胰島素抵抗小鼠腸道菌群與FGF21的相關(guān)性研究

冉 菊，王 燁，張培培，韓 雪，沙小婷，王蟾月，李琳琳,3

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.菏澤學(xué)院藥學(xué)院，山東 菏澤 274000；3.新疆醫(yī)科大學(xué)省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指胰島素效應(yīng)器官或部位對胰島素生理作用不敏感的一種病理生理狀態(tài)，表現(xiàn)為肝臟、肌肉和脂肪組織等靶器官對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖代謝作用的敏感性降低，是2型糖尿病的重要發(fā)病機制之一[1]。

多項研究表明腸道菌群的變化與胰島素抵抗、2型糖尿病、代謝性疾病等密切相關(guān)，調(diào)節(jié)腸道菌群可以改善糖代謝和胰島素抵抗，提高胰島素的敏感性[2-3]。糞菌移植是指將健康人糞便中的功能菌群移植到患者腸道，重建新的腸道菌群，實現(xiàn)治療疾病的目的[4]。越來越多的研究表明，糞菌移植可逆轉(zhuǎn)腸道內(nèi)病理性的微生態(tài)環(huán)境，改善胰島素抵抗，如Vrieze等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，來自瘦供體的腸道菌群恢復(fù)了患代謝綜合征的肥胖患者的胰島素敏感性并增加其菌群多樣性；Zhang等[6]的研究顯示，糖耐量正常人糞菌液移植(fecal bacteria transplantation，F(xiàn)MT)可改善db/db2糖尿病模型小鼠的微生物組成以及血漿糖脂水平。

成纖維細(xì)胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)是一種新型的參與糖脂代謝調(diào)控的內(nèi)分泌因子。近年來，通過調(diào)節(jié)機體產(chǎn)生內(nèi)源性FGF21的表達(dá)來治療代謝性疾病的重要方法正受到越來越多的研究關(guān)注[7-8]。然而，目前關(guān)于腸道微生物與FGF21的相關(guān)性研究鮮有涉及，二者在改善胰島素抵抗作用上是否存在相關(guān)性或因果關(guān)系尚不明確。本研究以胰島素抵抗小鼠為研究對象，采用RT-qPCR技術(shù)對小鼠糞樣中的靶標(biāo)菌進(jìn)行絕對定量分析，同時檢測肝臟、結(jié)腸和回腸組織中FGF21及其受體的表達(dá)水平，探討FMT對胰島素抵抗小鼠腸道菌群的影響并評估腸道菌群與FGF21的相關(guān)性，為腸道細(xì)菌改善胰島素抵抗的機制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6J小鼠，♂，體質(zhì)量為(18-22)g，6-8周齡，購自南京常州卡文斯實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。

1.2 儀器實時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System，美國Applied-System)，普通PCR儀(C1000TMThermal Cycler，美國Bio-Rad)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad)，Nano Drop 2000核酸蛋白檢測儀(美國Thermo Scientific)

1.3 試劑TRIzolTMReagent(Thermo)，QIAamp DNA stool MiNi Kit試劑盒(凱杰)，2×Tag PCR Master Mix(TIANGEN，S7409)，實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，AJ61453A)，ddH2O(TIANGEN)，瓊脂糖凝膠粉(Sigma，WX804325V)，DNA純化試劑盒(TIANGEN)。

1.4 引物實驗所用的RNA引物、16Sr RNA基因特異性引物來源于genebank和引物設(shè)計(Tab 1、Tab 2)，引物由上海生工有限公司合成。

1.5 供體的選擇和供體糞樣的收集處理

1.5.1供體的納入標(biāo)準(zhǔn) 參考經(jīng)胃腸道進(jìn)行糞菌移植的Amsterdam規(guī)范[4，9]：① 年齡20-40周歲，3代直系血親均為哈薩克族的男性及女性，在其生活地區(qū)穩(wěn)定居住期超過10年，且具有長期健康的生活方式和良好的飲食習(xí)慣及規(guī)律的排便習(xí)慣；② 需要有健康的心理狀態(tài)；③ 既往無慢性病，如便秘或腹瀉腸預(yù)激綜合征、炎性腸病等，無自身免疫性疾病，無惡性疾病等；④ 供體3個月內(nèi)未服用抗生素、益生菌及其他微生態(tài)制劑；⑤ 血常規(guī)檢查，主要包括傳染性病原體(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等)、人類免疫缺陷病毒、EB病毒和巨細(xì)胞病毒檢查陰性；⑥ 糞便常規(guī)檢查，主要包括寄生蟲和腸道細(xì)菌檢查陰性。

