七氟醚預(yù)處理通過(guò)升高血漿脂聯(lián)素水平保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷

翟津津，孫一愷，劉彥宏，楊保仲，張彥清

(山西醫(yī)科大學(xué) 1.麻醉學(xué)院, 2.附屬第一醫(yī)院麻醉科,3.研究生處，山西 太原 030001)

心外科冠脈再通手術(shù)中，心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia-reperfusion,MI/R)是無(wú)法避免的環(huán)節(jié)，而MI/R損傷是引起術(shù)后病人心功能不全和心力衰竭的重要因素[1]。因此，如何預(yù)防和治療MI/R損傷就變得尤為重要。

大量研究表明，揮發(fā)性麻醉藥(七氟醚，異氟醚等)預(yù)處理和后處理可以減少M(fèi)I/R損傷[2-3]，然而其作用的分子機(jī)制尚未闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，小凹蛋白-3(caveolin-3，cav-3)在七氟醚心肌保護(hù)中發(fā)揮著重要作用[4]。cav-3可以和脂聯(lián)素受體直接結(jié)合，是脂聯(lián)素下游信號(hào)的關(guān)鍵分子[5]，脂聯(lián)素是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，大量數(shù)據(jù)表明脂聯(lián)素對(duì)心臟具有直接的保護(hù)作用[6-7]，循環(huán)脂聯(lián)素濃度與心血管疾病關(guān)系密切相關(guān)[8-9]。但脂聯(lián)素是否參與七氟醚預(yù)處理的心臟保護(hù)作用，目前尚不清楚。

本研究觀察脂聯(lián)素在七氟醚預(yù)處理的MI/R保護(hù)中的作用，有助于闡明七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用機(jī)制，可望為揮發(fā)性麻醉藥輔助心肌梗死患者血管再通手術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料動(dòng)物 健康成年SPF級(jí)雄性C57小鼠30只，鼠齡8-10周，體質(zhì)量(20-25) g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)SCXK(晉)2015-0001]。健康成年SPF雄性脂聯(lián)素基因敲除鼠，10只，鼠齡8-10周，體質(zhì)量(20-25) g，由上海南方模式生物科技有限公司提供。

主要藥品和試劑 七氟醚，規(guī)格：100 mL，購(gòu)自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；伊文思藍(lán)(Evans blue)，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司; 蘇木素-伊紅(HE) 染色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；小鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫雙抗夾心法試劑盒，購(gòu)自美國(guó)博士德生物工程有限公司(EK0596)。主要儀器 Harvard小動(dòng)物呼吸機(jī)，美國(guó)Harvard產(chǎn)品。Power PAC1000電泳儀、半干式轉(zhuǎn)印儀以及酶標(biāo)儀美國(guó)，均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型制備 七氟醚預(yù)處理：將單只小鼠放入麻醉罐中，向麻醉罐中通入2%七氟醚-93%氧氣-5% CO2，10 min后，通入95%氧氣-5%CO2，15 min 后換回2%七氟醚-93%氧氣-5% CO2，如此循環(huán)3次。對(duì)照處理組通入95%氧氣-5%CO275 min，預(yù)處理結(jié)束后，立即行MI/R造模手術(shù)或假手術(shù)。

MI/R模型建立：小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，直視下氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，在左側(cè)第四、五肋間行縱行切口，暴露心臟，左心耳下緣2 mm處穿針結(jié)扎。若看到左心室前壁以及心尖發(fā)白，表明結(jié)扎位置正確，則在缺血30 min后，松開(kāi)結(jié)扎線，使血流重新灌注，關(guān)閉胸腔，模型建立完畢。假手術(shù)模型只穿線不結(jié)扎，其余操作同MI/R組。

1.2.2超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 再灌注24 h后，行心臟超聲檢測(cè)前，用脫毛劑將小鼠胸部脫毛備皮。檢測(cè)時(shí)，將小鼠用異氟醚和氧氣混合吸入麻醉，置于恒溫檢測(cè)臺(tái)上，設(shè)置40 ℃，小鼠四肢用膠布固定。胸前和超聲探頭涂抹電容膠，進(jìn)行M型超聲檢測(cè)。檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室收縮末期內(nèi)徑和左心室舒張末期內(nèi)徑。

