糖尿病視網(wǎng)膜病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

羅 云，葛文秀，孫桂波，孫曉波

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076)

國(guó)際糖尿病聯(lián)盟最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2019年全球約4.63億20-79歲成人患糖尿病，預(yù)計(jì)到2045年，糖尿病患者會(huì)達(dá)到7.002億；中國(guó)2019年患者數(shù)量為1.164億，給國(guó)家醫(yī)療保障體系及家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)帶來(lái)巨大的壓力。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，約有1/3的糖尿病患者晚期會(huì)出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)，是成年人致盲的原因之一[1]。近年研究表明，持續(xù)高血糖首先誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)病變，導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管疾病，如微血管瘤、出血、基底膜增厚[2]。進(jìn)一步致使血視網(wǎng)膜屏障通透性增加，導(dǎo)致毛細(xì)血管堵塞，引起視網(wǎng)膜缺血，引發(fā)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達(dá)，促進(jìn)血管新生，最終導(dǎo)致失明。雖然DR的病理形成過(guò)程得到了闡述，但是各個(gè)環(huán)節(jié)確切的病理機(jī)制仍不明確。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是疾病致病機(jī)理以及治療藥物的研究方式之一。本文根據(jù)致病誘因綜述近幾年來(lái)所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，以期為糖尿病視網(wǎng)膜病研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

目前研究報(bào)道最多的是嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠，小鼠具有與人類(lèi)遺傳、生理特性相似性，易于控制，繁殖迅速，常用于DR的研究；大鼠同樣具備價(jià)格低廉，容易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，也常用于糖尿病并發(fā)癥的研究。靈長(zhǎng)目動(dòng)物恒河猴等也用于建立DR動(dòng)物模型。狗的DR形態(tài)被認(rèn)為是與人類(lèi)最相似，豬與斑馬魚(yú)因其與人類(lèi)有相似的血管和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，也被用作DR實(shí)驗(yàn)研究。斑馬魚(yú)是糖尿病研究中一個(gè)新興的疾病模式動(dòng)物，它的葡萄糖代謝形成的途徑與人類(lèi)非常相似。同時(shí)，斑馬魚(yú)還可提供復(fù)雜的成像技術(shù)，并允許簡(jiǎn)單和快速的遺傳和藥理方法與高通量等優(yōu)點(diǎn)，因此也大量應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥動(dòng)物模型。

2 糖尿病視網(wǎng)膜病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

2.1 誘發(fā)型動(dòng)物模型

2.1.1鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ) 利用STZ建立DR模型較為普遍，最近一篇報(bào)道利用該模型證實(shí)了C反應(yīng)蛋白促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)退化和視網(wǎng)膜白斑淤積和無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管形成，進(jìn)而加速DR的形成[3]。梅茜鈺等[4]通過(guò)連續(xù)5 d腹腔注射STZ建立小鼠糖尿病視網(wǎng)膜病模型，并對(duì)夏枯草水提物進(jìn)行了保護(hù)作用研究。該模型建立簡(jiǎn)單易操作，應(yīng)用量最大，但是模型不太穩(wěn)定，見(jiàn)Tab 1。

2.1.2四氧嘧啶 連續(xù)一周給予白化病小鼠皮下注射四氧嘧啶水合物成功建立1型DR模型，并發(fā)現(xiàn)卡馬西平能夠顯著改善DR中視網(wǎng)膜損傷和神經(jīng)病變[5]。一次性給予C57BL/6小鼠四氧嘧啶成功實(shí)現(xiàn)小鼠新生血管顯著增加，二甲雙胍能夠通過(guò)抑制VEGF-A減少新生血管[6]。連續(xù)3 d給予Wistar大鼠腹腔注射四氧嘧啶水合物，成功建立2型DR模型，并研究了二氫槲皮素治療DR的藥理作用[7]。連續(xù)3次給予大鼠腹腔注射四氧嘧啶成功建立早期視網(wǎng)膜病變，并探討了視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)病理性改變[8]。該模型的主要特征見(jiàn)Tab 2。

