6890N/5975B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫科技有限公司；57060-U固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取纖維頭：美國SUPELCO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菠蘿漿的制備

挑選成熟度相似的菠蘿（七、八成熟），削皮去眼，將菠蘿洗凈，切片打漿即為菠蘿漿，貯藏于-20 ℃冰柜庫中備用。

1.3.2 菌種培養(yǎng)物制備

3株乳酸菌Lc、Lp和Lm及其保藏物置于滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行活化復(fù)壯，30 ℃靜置發(fā)酵12 h。

1.3.3 接種及發(fā)酵

菠蘿漿分別接種復(fù)壯后的Lc、Lp和Lm（菌懸液濃度約為106CFU/mL），進(jìn)行單一、兩兩復(fù)配及三者復(fù)配發(fā)酵（復(fù)合菌種配比為1∶1和1∶1∶1），接種量為0.5%，于30 ℃恒溫靜置發(fā)酵24 h。

1.3.4 測(cè)定方法

蛋白酶酶活測(cè)定：采用福林酚法，參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》進(jìn)行[15]。

SOD酶活力的測(cè)定：采用SOD活性檢測(cè)試劑盒測(cè)試。將發(fā)酵液過濾，取上清液為實(shí)驗(yàn)樣品。樣品液與工作液充分混勻后置于37℃的恒溫水浴40min，再各加入顯色劑2.00mL，最后混勻室溫放置10 min，于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度值。采用1 cm直徑比色皿，雙蒸水調(diào)零，比色。SOD酶的活力計(jì)算公式如下：

總酚含量的測(cè)定：參考SINGLETON V L等[16-17]的方法略作修改。準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的沒食子酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取400 μL標(biāo)液，分別加入1 mL 1 mol/L的福林酚試劑，用超純水定容至2 mL，室溫條件下避光靜置10 min，加入5 mL 5%Na2CO3溶液，混勻后于室溫條件下反應(yīng)45 min，利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定溶液的吸光度值，以沒食子酸溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用樣液代替沒食子酸標(biāo)液重復(fù)上述操作，測(cè)定樣液的吸光度值，結(jié)果以每克樣品中所含的沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示（mgGAE/g）。

清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力的測(cè)定：參考SOKOLLETOWSKA A等[18]的方法，取50 μL 50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液或稀釋后的樣品，混合150 μL DPPH溶液共同置于96孔細(xì)胞板中，暗處放置30 min后，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值。結(jié)果以每克發(fā)酵液中所含的Trolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）表示（μmol TE/g）。

維生素C含量的測(cè)定：參照傅維等[19]的方法，并作適當(dāng)修改。精密稱取約0.2 g 粉狀樣品，加入10 mL 2%草酸，搖勻靜置10 min，加0.2 g活性炭，充分振蕩后離心過濾后取上清液。分別吸取樣品濾液1 mL 于試管加入1 mL 250 g/L乙酸鈉溶液，充分混勻，在暗處放置20 min。避光條件下迅速向各試管加入1 mL 0.2 g/L鄰苯二胺溶液，混勻后避光反應(yīng)40 min，測(cè)定各管的熒光強(qiáng)度。根據(jù)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來計(jì)算樣品維生素C（mg/g）的含量。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析：采用頂空固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析發(fā)酵前后的菠蘿漿/汁的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[20]。樣品經(jīng)GC-MS分析，各分離組分利用計(jì)算機(jī)譜庫（美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）/WILEY）進(jìn)行檢索，當(dāng)匹配度＞80%（最大值為100%）時(shí)，予以確認(rèn)并記錄，并采用色譜峰面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

以上測(cè)定均重復(fù)3次，用SPSS 23.0和Origin 2018軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿漿發(fā)酵后蛋白酶活力的變化

由圖1可知，菠蘿漿經(jīng)24 h發(fā)酵后，蛋白酶活力顯著下降（P＜0.05）；未發(fā)酵組蛋白酶活力最高，為946.56 U/mL；干酪乳桿菌和植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵菠蘿漿蛋白酶活力分別為813.22 U/mL和821.00 U/mL，略高于腸膜狀明串珠菌單獨(dú)發(fā)酵及兩種乳酸菌復(fù)配發(fā)酵菠蘿漿，但差異不顯著（P＞0.05）；3種乳酸菌共同發(fā)酵的蛋白酶活力最低，僅為698.78 U/mL。說明添加乳酸菌發(fā)酵24 h對(duì)增加菠蘿的蛋白酶活力無顯著作用，這可能是乳酸菌自身產(chǎn)蛋白酶能力弱，菠蘿含有豐富的活性菠蘿蛋白酶和礦物質(zhì)，微量金屬離子對(duì)菌體的生長(zhǎng)、蛋白酶合成有一定影響，另一方面蛋白酶活性容易受到發(fā)酵環(huán)境和微生物產(chǎn)熱產(chǎn)氣的影響，故導(dǎo)致了各組蛋白酶活力有所差異[21]。

