單環(huán)刺螠染色體核型分析

許星鴻 , 甘宏濤 劉統(tǒng)昊 孟 霄 丁子媛 徐國成 周麗青, 陸子俊葛春年

(1. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 連云港 222005; 3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 山東 青島 266071)

染色體作為遺傳物質(zhì)的載體和細(xì)胞功能的組織者, 是生物生長發(fā)育、遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ), 因此染色體及核型研究是遺傳學(xué)的重要基礎(chǔ)[1]。目前, 關(guān)于魚類[2]、甲殼類[3]和貝類[4]等水生動物的染色體研究已有較多報道。單環(huán)刺螠 (Urechis unicintus)隸屬螠蟲動物門螠綱無管螠目刺螠科, 俗稱海腸, 為我國沿海分布的唯一無管螠目物種[5]。其肉味鮮美, 富含人體必需氨基酸、不飽和脂肪酸和具有藥用價值的提取物,被稱為裸體海參, 并能對改善海洋環(huán)境污染起到積極作用, 具有較大的開發(fā)利用前景[6-7]。近年來由于過度捕撈, 單環(huán)刺螠天然資源量日益減少, 亟待開展人工繁育工作。染色體研究是遺傳育種工作的基礎(chǔ), 但目前我國對單環(huán)刺螠的研究主要集中在形態(tài)特征[5]、生態(tài)環(huán)境[8]、繁殖發(fā)育[9]與增養(yǎng)殖技術(shù)[10]等方面, 關(guān)于單環(huán)刺螠的遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究相對薄弱, 僅見不同地理種群遺傳多樣性分析和微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)[11-12], 迄今尚未見有關(guān)單環(huán)刺螠染色體的文獻(xiàn)報道。本研究探索了單環(huán)刺螠染色體制備方法, 并進(jìn)行了核型分析, 以期為相關(guān)細(xì)胞遺傳學(xué)和育種研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用單環(huán)刺螠體長(10.1±3.2) cm、體質(zhì)量(15.4±3.5) g, 于2019 年4 月購自江蘇省連云港市海寧路水產(chǎn)品市場, 胚胎和幼體由本課題組人工繁育所得。取成熟精卵進(jìn)行人工授精, 受精卵洗卵后轉(zhuǎn)入水族缸中, 水溫15～16 ℃, 鹽度25, 自然光照, 連續(xù)充氣, 孵化后日投喂2 次金藻(Isochrysis galbana)。胚胎和幼體取樣時間分別為受精約18 h(膜內(nèi)擔(dān)輪幼蟲)、孵化后2 d(擔(dān)輪幼蟲)和孵化后12 d(體節(jié)幼蟲)。

1.2 方法

1.2.1 成體組織制片

前處理: 將單環(huán)刺螠成體隨機(jī)分兩組, 一組按10 μg/g 體質(zhì)量向體腔一次性注射植物血球凝集素(phytohaemagglutinin, PHA), 12 h 后用秋水仙素處理。另一組不注射PHA, 直接用秋水仙素處理。秋水仙素處理分別采用浸泡法和注射法進(jìn)行對比, 濃度為0.4 和0.6 g/L, 處理時間設(shè)置為6、8、10、12和14 h, 以篩選出秋水仙素處理的適宜方法。各組處理溫度均為20℃。解剖取呼吸腸和體腔液, 呼吸腸剪碎, 200 目篩絹過濾至離心管中; 體腔液于4℃以1 000 r/min 離心5 min, 收集沉淀細(xì)胞。

低滲: 低滲液用0.075 mol/L KCl 溶液, 低滲時間分別為30、45、60 和75 min。

固定: 將含有材料的低滲液于 4℃以1 000 r/min離心5 min, 棄上清。加入5 mL 預(yù)冷的卡諾氏固定液(甲醇: 冰醋酸=3: 1), 輕輕吹打混勻, 4℃固定15 min后, 4℃以1 000 r/min 離心5 min, 棄上清。更換新固定液3 次, 使固定總時間達(dá)1 h。