1.2.3心肌伊文思藍(lán)-TTC染色 再灌注24 h后，再次結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，將0.2 mL 2%伊文思藍(lán)從左側(cè)頸靜脈注入，觀察小鼠四肢和嘴唇發(fā)青時(shí)，迅速摘取心臟，生理鹽水沖洗干凈血漬，濾紙吸干多余水分，剪掉多余組織，放入-20 ℃冰箱冰凍10 min，取出，均勻切片1 mm，放入2%TTC溶液中，于37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，將切片置于4%多聚甲醛固定24 h，拍照。ImageJ圖像分析軟件分析梗死面積。

1.2.4心肌Tunel染色 心肌組織經(jīng)常規(guī)甲醛固定、石蠟包埋、切片，將石蠟切片常規(guī)脫蠟，采用末端脫氧核苷基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位平端標(biāo)記法染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。染色結(jié)束后，顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果以Tunel陽(yáng)性細(xì)胞核/總細(xì)胞核×100%表示。

1.2.5血漿脂聯(lián)素水平檢測(cè) 頸總動(dòng)脈采血，4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min后，取上清，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定脂聯(lián)素水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠術(shù)后24 h心臟功能比較在麻醉狀態(tài)測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)顯示：與假手術(shù)組相比，MI/R手術(shù)后模型組小鼠的射血分?jǐn)?shù)降低(Fig 1B,P<0.05)，左心室舒張末期內(nèi)徑(Fig 1C)以及收縮末期內(nèi)徑(Fig 1B)增加；與模型組比較，預(yù)處理組各項(xiàng)指標(biāo)均改善(Fig B，P<0.05)；相比預(yù)處理組，敲基因預(yù)處理組七氟醚預(yù)處理改善作用降低(Fig 1B-D)。

Fig 1 Heart function after MI/R improved by sevoflurane pretreatment

Fig 2 Area of cardiac infarction after MI/R reduced by sevoflurane pretreatment

2.2 各組小鼠術(shù)后24 h后心肌梗死面積比較術(shù)后24 h后，對(duì)各組小鼠進(jìn)行伊文思藍(lán)-TTC染色，結(jié)果如Fig 2A所示，相比于假手術(shù)組，模型組心臟缺血區(qū)出現(xiàn)明顯壞死區(qū)；對(duì)比于模型組，預(yù)處理組心梗面積減少(P<0.05)；與野生鼠組相比，敲基因七氟醚預(yù)處理減少心梗面積的作用減弱。

2.3 各組小鼠24 h后缺血區(qū)心肌組織細(xì)胞凋亡比較對(duì)各組小鼠缺血區(qū)心肌組織進(jìn)行Tunel染色，觀察七氟醚預(yù)處理對(duì)心肌MI/R后心肌細(xì)胞的影響。與假手術(shù)組相比，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.05)；相比于模型組，預(yù)處理組凋亡細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)，同時(shí)，敲基因預(yù)處理組七氟醚預(yù)處理降低凋亡細(xì)胞的作用減弱。

2.4 各組小鼠血漿脂聯(lián)素水平比較對(duì)各組小鼠血清脂聯(lián)素進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如Fig 4所示，相比于假手術(shù)組，模型組血漿脂聯(lián)素水平明顯降低(P<0.05)；七氟醚預(yù)處理顯著增加血漿脂聯(lián)素水平。