1.5.2供體的排除標(biāo)準(zhǔn) 具體內(nèi)容如下：① 孕婦、哺乳期婦女；② 有精神病史，濫用藥物人群；③ 有手術(shù)及其他應(yīng)急情況人群；④ 近期服用抗菌素，甾體類藥物或微生態(tài)制劑人群；⑤ 有明顯肝腎功能損害，慢性腸胃功能紊亂，有腹瀉、膽道感染病史和腸炎等胃腸道疾病，血液系統(tǒng)或其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病人群；⑥ 需要胰島素治療或有酮酸中毒病史人群；⑦ 排除1型糖尿病、特殊類型糖尿病和妊娠糖尿病人群。

1.5.3糖耐量正常人入選標(biāo)準(zhǔn) 哈薩克族糖耐量正常人同時滿足供體的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，滿足空腹血糖(FBG)≤5.6 mmol·L-1且隨機血糖(GLU)≤11.1 mmol·L-1或經(jīng)口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)后2 h FBG≤7.8 mmol·L-1。

1.5.4樣本收集的倫理審核 供體糞便樣本的收集和動物實驗研究均通過了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(20130216-141)。

1.5.5糖耐量正常人糞菌液制備 參考課題組前期的方法[6]制備糞菌液。收集晨起哈薩克族糖耐量正常人新鮮糞便樣本約50 g，加入250 mL無菌生理鹽水，混勻后依次透過不銹鋼濾網(wǎng)(2.0、1.0、0.5和0.25 mm孔徑)，最后6 000 r·min-1、離心15 min，得到糞樣菌液。

Tab 1 Gene primer sequence

Tab 2 The 16Sr RNA gene specific primer sequence of target bacterias

1.6 動物建模、分組及樣本收集高脂飼料飼養(yǎng)建立小鼠IR模型。隨機選擇10只普通飼料飼養(yǎng)小鼠，即為空白對照(Control)組；并篩選出30只造模成功小鼠，按體質(zhì)量隨機分為胰島素抵抗(IR)組、IR+二甲雙胍(Metformin，Met)組、IR+糖耐量正常人糞菌液移植(FMT)組，每組10只。Control組小鼠給予正常飲食，IR、Met和FMT組小鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)。Control組和IR組給予0.9%氯化鈉溶液，Met組小鼠每天每只灌胃二甲雙胍280 mg·kg-1，F(xiàn)MT組小鼠每天每只灌胃糞樣菌液0.3 mL，各組給藥8周，于第8周末記錄小鼠體質(zhì)量和空腹血糖，收集糞樣以及肝臟、結(jié)腸和回腸組織，-80 ℃保存。

1.7 組織中FGF21及其受體mRNA的表達(dá)采用TRIzol試劑提取肝臟、結(jié)腸、回腸組織的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，RT-qPCR檢測FGF21、β-Klotho、FGFR1和FGFR4 mRNA表達(dá)量。靶基因和內(nèi)參基因的引物序列見Tab 1。

1.8 小鼠糞樣中靶標(biāo)菌的檢測

1.8.1細(xì)菌總DNA的提取及檢測 稱取糞樣0.18-0.20 g，嚴(yán)格按照QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒的說明書進(jìn)行操作，最后得到糞樣中細(xì)菌總DNA。使用Nano Drop 2000檢測總DNA的純度和濃度。

1.8.2靶標(biāo)菌的PCR擴增片段測序 根據(jù)Tab 2所示靶標(biāo)菌Bacteroides、B.sartorii、P.distasonis、M.schaedleri、R.gnavus的16Sr RNA gene可變區(qū)特異性引物進(jìn)行普通PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)條帶按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的說明書進(jìn)行切膠、回收，并送往上海生工進(jìn)行測序。