解離: 向沉淀中加入2 mL 預(yù)冷50%冰乙酸, 吹打混勻, 解離5 min。

滴片: 分別采用熱滴片法和冷滴片法, 將細(xì)胞懸液滴在載玻片上, 滴片高度1～2 m, 自然風(fēng)干。

染色: 用10%Giemsa 染液染色20～30 min, 用蒸餾水沖洗并晾干。

1.2.2 胚胎和幼體制片

分別取胚胎(膜內(nèi)擔(dān)輪幼蟲)和幼體(擔(dān)輪幼蟲或體節(jié)幼蟲)于含0.4 g/L 秋水仙素的海水中培養(yǎng)12 h,于4℃以1 000 r/min 離心5 min, 棄上清, 取沉淀。低滲、固定、解離等其他步驟同成體材料。

1.3 染色體計數(shù)及核型分析

染色體標(biāo)本用尼康(ECLIPSE 90i)光學(xué)顯微鏡觀察,拍照。選取100 個分散良好的染色體分裂相, 統(tǒng)計染色體數(shù)目, 根據(jù)頻率分布確定染色體數(shù)目。選取10 個數(shù)目完整、形態(tài)清晰的中期分裂相, 采用Adobe Photoshop CC 2018 圖像處理軟件測量染色體長度, 并根據(jù)Levan 等[13]的分類標(biāo)準(zhǔn)計算單環(huán)刺螠染色體的相對長度以及臂比等基本參數(shù), 進(jìn)行染色體配對和分類。

2 結(jié)果

2.1 單環(huán)刺染色體制片材料和方法的比較

對分別以胚胎、幼體以及成體體腔細(xì)胞和呼吸腸為材料進(jìn)行染色體的制片效果進(jìn)行比較, 結(jié)果表明: 以成體體腔細(xì)胞、胚胎和幼體為材料均能觀察到中期分裂相, 以呼吸腸為材料獲得分裂相極少。以成體體腔細(xì)胞和幼體為材料得到的分裂相分別為(5.92±1.03)%和(5.67±0.64)%, 兩者差異不顯著(P>0.05)。以胚胎為材料得到的有絲分裂相雖然較多, 但制片雜質(zhì)很多嚴(yán)重影響觀察。

秋水仙素處理以濃度0.4 g/L、浸泡12 h 得到的分裂相較清晰, PHA 對增加分裂相無顯著影響。采用0.075 mol/L KCl 處理 45 min 低滲的染色體分散度較好, 熱滴片法制片效果優(yōu)于冷滴片法。

2.2 單環(huán)刺染色體的形態(tài)

采用單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞制備染色體標(biāo)本, 經(jīng)Giemsa 染色后, 顯微鏡下呈現(xiàn)清晰的血細(xì)胞有絲分裂中期的分裂相, 多數(shù)染色體呈X 型, 為中部或亞中部著絲粒染色體(圖1a)。體腔中精母細(xì)胞分裂相可見處于減數(shù)分裂細(xì)線期的染色體, 呈長絲狀相互連接或纏繞(圖1b), 聯(lián)會后的二價體則呈短棒狀(圖1c)。

圖1 單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞分裂相(Giemsa 染色)Fig. 1 Division phase of chromosomes of coelomocytes in Urechis unicinctus (Giemsa staining)

2.3 單環(huán)刺染色體數(shù)目

選取單環(huán)刺螠染色體分裂相共100 個, 其中65 個為體腔血細(xì)胞有絲分裂中期, 35 個為精母細(xì)胞減數(shù)分裂二價體。對染色體數(shù)目及出現(xiàn)的頻率統(tǒng)計結(jié)果見表1。單環(huán)刺螠染色體眾數(shù)為146, 出現(xiàn)頻率為64.62%, 體腔精母細(xì)胞二價體眾數(shù)為73, 占減數(shù)分裂細(xì)胞個數(shù)的57.14%。結(jié)果顯示, 單環(huán)刺螠二倍體染色體數(shù)目為2N=146。

表1 單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞染色體和二價體數(shù)目出現(xiàn)頻率Tab. 1 Frequency of chromosomes and bivalent number in Urechis unicinctus

2.4 單環(huán)刺染色體核型分析

根據(jù) Levan 等[13]的染色體分類方法, 單環(huán)刺螠染色體的核型數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表2。單環(huán)刺螠73 對染色體可分為4組(圖2), 核型圖中染色體按M(metacentric chromosome, M)、SM(submetacentric chromosome,SM)、ST(acrocentric chromosome, ST)、T(telocentric chromosome, T)的順序分類排列, 同一類型的染色體按相對長度遞減的順序排列。M 組(1～29 對)共有58條染色體, 臂比值為1.0～1.7, 著絲粒清晰可辨, 為中部著絲粒染色體; SM 組(30～42 對)共有26 條染色體, 臂比值為1.7～3.0, 為亞中部著絲粒染色體; ST組(43～52 對)共有20 條染色體, 臂比值為3.0～7.0, 為亞端部著絲粒染色體; T 組(53～73 對)共有42 條染色體, 臂比值>7.0, 為端部著絲粒染色體。單環(huán)刺螠核型公式為 2N=58M+26SM+20ST+42T, 染色體臂數(shù)NF=250, 未發(fā)現(xiàn)異形性染色體和隨體。

