Nrf2/HO-1/GPX4對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞鐵死亡的影響及小檗堿的干預(yù)機(jī)制研究

關(guān)錫梅，解勇圣，倪偉建，唐麗琴

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，安徽 合肥 230001；3.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；4.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科，安徽 合肥 230001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是II型糖尿病中最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已成為世界范圍內(nèi)終末期腎臟病的首要原因[1]。足細(xì)胞作為腎臟組織中重要的固有細(xì)胞，位于腎小球基底膜的最外層，與內(nèi)皮細(xì)胞層、腎小球基底膜共同構(gòu)成了腎小球的3層濾過屏障，以保證腎小球毛細(xì)血管壁的選擇通透性。研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞特殊的形態(tài)和結(jié)構(gòu)對腎小球的完整性起到關(guān)鍵作用，其結(jié)構(gòu)完整以及數(shù)量的恒定可以維持腎臟的正常濾過能力[2]。研究足細(xì)胞的死亡方式，為其治療提供新的方向和靶點(diǎn)已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

細(xì)胞的死亡方式包括凋亡、自噬、鐵死亡、壞死及焦亡等。鐵死亡是新定義的一種區(qū)別于凋亡、自噬的細(xì)胞程序性死亡過程，特征在于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧自由基的異常增高[3]。文獻(xiàn)報(bào)道前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin endoperoxide synthase 2, PTGS2)在鐵死亡發(fā)生時(shí)被顯著上調(diào)；ACSL4作為脂肪酸代謝的第一步，在體內(nèi)催化合成脂酰CoA，將長鏈多不飽和脂肪酸活化[4]，以參加膜磷脂的合成，但是這些膜上的長鏈不飽和脂肪酸常被氧化，從而誘發(fā)鐵死亡。GPX4作為氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡信號的傳感器，其表達(dá)量的降低會導(dǎo)致體內(nèi)活性氧的明顯升高，被認(rèn)為是觸發(fā)鐵死亡程序的重要靶點(diǎn)。

小檗堿(berberine，BBR)是天然植物黃連根莖中提取的生物堿，具有抗氧化應(yīng)激[5]、抗炎、降低血糖的作用。課題組前期已經(jīng)深入研究了高糖刺激下足細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系，但是對于足細(xì)胞中鐵死亡的現(xiàn)象還有待進(jìn)一步的探討。小檗堿可以通過調(diào)節(jié)凋亡自噬相關(guān)信號通路，明顯改善高糖刺激下足細(xì)胞的凋亡[2, 6]以及系膜細(xì)胞增殖[7]的情況，但對于足細(xì)胞內(nèi)鐵死亡現(xiàn)象的調(diào)控作用尚未研究。此次實(shí)驗(yàn)采用體外持續(xù)性高糖刺激足細(xì)胞模擬糖尿病腎病的體內(nèi)環(huán)境，探究凋亡發(fā)生之前足細(xì)胞是否存在鐵死亡現(xiàn)象，進(jìn)一步探討小檗堿緩解高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，在臨床上為疾病發(fā)生的更早階段提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)而尋找到新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng) 腎小球足細(xì)胞MPC5，購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，貨號: 337685; 在33 ℃，10%血清，1%雙抗，1×104U·L-1γ-干擾素條件下增殖，經(jīng)37 ℃無γ-干擾素誘導(dǎo)10-14 d后分化成熟。

1.1.2藥物 鹽酸小檗堿, 購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，貨號為: BWB50137，純度≥98%。

1.1.3試劑 CCK-8細(xì)胞活力試劑盒，貝博生物(貨號：BB4202)；小鼠重組γ干擾素，MCE公司(批號：33158)；BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖試劑盒，碧云天(貨號：C0071S)；GSH和GSSG檢測試劑盒，碧云天(貨號：S0053)；RPMI 1640培養(yǎng)基，Hyclone公司(貨號：SH30809.01)；GAPDH，HO-1，均購自Cell Signaling Technology(貨號：5174，#82206);Nrf2，GPX4購自美國abcam公司(貨號：ab137550，ab125006)，desmin購自Proteintech公司(貨號：60226-1-lg)；podocin，購自Santa cruz(貨號：sc-518088)；BCA 試劑盒，碧云天(貨號: P0010S)；胎牛血清，Biological Industries(貨號：2022057); 辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠lgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔lgG，Proteintech 公司；兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Vazyme(貨號：R323-01)；SYBR qPCR試劑盒，Vazyme(貨號：Q711-02)；TRIzol試劑盒，Invitrogen。