1.8.316Sr RNA基因?qū)崟r熒光定量PCR 用ddH2O將靶標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為10-1-10-8copies·μL-1的8個濃度梯度，并將最后1個濃度梯度設(shè)置為起始拷貝數(shù)(logSQ)=1，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將糞便樣本進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。根據(jù)熔解曲線和擴增曲線，分析PCR產(chǎn)物的特異性，并對結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和血糖的變化與Control組比較，IR組小鼠的體質(zhì)量和空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)均明顯升高(P<0.01)，給予Met和FMT干預(yù)后FBG均明顯降低(P<0.01)。但只在Met干預(yù)后體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)，見Fig 1。

2.2 各組織中FGF21及其受體mRNA表達(dá)量的檢測采用RT-qPCR檢測小鼠各組織中FGF21及其受體mRNA表達(dá)量，結(jié)果見Fig 2。肝臟中，與Control組比較，IR組中FGF21、β-Klotho、FGFR1及FGFR4 mRNA水平均降低(P<0.05)；Met、FMT干預(yù)后其mRNA表達(dá)均有所上升，F(xiàn)GF21 mRNA差異具有統(tǒng)計學(xué)意義?；啬c組織中、與Control組比較，IR組中FGF21、β-Klotho、FGFR1以及FGFR4 mRNA水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與IR組比較，Met組FGF21/FGFR1/FGFR4 mRNA表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；β-Klotho mRNA的水平也有上升的趨勢；在FMT干預(yù)后小鼠回腸組織中FGF21、β-Klotho 和FGFR1 mRNA表達(dá)均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)GFR4 mRNA的水平也有上升的趨勢。結(jié)腸中，與Control組比較，IR組中FGF21、β-Klotho、FGFR1及FGFR4 mRNA水平降低，其中FGF21，F(xiàn)GFR1 mRNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Met、FMT干預(yù)后上述mRNA表達(dá)均有上升的趨勢，其中FGF21，F(xiàn)GFR1 mRNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 1 Body mass and FBG of mice in each

2.3 靶標(biāo)菌的檢測結(jié)果

2.3.1靶標(biāo)菌普通PCR電泳結(jié)果 將PCR擴增產(chǎn)物測序所得序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，所測靶標(biāo)菌分別與Bacteroides、B.sartorii、P.distasonisATCC 8503、M.schaedleri、R.gnavus相似度最高。

2.3.2采用RT-qPCR對靶標(biāo)菌進(jìn)行定量分析 靶標(biāo)菌的16Sr RNA gene的RT-qPCR定量分析結(jié)果，見Fig 3。與Control組相比，IR組糞樣中Bacteroides、B.sartorii菌含量降低(P<0.01)，P.distasonis、M.schaedleri、R.gnavus菌含量升高(P<0.01，P<0.05)。與IR組比較，Met組和FMT組糞樣中Bacteroides、P.distasonis、B.sartorii菌含量升高(P<0.01)，M.schaedleri、R.gnavus菌含量降低。

2.4 FBG、腸道菌群與FGF21的相關(guān)性分析小鼠糞樣中的靶標(biāo)菌與FBG、FGF21做Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見Fig 4。FBG與Bacteroides(r=-0.634，P=0.01)、B.sartorii(r=-0.636，P=0.01)菌含量呈負(fù)相關(guān)，與M.schaedleri(r=0.511，P=0.011)、R.gnavus(r=0.498，P=0.013)菌含量呈正相關(guān)性。肝臟、結(jié)腸和回腸中FGF21的表達(dá)水平與FBG呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Bacteroides、B.sartorii菌含量呈正相關(guān)(P<0.05)，與P.distasonis、M.schaedleri、R.gnavus菌含量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