2.1.3甲基乙二醛 甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)是葡萄糖代謝的中間產(chǎn)物，是糖尿病患者血液或組織中糖基化終產(chǎn)物的前體。Schlotterer等[9]給予雄性Wistar大鼠MG后，成功促使視網(wǎng)膜周細(xì)胞丟失，增加無(wú)毛細(xì)血管數(shù)量，減少雙極細(xì)胞功能等DR特征。研究者利用MG溶液培養(yǎng)斑馬魚(yú)胚胎，成功誘導(dǎo)斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜血管新生，加入VEGFR抑制劑抑制MG的促血管新生作用，證明該模型可用于DR血管新生研究[10]。目前，該模型應(yīng)用相對(duì)較少。其主要特征見(jiàn)Tab 3。

Tab 1 Major features of STZ-induced DR in experimental animal models

Tab 2 Major features of alloxan-induced DR in experimental animal models

Tab 4 Major features of hyperoxia-induced DR in experimental animal models

2.1.4高氧環(huán)境 由于成年嚙齒糖尿病動(dòng)物模型中不利于觀察視網(wǎng)膜血管新生，常利用高氧環(huán)境建立該病理模型。7日齡小鼠置于密閉的高氧環(huán)境連續(xù)5 d后，通過(guò)檢測(cè)視網(wǎng)膜血管新生、炎癥因子等成功構(gòu)建DR模型[11]。利用該模型，研究報(bào)道了Sema4D/PlexinB1信號(hào)通路參與了DR的形成[12]。該模型多用于探討DR中血管新生機(jī)理及其治療研究,其主要特征見(jiàn)Tab 4。

2.1.5高糖、高脂飲食 利用高脂、高糖飲食，Rithwick等[13]首先報(bào)道發(fā)現(xiàn)在高脂誘導(dǎo)的DR中視網(wǎng)膜功能性缺陷先于結(jié)構(gòu)性病變。建立小鼠早期DR模型，證明精氨酸酶2及tau蛋白磷酸化在糖尿病視網(wǎng)膜病形成中的重要作用[14-15]。研究還報(bào)道了二甲雙胍雖然能夠降低高脂誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量增加和血糖水平，但是不能改變視網(wǎng)膜光反應(yīng)及阻止視網(wǎng)膜血管新生[16]。Hammoum等[17]利用高脂成功誘導(dǎo)沙鼠2型糖尿病視網(wǎng)膜病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。陳鏡妃等[18]利用高脂飲食成功建立獼猴早期糖尿病視網(wǎng)膜病變，并證實(shí)獼猴視網(wǎng)膜VEGF和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF)的mRNA表達(dá)水平分別上調(diào)和下調(diào)。利用高糖培養(yǎng)斑馬魚(yú)胚胎6 d后，VEGFR和NO表達(dá)水平顯著增加，成功建立短期DR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[19]。Lim等[20]西方飲食飼養(yǎng)Ossabaw豬，建立早期DR小型豬模型。該模型應(yīng)用較多，且更貼合臨床,其主要特征見(jiàn)Tab 5。

2.2 基因型動(dòng)物模型

2.2.1db/db小鼠 在2014年就有研究表明，db/db小鼠可復(fù)制人類(lèi)糖尿病視網(wǎng)膜的神經(jīng)退行性過(guò)程的特征，因此該小鼠可作為一個(gè)合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)研究糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)病變的致病機(jī)理及發(fā)現(xiàn)治療藥物。利用該模型，羅云等[21]發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方渴絡(luò)欣具有減緩視網(wǎng)膜神經(jīng)退變的作用。此模型目前最大的不足之處是未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管滲漏及血管新生等現(xiàn)象，很難使得其與臨床DR的分級(jí)相對(duì)應(yīng)。

2.2.2Zucker肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty，ZDF) ZDF大鼠是一種肥胖型大鼠，大約30年前首次報(bào)道ZDF大鼠較對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞增多，同時(shí)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜厚度增加，提示其可作為糖尿病視網(wǎng)膜病藥物干預(yù)研究模型。近年來(lái)進(jìn)一步證實(shí)隨著年齡的增加，ZDF大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)出現(xiàn)退行性改變，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)厚度增加，但是細(xì)胞核的數(shù)量減少；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，GFAP表達(dá)水平增加等特征[22]。另外，Szabó等[23]發(fā)現(xiàn)32周齡ZDF大鼠出現(xiàn)了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，通過(guò)視錐蛋白表達(dá)模式的改變表明感光層外節(jié)段降解，這些特征與1型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變特征類(lèi)似。利用ZDF大鼠模型，研究者發(fā)現(xiàn)了外周血線粒體DNA損傷是DR形成的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物[24]。該模型可能由于其價(jià)格昂貴等因素，還未被普遍使用。