1.1.4儀器 CO2培養(yǎng)箱(Heal Force公司) ; 流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter 公司) ; 酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司) ; 凝膠成像系統(tǒng)(Peiqing公司) ; 熒光倒置顯微鏡(Leica公司)；激光共聚焦顯微鏡(Leica 公司)；熒光定量ABI7500(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1足細(xì)胞活力檢測 96孔板中接種合適細(xì)胞密度分化成熟的足細(xì)胞，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行不同處理。設(shè)置空白對照組(blank)，正常對照組，高糖模型組(33.3 mmol·L-1)以及不同濃度小檗堿(終濃度為7.5、15、30、60、90、120、150 μmol·L-1)組，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照CCK-8試劑盒說明進(jìn)行后續(xù)操作，用酶標(biāo)儀測定每孔450 nm處的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞的活力值。

1.2.2EdU檢測足細(xì)胞增殖 將合適密度(1×105個(gè))足細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng) 24 h 后，不同組經(jīng)高糖刺激不同時(shí)間(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h)后，按照試劑盒操作固定細(xì)胞并染色，將24孔板置于熒光倒置顯微鏡下，以495 nm激發(fā)波長，519 nm 發(fā)射波長拍照，EdU綠色熒光代表正處于DNA復(fù)制期的細(xì)胞，Hoechst熒光代表所有的活細(xì)胞。

1.2.3活性氧水平的測定 將合適密度足細(xì)胞接種于6孔板，置于37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)24 h后，依次加入正常培養(yǎng)基，高糖培養(yǎng)基(33.3 mmol·L-1)以及小檗堿 (60 μmol·L-1)溶液，37 ℃繼續(xù)孵育24 h后，棄去上清液，每孔加入2 μL DCFH-DA(非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針，終濃度為10 μmol·L-1)，置于37 ℃繼續(xù)孵育20 min。最后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后，熒光顯微鏡下調(diào)整參數(shù)至激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm后進(jìn)行拍照。

1.2.4谷胱甘肽水平的測定 收集各組細(xì)胞，吸棄上清，按照試劑盒說明對細(xì)胞樣本進(jìn)行處理：加入3倍細(xì)胞沉淀體積的蛋白去除試劑M溶液，充分Vortex后，對樣品進(jìn)行兩次液氮和37 ℃的快速凍融后4 ℃放置5 min，4 ℃高速冷凍離心機(jī)，10 000g離心10 min。取上清立即用酶標(biāo)儀測定A412，并對比各組的含量變化情況。

1.2.5激光共聚焦顯微鏡檢測 將分化成熟的足細(xì)胞在激光共聚焦小皿中培養(yǎng)，室溫4%多聚甲醛對細(xì)胞進(jìn)行固定，經(jīng)PBS 洗滌3次后，3%的BSA 封閉30 min，并與 desmin一抗(1 ∶500) 4 ℃孵育過夜。次日，室溫下與二抗(1 ∶200)孵育2 h，隨后進(jìn)行 DAPI 染色10 min，PBS洗滌后即可在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6透射電子顯微鏡 收集不同處理組細(xì)胞，使用戊二醛 在4 ℃固定12 h，1%OsO4固定2 h后，梯度乙醇脫水，70%醋酸鈾染色6 h，乙醇脫水后環(huán)氧樹脂包埋3 h，并在60 ℃烘箱中放置48 h，使用超微切片機(jī)切片(NOVA, LKB, Sweden)。最后用鉛和鈾對樣品進(jìn)行染色，并用透射電子顯微鏡(HT7700)進(jìn)行觀察。

1.2.7Western blot 收集不同處理組的細(xì)胞，使用RIAP裂解液提取細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取胞核蛋白，經(jīng)BCA試劑盒蛋白定量后，通過SDS-PAGE凝膠電泳對蛋白樣品進(jìn)行分離后即轉(zhuǎn)移至乙醇活化后的PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST漂洗3次，每次10 min；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，1×TBST漂洗3次后，ECL顯影。蛋白條帶使用ImageJ進(jìn)行灰度分析, 以GAPDH為內(nèi)參基因計(jì)算各組蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.8RNA提取及RT-qPCR 取處理好的細(xì)胞，按照TRIzol提取說明書收集細(xì)胞總RNA，測定其濃度和純度后保存于-80 ℃。按Vazyme試劑盒R323-01反應(yīng)程序：42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 合成cDNA；產(chǎn)物立即用于實(shí)驗(yàn)或-20 ℃保存。取稀釋后cDNA按照real-time PCR說明書進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s。GAPDH 上游引物為：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物為:5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′；Nrf2 上游引物為:5′-CTCCTGGACGGGACTATTGA-3′，下游引物為:5′-TGGGTCTCCGTAAATGGAAG-3′；HO-1 上游引物為:5′-CACGCATATACCCGCTACCT-3′，下游引物為:5′-CCAGAGTGTTCATTCGAGCA-3′；GPX4上游引物為:5′-TGTGCATCCCGCGATGATT-3′，下游引物為:5′-CCCTGTACTTATCCAGGCAGA-3′。每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，運(yùn)用2-ΔΔCT的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 不同高糖刺激時(shí)間對足細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin、podocin及鐵死亡標(biāo)志物GPX4、PTGS2、ACSL4的影響Western blot 結(jié)果顯示，隨著高糖刺激時(shí)間的增加，在12 h時(shí)，desmin發(fā)生明顯上調(diào)(P<0.01)；足細(xì)胞特異性蛋白podocin與鐵死亡標(biāo)志物GPX4在24 h蛋白表達(dá)水平達(dá)到最低(P<0.01)；見Fig 1A, B。RT-qPCR結(jié)果顯示隨著高糖時(shí)間的增加，GPX4的mRNA水平在24 h顯著性下調(diào)(P<0.05)；ACSL4的mRNA水平在24 h發(fā)生明顯變化(P<0.01)，并在36 h有降低的趨勢；PTGS2的mRNA水平在12 h發(fā)生明顯上調(diào)且一直升高(P<0.01)；見Fig 1C。