表2 單環(huán)刺螠染色體核型數(shù)據(jù)Tab. 2 Karyotype data on chromosomes in Urechis unicinctus (n = 10)

3 討論

3.1 單環(huán)刺染色體制備

選用適宜材料是制作動物染色體標(biāo)本的關(guān)鍵。魚類染色體制片一般采用頭腎[2,14], 甲殼類發(fā)育期的精巢可以獲得較多的中期分裂相[15-16], 鰓和外套膜是貝類染色體制片常用的材料[4,17]。單環(huán)刺螠機(jī)體結(jié)構(gòu)簡單, 僅由體壁、消化道和腎管組成, 其消化道中有一段壁薄、彈性大, 具有呼吸作用, 稱為呼吸腸[5]。單環(huán)刺螠生殖腺體積微小, 通過肌束附著于后腸壁和體壁上, 產(chǎn)生的生殖細(xì)胞放散于體腔中,進(jìn)一步成熟后收集于腎管中[9,18]。本研究嘗試了用單環(huán)刺螠的胚胎、幼體、成體的體腔細(xì)胞和呼吸腸等材料進(jìn)行染色體制片, 結(jié)果顯示用呼吸腸難以獲得分裂相, 可能與其分裂指數(shù)不高有關(guān)。譚杰等[19]以刺參(Apostichopus japonicus)原腸后期胚胎為材料獲得了效果良好的中期分裂相染色體, 但本研究以單環(huán)刺螠后期胚胎為材料雖然有絲分裂相較多, 但由于其為間黃卵, 卵黃含量顯著多于刺參的均黃卵, 因此制片雜質(zhì)較多而影響觀察效果。星蟲類機(jī)體組成與單環(huán)刺螠相近, 取其體腔液細(xì)胞制片染色體清晰可見[20]。本研究以單環(huán)刺螠成體體腔細(xì)胞和幼體為材料均能觀察到中期分裂相, 但幼體材料受繁殖季節(jié)的限制, 獲取幼體的人工繁育手段亦較繁瑣, 因此單環(huán)刺螠染色體制片以采用成體體腔細(xì)胞更方便。取單環(huán)刺螠生長期雄體的體腔液既可以得到體腔血細(xì)胞的有絲分裂相, 又可以觀察到體腔中精母細(xì)胞的減數(shù)分裂。

續(xù)表

圖2 單環(huán)刺螠染色體核型Fig. 2 Karyotype of Urechis unicinctus

PHA 作為有絲分裂原可以促進(jìn)細(xì)胞分裂, 常用于魚類染色體研究[14], 在刺參[19]、鋸緣青蟹(Scylla serrata)[21]和貝類[22]中也有良好效果。而本研究中PHA 對于增加單環(huán)刺螠分裂相沒有明顯的促進(jìn)作用。秋水仙素能抑制微管聚合、紡錘體形成, 從而阻止染色體分離, 使細(xì)胞停滯于分裂中期, 利于觀察染色體。用秋水仙素處理成體多采用注射法, 取材為胚胎、幼體或離體組織時用浸泡法[23-24]。在本研究中, 單環(huán)刺螠成體注射秋水仙素的制片效果不如浸泡法, 可能與其體形細(xì)長、注射部位作用范圍受局限有關(guān)。秋水仙素的使用劑量和處理時間是影響染色體制片效果的重要因素[17]。以往文獻(xiàn)中用秋水仙素浸泡制片材料的濃度在0.1 g/L～1 g/L 之間, 浸泡時間為40 min～24 h, 秋水仙素濃度與處理時間因所用材料而不同。本實驗篩選得出單環(huán)刺螠適宜的秋水仙素處理濃度為0.4 g/L、浸泡12 h, 與裸體方格星蟲(Sipunculus nudus)一致[25]。當(dāng)秋水仙素用量過大或作用時間過長, 會導(dǎo)致染色體凝縮過度, 反之, 當(dāng)秋水仙素用量不足或者作用時間過短, 則會導(dǎo)致分裂相少且染色體細(xì)長, 相互連接而影響觀察。