Fig 2 FGF21/β-Klotho /FGFR1/FGFR4 mRNA expressionlevels in mice tissues of each

3 討論

近年來，多項研究表明，腸道菌群與胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腸道微生物環(huán)境重塑可以改善代謝綜合征的發(fā)展[2,6]。Bacteroides菌作為下一代益生菌被廣泛研究，研究表明Bacteroides屬水平與T2DM呈負(fù)相關(guān)，對人類和實驗動物的葡萄糖代謝有益[10]。B.sartorii菌豐度在潰瘍性結(jié)腸炎患者中降低[11]，本研究顯示糞樣中Bacteroides、B.sartorii菌豐度在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下減少，Met和FMT干預(yù)后均顯著增加。劉宏偉課題組研究結(jié)果表明，P.distasonis菌通過生成琥珀酸和次級膽汁酸可顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠及ob/ob小鼠的肥胖、胰島素抵抗和脂代謝紊亂癥狀[12]。然而，在艱難梭菌感染模型小鼠腸道中P.distasonis菌豐度增加[13]，本研究顯示糞樣中P.distasonis菌豐度在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下升高，Met和FMT干預(yù)后進(jìn)一步升高。M.schaedleri菌被認(rèn)為是一種參與疾病發(fā)生發(fā)展的共生菌，在高脂喂養(yǎng)的db/db小鼠[14]中該菌豐度增高，表明在肥胖、2型糖尿病小鼠中該菌數(shù)量增加，可能與T2DM的發(fā)生相關(guān)。R.gnavus菌豐度增加通常與疾病活動度增加同時發(fā)生，在高脂喂養(yǎng)的小鼠腸道中R.gnavus菌豐度增加與炎癥呈正相關(guān)[15]。本研究結(jié)果與之一致，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，M.schaedleri、R.gnavus菌豐度增加，二甲雙胍和FMT干預(yù)后降低。

Fig 3 Level of target bacteria in fecalsamples of each group of

Fig 4 Correlation analysis of target bacteria, FBG and FGF21

FGF21是FGF家族中具有內(nèi)分泌激素功能的獨特成員，是能量穩(wěn)態(tài)和糖脂代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。FGF21需要共受體β-Klotho 與FGFR共同介導(dǎo)FGF21的信號傳遞，單獨不足以激活FGF21信號，只有兩者的共同參與才能使FGF21發(fā)揮作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)通過FMT干預(yù)胰島素抵抗小鼠，改變腸道菌群后，各組織中FGF21表達(dá)增加，且FGF21降糖效應(yīng)所需的受體β-Klotho/FGFR表達(dá)也增加了。本研究中在肝臟、結(jié)腸和回腸組織FGF21的表達(dá)水平與FBG呈負(fù)相關(guān)，與Bacteroides、B.sartorii菌含量呈正相關(guān)，與P.distasonis、M.schaedleri、R.gnavus菌含量呈負(fù)相關(guān)。有研究報道Bacteroides屬可調(diào)節(jié)膽汁酸代謝，如脆弱擬桿菌、普通擬桿菌[17]。在生酮飲食的小鼠中，膽汁酸可通過激活法尼酯受體從而上調(diào)原代肝細(xì)胞/小鼠肝臟中FGF21 mRNA和蛋白的表達(dá)[18]?？诜.distasonis菌增加小鼠體內(nèi)的石膽酸和熊去氧膽酸，但熊去氧膽酸抑制法尼酯受體活化[12]。本研究FGF21表達(dá)水平與Bacteroides菌呈正相關(guān)，與P.distasonis菌呈負(fù)相關(guān)，表明FGF21的表達(dá)水平與腸道菌群及其調(diào)節(jié)的代謝產(chǎn)物膽汁酸可能有關(guān)，但仍需進(jìn)一步驗證。

本研究結(jié)果表明，糖耐量正常人糞菌移植可以通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和增加FGF21的表達(dá)量來改善胰島素抵抗小鼠的血糖，腸道中Bacteroides、P.distasonis、B.sartorii菌含量增加、M.schaedleri、R.gnavus菌含量降低與FGF21的表達(dá)增加存在相關(guān)性，其后續(xù)相關(guān)機制有待進(jìn)一步研究。

(致謝:本實驗在新疆醫(yī)科大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心和動物實驗中心完成，感謝實驗室老師和同學(xué)們給予的幫助和指導(dǎo)!)