2.2 EdU檢測高糖刺激不同時(shí)間足細(xì)胞的增殖情況結(jié)果如Fig 2所示，圖中綠色細(xì)胞為處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞表示總的細(xì)胞。染色結(jié)果顯示隨著高糖刺激時(shí)間的增加，足細(xì)胞的增殖速率在24 h明顯降低。

2.3 BBR對高糖損傷足細(xì)胞活性的影響Fig 3的CCK-8結(jié)果顯示，高糖刺激24 h后，足細(xì)胞活力明顯下降；與高糖模型組比較，小檗堿(30、60、90 μmol·L-1)差異均有顯著性，可以不同程度地增強(qiáng)足細(xì)胞的活力。

Fig 1 Relative expression of desmin, podocin, GPX4, ACSL4 and PTGS2 in HG-induced podocytes at different time points n=3)

2.4 BBR對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞標(biāo)志及鐵死亡相關(guān)信號通路蛋白的影響Podocin是維持足細(xì)胞功能完整性的重要蛋白。Nrf2/HO-1/GPX4信號通路與鐵死亡密切相關(guān)。Western blot結(jié)果表明，與正常對照組相比較，高糖組足細(xì)胞的podocin、GPX4的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與高糖模型組比較，BBR(60 μmol·L-1)能明顯增加podocin、Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的表達(dá)(P<0.01)(Fig 4)。RT-qPCR結(jié)果顯示，高糖組的PTGS2、ACSL4比正常對照組明顯升高(P<0.01)，GPX4明顯下調(diào)(P<0.01)，Nrf2、HO-1基本不變；與高糖組相比，小檗堿(60 μmol·L-1)可以明顯降低PTGS2和ACSL4的mRNA表達(dá)(P<0.01)，并且升高Nrf2、HO-1、GPX4的mRNA水平(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 2 Effect of podocyte proliferation by high glucose at different time points (×200, n=3)

Fig 3 Effect of BBR on viability of podocytes by high glucose at 24 h n=18)

如Fig 6激光共聚焦顯微鏡顯示，與正常對照組相比，desmin的熒光強(qiáng)度明顯升高，與高糖模型組相比，小檗堿(60 μmol·L-1)組可以降低desmin的熒光強(qiáng)度，緩解足細(xì)胞的損傷。

2.5 BBR對高糖刺激下足細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平及形態(tài)學(xué)的影響熒光倒置顯微鏡觀察不同組內(nèi)ROS含量變化的結(jié)果顯示，正常對照組中也有ROS的產(chǎn)生，但是含量較少，表明足細(xì)胞本身具有一定的ROS生成能力，高糖刺激后，細(xì)胞內(nèi)的ROS明顯增加(P<0.01)，小檗堿(60 μmol·L-1)組可以減弱高糖刺激下足細(xì)胞的ROS生成(P<0.01)，見Fig 7A，B。GSH檢測結(jié)果表明，高糖模型組的GSH水平比正常對照組低(P<0.01)；與高糖模型組相比，小檗堿(60 μmol·L-1)組則可以明顯上調(diào)GSH的水平 (P<0.05)，見Fig 7C。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，高糖組線粒體明顯變小伴膜密度增加，線粒體嵴減少。與高糖組相比，小檗堿(60 μmol·L-1)組能明顯改善線粒體的形態(tài)變化，見Fig 8。

Fig 4 Effect of BBR on protein expression of Nrf2, HO-1, GPX4 and podocin n=3)

Fig 5 Effect of BBR on mRNA expression of GPX4, PTGS2, ACSL4, Nrf2, HO-1 n=3)

Fig 6 Effect of BBR on positive expression of desmin (n=3)