3 討論

七氟醚是臨床上應(yīng)用最為廣泛的一種吸入揮發(fā)性氣體麻醉藥，其預(yù)處理和后處理對(duì)心肌的保護(hù)作用已得到廣泛認(rèn)可[2-3]。Zhao等[10]發(fā)現(xiàn)，在cav-3基因敲除的小鼠，七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用降低。脂聯(lián)素是一種主要由脂肪組織分泌的細(xì)胞因子，具有直接的心肌保護(hù)作用[6, 11]。Wang等[5]發(fā)現(xiàn)，cav-3在脂聯(lián)素跨膜信號(hào)傳導(dǎo)和抗缺血心臟保護(hù)作用中起著至關(guān)重要的作用。Cav-3在七氟醚對(duì)MI/R的心肌保護(hù)作用和脂聯(lián)素心肌保護(hù)作用中均發(fā)揮關(guān)鍵性作用，提示七氟醚對(duì)MI/R的心肌保護(hù)可能是通過(guò)對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)水平的調(diào)控來(lái)發(fā)揮作用的。關(guān)于脂聯(lián)素是否參與七氟醚預(yù)處理的心肌保護(hù)作用目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)使用野生型和脂聯(lián)素基因敲除小鼠，探討脂聯(lián)素在七氟醚預(yù)處理心臟保護(hù)中發(fā)揮的作用。

Fig 3 Cardiomyocyte apoptosis after MI/R reduced by sevoflurane pretreatment

Fig 4 Plasma adiponectin levels increased by sevoflurane pretreatment

MI/R是心臟外科手術(shù)中不可避免的，血液再灌注會(huì)引起缺血心臟發(fā)生一系列病理生理改變，導(dǎo)致心臟功能發(fā)生劇烈改變[1]，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，模型組再灌注24 h后，心臟活動(dòng)功能受限，出現(xiàn)不可逆壞死區(qū)。揮發(fā)性氣體麻醉藥預(yù)處理和后處理在動(dòng)物和人體，已經(jīng)證實(shí)具有心臟保護(hù)功能[1-2, 12]；我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)了此結(jié)果，七氟醚預(yù)處理組，心肌凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，梗死面積縮小，心功能改善，結(jié)果與Mathur等[13]的報(bào)道相一致。大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，急性心梗后血中的脂聯(lián)素水平表達(dá)減少[14-15]，而血漿脂聯(lián)素的增加可改善心肌損傷[7, 16]，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。通過(guò)檢測(cè)各組小鼠血漿脂聯(lián)素水平發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組血漿脂聯(lián)素水平降低，同對(duì)照組相比，七氟醚預(yù)處理組血漿脂聯(lián)素水平增加。

一項(xiàng)回顧性Meta分析顯示，在包括糖尿病在內(nèi)的許多臨床病癥中，脂聯(lián)素與死亡率之間存在正相關(guān)而非預(yù)期的負(fù)相關(guān)關(guān)系[17-18]，對(duì)脂聯(lián)素作為治療心血管疾病潛在靶點(diǎn)提出質(zhì)疑，Scarale等對(duì)該爭(zhēng)議點(diǎn)相關(guān)的調(diào)節(jié)因子進(jìn)行總結(jié)后指出脂聯(lián)素與死亡率相矛盾的關(guān)系可能與利鈉肽有關(guān)。Asensio-López、Guo等報(bào)道發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍和替米沙坦可通過(guò)調(diào)節(jié)脂聯(lián)素系統(tǒng)發(fā)揮心臟保護(hù)保護(hù)作用；我們結(jié)果顯示，相比于七氟醚預(yù)處理組，敲基因預(yù)處理組七氟醚心臟保護(hù)作用不明顯，心肌凋亡細(xì)胞數(shù)目，梗死面積以及心功能無(wú)差異。提示七氟醚預(yù)處理心臟保護(hù)作用可能與脂聯(lián)素相關(guān)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，七氟醚預(yù)處理減輕心肌細(xì)胞凋亡、減少梗死面積、改善MI/R后心臟功能，這一心臟保護(hù)作用在脂聯(lián)素敲除小鼠中大部分消失，提示七氟醚預(yù)處理的MI/R保護(hù)作用可能和增加血漿脂聯(lián)素濃度有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)有望為臨床使用七氟醚改善血管再通術(shù)后患者心功能提供理論依據(jù)。