2.2.3斑馬魚(yú) 最近一項(xiàng)研究表明，斑馬魚(yú)胰腺轉(zhuǎn)錄因子pdx1突變體在2月齡時(shí)，具有明顯的糖尿病視網(wǎng)膜病血管表型；在12月齡時(shí)視網(wǎng)膜出現(xiàn)動(dòng)脈性血管減少、毛細(xì)血管彎曲、神經(jīng)病變以及光感受器受損等病理特征；表明該突變體可作為嚙齒動(dòng)物和其他哺乳動(dòng)物DR模型的補(bǔ)充，特別是對(duì)糖尿病微血管和視網(wǎng)膜神經(jīng)疾病相互作用的機(jī)制研究[25]。斑馬魚(yú)因其自身在影像學(xué)上的優(yōu)勢(shì)，未來(lái)其在DR模型中的研究將占有重要的位置。

Tab 5 Major features of high-glucose-high-fat diet-induced DR in experimental animal models

3 存在問(wèn)題及展望

糖尿病視網(wǎng)膜病，因目前仍無(wú)徹底根治的方法給糖尿病患者及其家庭帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力。盡管雷珠單抗和康柏西普類(lèi)藥物在臨床治療糖尿病黃斑變性已經(jīng)有很好的療效，但是DR患者數(shù)量仍然未得到顯著改善，未滿足臨床需求[26-27]。糖尿病視網(wǎng)膜病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在DR的發(fā)展及藥物治療研究中扮演至關(guān)重要的作用。DR是一種復(fù)雜的多因素影響的疾病，其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立相對(duì)困難。總體來(lái)看，近些年主要以STZ誘導(dǎo)較多，同時(shí)基因型小鼠因其血糖相對(duì)穩(wěn)定也運(yùn)用較多；ZDF大鼠能看出血管滲漏，但因其價(jià)格昂貴目前應(yīng)用還相對(duì)較少；斑馬魚(yú)雖然有其優(yōu)勢(shì)，但是由于與哺乳動(dòng)物相差較大只能作更為基礎(chǔ)的研究或前期藥物篩選。另外，由于模式動(dòng)物如斑馬魚(yú)，以及基因敲除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的興起，胰島切除、堿燒傷等傳統(tǒng)操作難、死亡率高等缺點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型近幾年已經(jīng)不再使用；恒河猴因其特殊飼養(yǎng)條件及成本高等，該模型也逐漸淘汰。

目前的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模只具有DR臨床某種或某幾種特征，如果要評(píng)價(jià)血管新生只能用新生鼠高氧誘導(dǎo)模型，這些不足導(dǎo)致無(wú)法與臨床糖網(wǎng)指南里的分級(jí)相對(duì)應(yīng)。因此未來(lái)DR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)該結(jié)合其中幾種特征，以建立與臨床更接近的疾病特征。例如，通過(guò)STZ與轉(zhuǎn)基因結(jié)合，或許可以建立既有神經(jīng)病變等特征還能看見(jiàn)視網(wǎng)膜血管新生。更為重要的是，DR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型主要集中于糖尿病早期階段的特征，而不具有晚期糖網(wǎng)的臨床特征；目前常用的模式動(dòng)物(大鼠、小鼠、斑馬魚(yú))眼睛沒(méi)有黃斑區(qū)，這些都限制了DR形成機(jī)制及藥物治療研究。

總之，雖然近些年通過(guò)不同方法構(gòu)建了DR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，但還是存在穩(wěn)定性不高、特點(diǎn)單一等問(wèn)題。因此，必須秉承動(dòng)物模型研究真實(shí)性、穩(wěn)定性、可行性、經(jīng)濟(jì)性等原則，繼續(xù)優(yōu)化模型的構(gòu)建方法，利用視網(wǎng)膜相干斷層掃描、視網(wǎng)膜造影等科研設(shè)備，利用表型與機(jī)制相結(jié)合的方式，加大模型的研發(fā)力度，構(gòu)建出更加貼近臨床實(shí)際的國(guó)際公認(rèn)的糖尿病視網(wǎng)膜病模型。