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)菠蘿漿蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on the protease activity of pineapple pulp

2.2 菠蘿漿發(fā)酵后SOD酶活的變化

由圖2可知，添加乳酸菌發(fā)酵對(duì)菠蘿漿的SOD酶活性無顯著性影響（P＞0.05），其中干酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復(fù)配發(fā)酵組的SOD酶活性最高，為98.48 U/g，未發(fā)酵組的SOD酶活力為97.99 U/g，干酪乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵和腸膜狀明串珠菌單獨(dú)發(fā)酵的SOD活力分別為97.70 U/g和97.12 U/g?？赡苁遣ぬ}漿天然存在超氧自由基清除因子，加乳酸菌發(fā)酵24 h后發(fā)酵體系的pH值和溶氧量并未影響到SOD酶活性，故菠蘿漿的SOD酶活性仍維持在高水平[22]。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)菠蘿漿超氧化物歧化酶活力的影響Fig.2 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on the SOD activity of pineapple pulp

2.3 菠蘿漿發(fā)酵后總酚含量的變化

由圖3可知，菠蘿漿經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵后總酚含量有所變化。未發(fā)酵組的總酚含量為0.47 mg GAE/g，干酪乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵組的總酚含量最高，為0.51 mg GAE/g，其次是植物乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復(fù)配發(fā)酵組、腸膜狀明串珠菌單獨(dú)發(fā)酵組，總酚含量分別為0.49 mg GAE/g和0.48 mg GAE/g。3種乳酸菌共同發(fā)酵組的總酚含量顯著低于其他發(fā)酵組（P＜0.05），為0.44 mg GAE/g。菠蘿漿的總酚含量在添加菌種發(fā)酵24 h后有所增加，這可能是在發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生了酯酶和酚酸脫羧酶，菠蘿經(jīng)打漿處理后糖、纖維素及蛋白質(zhì)等大分子較好地被降解利用，使得與之結(jié)合的酚類物質(zhì)被釋放出來，可溶性酚類物質(zhì)含量升高[23-24]。據(jù)段希寧等[25]的研究，總酚含量維持在較高水平的另一點(diǎn)原因可能是乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸能防止酚類物質(zhì)的降解從而導(dǎo)致總酚含量的增加。此次試驗(yàn)中干酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復(fù)配發(fā)酵組以及3種乳酸菌共同發(fā)酵組的總酚含量有所下降，推測(cè)原因可能是發(fā)酵過程中乳酸菌的生物降解作用或是產(chǎn)生多種酶系水解營養(yǎng)物質(zhì)，促使多酚物質(zhì)發(fā)生不同程度的水解或聚合，此外發(fā)酵樣品中存在溶解氧也會(huì)導(dǎo)致酚類化合物的氧化[26]。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)菠蘿漿總酚含量的影響Fig.3 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on total phenol content of pineapple pulp

2.4 菠蘿漿發(fā)酵后DPPH自由基清除能力的變化

由圖4可知，菠蘿漿未發(fā)酵組的Trolox等效抗氧化能力為5.08 μmol TE/g，加乳酸菌發(fā)酵24 h后3種乳酸菌共同發(fā)酵組的抗氧化能力顯著低于植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵組（P＜0.05），為4.91 μmol TE/g，植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵表現(xiàn)最佳，抗氧化能力達(dá)到5.37 μmol TE/g，其次為腸膜狀明串珠菌單獨(dú)發(fā)酵組，為5.25 μmol TE/g，干酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復(fù)配發(fā)酵組也能達(dá)到5.19 μmol TE/g，說明了乳酸菌發(fā)酵有利于提高菠蘿漿DPPH自由基清除能力。相關(guān)研究表明[28-31]，自由基清除能力與酚類物質(zhì)含量具有正相關(guān)性，發(fā)酵后菠蘿漿總酚含量處于較高水平有助于增強(qiáng)其抗氧化活性，這可能是由于酚類物質(zhì)提供了氫離子，并通過共振雜化而達(dá)到穩(wěn)定，從而導(dǎo)致DPPH自由基清除能力升高[32]。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)菠蘿漿DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of different lactic acid bacteria fermentation on DPPH free radical scavenging ability of pineapple pulp