3 討論

腎小球?yàn)V過屏障的破壞是糖尿病腎病進(jìn)展的主要途徑[8]。腎小球足細(xì)胞是高糖作用的靶細(xì)胞，足細(xì)胞數(shù)量的減少會造成腎小球?yàn)V過屏障破壞，進(jìn)而發(fā)展成腎小球硬化，腎功能衰竭等癥狀，因此對足細(xì)胞的死亡進(jìn)行干預(yù)治療對疾病的發(fā)生發(fā)展有重要意義。鐵死亡由Dixon等[3]研究Erastin殺死RAS突變得到腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，主要是細(xì)胞內(nèi)“鐵”依賴脂質(zhì)氧自由基異常增高、氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡而致。胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體(系統(tǒng)xc-)的紊亂會導(dǎo)致GPX4失活，脂質(zhì)氧化物不能經(jīng)過GPX4催化的谷胱甘肽還原酶反應(yīng)代謝，繼而發(fā)生類似Fenton反應(yīng)的方式氧化脂質(zhì)產(chǎn)生大量的活性氧[9]。本次實(shí)驗(yàn)檢測到高糖刺激下鐵死亡標(biāo)志蛋白GPX4的明顯下調(diào)以及ACSL4、PTGS2的明顯升高，透射電子顯微鏡下足細(xì)胞線粒體體積縮小，雙層膜密度增加，線粒體嵴減少或消失；足細(xì)胞內(nèi)GSH的耗竭，ROS水平明顯升高等現(xiàn)象，提示可能存在鐵死亡的現(xiàn)象。采用高糖持續(xù)性刺激足細(xì)胞，探究除凋亡和自噬之外足細(xì)胞的死亡方式，發(fā)現(xiàn)鐵死亡標(biāo)志物GPX4、PTGS2及ACSL4的表達(dá)量隨著高糖刺激時(shí)間的增加而變化，GPX4在24 h時(shí)發(fā)生顯著性降低，但是在36 h的時(shí)候表達(dá)恢復(fù)正常。原因可能在于自噬與鐵死亡是正向關(guān)系[3]，隨著高糖刺激時(shí)間的增加，在36 h時(shí)，自噬可能被抑制，因此GPX4增加，鐵死亡現(xiàn)象減少。

Fig 7 Effect of BBR on levels of oxidative stress in HG-induced podocytes n=3)

Fig 8 Effect of BBR on morphological changes of HG-induced podocytes (×20 000, n=3)

此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一種不同于凋亡和自噬以外的新的足細(xì)胞死亡方式。在高糖環(huán)境下，足細(xì)胞在24 h鐵死亡較為顯著，隨后鐵死亡逐漸減弱。結(jié)合課題組前期[2]已發(fā)表研究成果表明高糖刺激足細(xì)胞24 h出現(xiàn)一定程度的凋亡，隨著時(shí)間的推移，刺激36 h足細(xì)胞凋亡更為顯著。分析以上結(jié)果，提示在高糖刺激導(dǎo)致足細(xì)胞死亡的過程中，細(xì)胞并非傳統(tǒng)認(rèn)識中存在單一的死亡方式，而是多種死亡方式并存，區(qū)別在于不同時(shí)間段不同細(xì)胞死亡方式占據(jù)主導(dǎo)地位；另一方面也提示在通過靶向足細(xì)胞干預(yù)治療糖尿病腎病時(shí)，不同時(shí)間段需針對細(xì)胞發(fā)生的主要病理特征選擇有針對性的干預(yù)策略，以達(dá)到疾病的精準(zhǔn)治療目的。

文獻(xiàn)報(bào)道，體內(nèi)活性氧的明顯升高與糖尿病腎病密切相關(guān)，通過抗氧化藥物治療，從而逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對組織造成的損傷，阻止或延緩疾病的發(fā)生、發(fā)展[10]。當(dāng)足細(xì)胞受到持續(xù)性高糖刺激，會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，造成體內(nèi)活性氧的明顯升高，從而對機(jī)體造成損傷。此研究中證明隨著高糖刺激時(shí)間的增加，GPX4活性會發(fā)生明顯降低[11]，從而抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的清除，使細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積。Nrf2是啟動(dòng)內(nèi)源性抗氧化反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄因子[12]，受到外界活性氧等刺激下會發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激能力。Western blot結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，BBR可以明顯增加Nrf2的核轉(zhuǎn)移，激活下游大量的抗氧化酶基因如HO-1和GPX4等的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而減少足細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象。

綜上所述，BBR抑制足細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制可能與Nrf2/HO-1/GPX4信號通路有關(guān)，其詳細(xì)機(jī)制還需近一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過對Nrf2進(jìn)行小分子RNA干擾以及構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒,并設(shè)置鐵死亡抑制劑的方法，對BBR如何調(diào)控足細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制進(jìn)行蛋白和基因水平上更深層次的研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)完成于中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科藥物基因檢測實(shí)驗(yàn)室，向全體老師和同學(xué)們表示感謝。)