3.2 單環(huán)刺染色體數(shù)目及核型分析

螠蟲動物全世界僅約140 余種, 最初作為螠蟲綱, 與星蟲類、沙蠶等同屬環(huán)節(jié)動物門, 后來被單列為螠蟲動物門[26]。根據(jù)李石磊等[27]對線粒體基因比較及系統(tǒng)發(fā)育分析得出, 螠蟲類和星蟲類、多毛類聚為一進(jìn)化分枝, 表明其親緣關(guān)系接近。星蟲動物染色體數(shù)目2N介于18～34, 多為20 條[20]。中國沿海常見的可口革囊星蟲(Phasolosma esculenta) 核型公式為2N=20=4M+10SM+6ST[28], 裸體方格星蟲染色體數(shù)目多于其他星蟲(2N=34), 核型公式為2N=26M+8SM[25]。目前已知的多毛類染色體數(shù)目2N為18～38 條, 如多齒圍沙蠶(Perinereis nuntia)核型為2N=28=4M+10SM[29],Nephtys incisa核型為2N=38=4M+3SM+12ST[30]。本研究中單環(huán)刺螠具有146 條染色體(2N=58M+26SM+20ST+42T), 明顯多于星蟲類和多毛類。李樹深[31]認(rèn)為在特定分類階元中, 具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的是特化類群, 而具有較多端部著絲粒染色體的為原始種群。本研究發(fā)現(xiàn)單環(huán)刺螠具有58 條中部著絲粒染色體和26 條亞中部著絲粒染色體, 占染色體總數(shù)的 57.53%, 表明其為特化種類。根據(jù)Admed[32]提出M 和SM 染色體可使染色體組型穩(wěn)定,而T 和ST 染色體比較多變的觀點, 表明單環(huán)刺螠有比較穩(wěn)定的染色體組型。

環(huán)節(jié)動物門蛭綱和寡毛綱動物的染色體數(shù)量2N介于16～32[33-34]。在軟體動物門中, 雙殼類染色體數(shù)量2N為14～48 條, 其中約40%具有38 條染色體[35];腹足類染色體數(shù)量2N為14～72 條; 頭足類染色體數(shù)量2N相對較多, 如金烏賊(Sepia esculenta)[36]、長槍烏賊(Heterololigo bleekeri)和萊氏擬烏賊(Sepioteuthis lessoniana)[37]等都含有92 條染色體。與軟體動物門其他類群相比, 頭足類在形態(tài)結(jié)構(gòu)上具有高度進(jìn)化的特征[38]。節(jié)肢動物門甲殼類染色體數(shù)目2N隨種類不同在64～376 之間變化較大[39], 如鋸緣青蟹98條[21]、日本114 條[15]、克氏原螯蝦188 條[16]。Murofuchi[40]認(rèn)為在節(jié)肢動物門十足類中, 染色體數(shù)目多的類型較為進(jìn)化。棘皮動物門是無脊椎動物中最高等的一個類群, 其染色體數(shù)目卻相對較少, 如刺參染色體數(shù)目2N為46 條[19]、馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus) 為42 條[41]。本研究結(jié)果表明,單環(huán)刺螠染色體數(shù)目和染色體組型分別為2N=146和2N=58M+26SM+20ST+42T, 在無脊椎動物中屬于染色體數(shù)目較多的類群, 處于較特殊的進(jìn)化地位。

迄今尚無其他螠蟲動物的染色體核型研究報道,很難從綱目科屬種的層次上探討其系統(tǒng)演化關(guān)系,因此需要研究更多的螠蟲動物核型及帶型, 并結(jié)合熒光原位雜交等分子生物學(xué)技術(shù)手段, 以深入進(jìn)行螠蟲動物的系統(tǒng)分類和進(jìn)化研究。

4 結(jié)論

單環(huán)刺蛻染色體數(shù)目為 2N=146,核型公式為2N=58M+26SM+20ST+42T，染色體臂數(shù)NF=250，未發(fā)現(xiàn)異形性染色體和隨體，在無脊椎動物中處于較特殊的進(jìn)化地位，核型數(shù)據(jù)可為相關(guān)細(xì)胞遺傳和育種研究提供基礎(chǔ)。