2.5 菠蘿漿發(fā)酵后維生素C含量的變化

由圖5可知，未發(fā)酵組的維生素C含量為4.44 mg/g，腸膜狀明串珠菌單獨(dú)發(fā)酵組的維生素C含量為4.73 mg/g，而其他發(fā)酵組的維生素C含量均顯著下降（P＜0.05）。其中干酪乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵組、植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵組以及植物乳桿菌和腸膜狀明串珠菌復(fù)配發(fā)酵組，維生素C含量分別降至3.43 mg/g、2.83 mg/g和2.83 mg/g。維生素C含量的減少可能是維生素C自身不穩(wěn)定，極易氧化分解，加之在發(fā)酵過程中可能作為碳源被乳酸菌代謝利用，在凍干制粉貯藏過程中也會(huì)造成一定損失[33]。此次試驗(yàn)中腸膜狀明串珠菌單獨(dú)發(fā)酵菠蘿漿使維生素C含量保持在高水平，推測(cè)原因可能是腸膜狀明串珠菌產(chǎn)乳酸和苯乳酸的能力較強(qiáng)[34]，有機(jī)酸的積累使樣品內(nèi)部呈現(xiàn)酸性環(huán)境，而維生素C在酸性環(huán)境下較為穩(wěn)定。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)菠蘿漿維生素C含量的影響Fig.5 Effects of different lactic acid bacteria fermentation on vitamin C content in pineapple pulp

2.6 菠蘿漿發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)的變化

菠蘿漿經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后檢測(cè)出的揮發(fā)性物質(zhì)成分如表1所示。

由表1可知，8組樣品分別鑒別出23、29、28、24、19、23、30、22種成分，在所有樣品中，酯類化合物的數(shù)量和含量在所有揮發(fā)性成分中均最高，共檢出17種酯類，含量最多的是3-甲硫基丙酸甲酯、3-甲硫基丙酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸甲酯。其次是醛酮類和醇類，分別檢出12種和11種，醛酮類物質(zhì)主要是2-庚酮、2-壬酮和β-環(huán)檸檬醛，醇類物質(zhì)以正辛醇、2-庚醇和異戊醇為主，酸類的含量相對(duì)較少。未發(fā)酵的菠蘿漿檢測(cè)出的酯類成分占總揮發(fā)性物質(zhì)50%以上，主要為2-甲基丁酸甲酯（27.96%）、3-甲硫基丙酸甲酯（21.31%）和己酸甲酯（10.71%），張峻松等[35]研究菠蘿揮發(fā)性組分也發(fā)現(xiàn)酯類最多（15種），與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大致相符，說明菠蘿的主要芳香物質(zhì)是酯類。由表1亦可知，菠蘿漿經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵后部分酯類含量有所下降，但揮發(fā)性物質(zhì)的總數(shù)量有明顯的增加，主要表現(xiàn)在增加了醇類和醛酮的數(shù)量，其中使用干酪乳酸菌和植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵的菠蘿漿酯類、醇類和酚類等各物質(zhì)的數(shù)量和含量均處在較高水平。植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵組的醇類、醛酮類、酚類和烴類分別增加了2、1、1和2種。菠蘿漿經(jīng)干酪乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵后增加了異戊醇（14.35%），而2-甲基丁酸甲酯的含量由原本的27.96%降至14.01%。

表1 菠蘿樣品中主要揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of main volatile substances in pineapple samples by GC-MS

續(xù)表

3 結(jié)論

添加乳酸菌發(fā)酵有利于維持菠蘿漿的酶活性和抗氧化能力，發(fā)酵后的菠蘿漿芳香成分有所增加。乳酸菌單一發(fā)酵效果要好于復(fù)配發(fā)酵，其中干酪乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵可使菠蘿漿的SOD酶活保持在97.70 U/g，總酚含量達(dá)到最高（0.51 mg GAE/g），對(duì)凍干成粉后維生素C的保護(hù)作用也較可觀；植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵菠蘿漿時(shí)蛋白酶活性最好（821.00 U/mL），同時(shí)其DPPH自由基清除能力最高，達(dá)到5.37 μmol TE/g；腸膜狀明串珠菌單獨(dú)發(fā)酵組的維生素C含量最高，達(dá)到4.73 mg/g；菠蘿漿經(jīng)干酪乳酸菌和植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵后，酯類、醇類和酚類等各物質(zhì)的數(shù)量和含量均處在較高水平，鑒定出的揮發(fā)性成分分別達(dá)到29和28種。綜上，將菠蘿果肉進(jìn)行打漿處理后，選擇干酪乳桿菌或植物乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵能獲得較好的品質(zhì)，可為菠蘿加工以及開發(fā)相關(guān)菠蘿乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品提供一定的參考。