鹽脅迫下蠶豆不同組織實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

樊有存，張紅巖，韓 芊，楊旭升，武學霞，劉玉皎

(1.青海大學，青海 西寧 810016； 2.青海大學農(nóng)林科學院，青海 西寧 810016；3.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海大學，青海 西寧 810016；4.青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧 810016)

實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR，RT-qPCR)是當前研究基因表達水平的主要技術手段[1]。為了準確檢測目的基因的表達情況，一般會選用一個或多個表達相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因進行校正[2-3]。目前，植物種常用的內(nèi)參基因有α/β微管蛋白基因(TUA，TUB)、參與胞質(zhì)核糖體小亞基及翻譯因子(18SrRNA)、肌動蛋白基因(ACT)、蛋白合成中的翻譯延伸因子(GAPA)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(EF1a)及蛋白質(zhì)加工代謝相關的親環(huán)蛋白(CYP)等[4-7]。但實際上，在不同的細胞、組織、生理階段，目的基因的表達量可能存在差異[8]，亦會因所選用的內(nèi)參基因的不同而影響實驗結果。近年來，關于豆科植物內(nèi)參基因的報道有很多。王驍?shù)萚9]篩選出CYP2和GAPDH為大豆籽粒發(fā)育過程中表達最為穩(wěn)定的基因，UKN2和TUB4為胚軸中表達穩(wěn)定的基因，而ACT2和CYP2為子葉中表達穩(wěn)定的基因，逆境脅迫下UKN2、TUB4、EF1A較穩(wěn)定。付媛媛等[10]發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿在各種脅迫(激素、鹽脅迫、干旱和暗條件)下不同組織中表達量相對比較穩(wěn)定的內(nèi)參基因為MSC27、18SrRNA、EF-La和Actin2。

土壤鹽漬化已成為影響植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要因素之一，中國約20%耕地面積受到土壤鹽漬化的影響[11]。蠶豆(ViciafabaL.)作為中國重要的食用豆類作物之一，具有糧、飼、菜、肥、藥兼用和深加工增值等特點,且蠶豆能適應冷涼氣候，并有較強的抗鹽堿能力，同時還有“生物固氮之王”的譽稱，是種植業(yè)結構調(diào)整中重要的養(yǎng)地作物和間套作物[12-14]。為了充分發(fā)揮蠶豆的多元化功能及生態(tài)價值，其種植區(qū)域不斷擴大，而土壤鹽漬化將成為制約蠶豆生產(chǎn)的主要因素之一。

篩選蠶豆在鹽脅迫下的合適內(nèi)參基因是研究耐鹽基因表達特性的必要前提，目前，有關蠶豆鹽脅迫方面的研究主要集中在鹽脅迫對蠶豆生長、生理響應及提高蠶豆耐鹽性的理化方法等[15-16]方面。Gutierrez 等[17]以不同的組織、基因型和接種幾種常見病原體的蠶豆為試驗材料，篩選出ACT1、CYP2和ELF1A可作為相對合適的內(nèi)參基因，而蠶豆在鹽脅迫下不同組織中適宜的內(nèi)參基因篩選方面的研究尚未報道。本研究以不同氯化鈉濃度脅迫下的蠶豆葉、莖和根為材料，篩選6個植物常用候選內(nèi)參基因(ELF1A、ACT2、GAPA、18SrRNA、TUA和CYP2)，利用Ct值分析及內(nèi)參基因分析軟件(GeNorm、NormFider和BestKeeper)分析評估候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，由此篩選出蠶豆鹽脅迫下不同組織中能穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，為以后研究蠶豆耐鹽功能基因提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(1)材料培養(yǎng)。本試驗以篩選獲得的耐鹽蠶豆種質(zhì)2014-04為材料(青海大學農(nóng)林科學院蠶豆課題組提供)。用5%NaClO消毒處理種子，利用植物光照培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)10 d后選擇長勢一致的幼苗移至裝有等量石英砂的塑料盆中并放置培養(yǎng)箱 (25 ℃/18 ℃)(白天/夜晚)，相對濕度(70±5)%，光照周期16 h/8 h(白天/夜晚)，光照強度250 μmol/m2/s[18]，待完全長出真葉后，分別以0、50、100、150 mmol/L氯化鈉溶液于每天固定時間對蠶豆幼苗進行脅迫處理，培養(yǎng)7 d后對各濃度處理下蠶豆幼苗的根、莖和葉進行取樣并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)試劑及儀器。試劑：植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)；Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)酶(TaKaRa)。儀器設備：梯度PCR儀(Veriti SimpliAmp ProFlex 96，ABI)、低溫高速離心機(Centrifuge 5430 R，Eppendorf )、超微量核酸蛋白測定儀(Implen NP80 Mobile，Implen)、實時熒光定量PCR儀(LightCycler?480，Roche)等。

1.2 試驗方法

(1)RNA提取及cDNA合成。取50～100 mg蠶豆組織，利用天根植物總RNA提取試劑提取總RNA(RNA用DNase處理去除基因組DNA污染)；利用超微量核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度、純度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用質(zhì)量合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)合成引物及RT-qPCR分析。試驗選用的ACT2、18SrRNA、TUA、GAPA、CYP2和ELF1A六個候選內(nèi)參基因[17,19]來源于已發(fā)表的蠶豆候選內(nèi)參基因及其近緣植物中不同組織、不同非生物脅迫下篩選出的相對表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因(表 1)。引物由天津金唯智生物科技有限公司合成。利用實時熒光定量PCR儀LightCycler?480，采用TB Green Ⅱ試劑盒進行RT-qPCR分析。程序設定為95 ℃預變性30 s，1個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；95 ℃，5 s，60 ℃，1 min，進行溶解曲線分析；50 ℃降溫30 s，實驗設定3個重復。

表1候選內(nèi)參基因RT-qPCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences of candidate reference genes

(3)數(shù)據(jù)處理與分析。分別利用GeNorm、NormFider和Bestkeeper軟件分析候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，篩選出在鹽脅迫下蠶豆不同組織中適宜的內(nèi)參基因。GeNorm和NormFider軟件的計算原理相似，都需將原始Ct值轉(zhuǎn)換為相對表達量(Q=2-ΔΔCt)后計算出穩(wěn)定系數(shù)M值，并通過M值來評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。一般默認閾值M=1.5，當M>1.5時，基因不穩(wěn)定；當M<1.5時,可以考慮作為內(nèi)參基因。且M值越小，基因的穩(wěn)定性越高，反之越低。GeNorm軟件亦可通過變異系數(shù)V值來確定適宜內(nèi)參基因的數(shù)目，當Vn/Vn+1<0.15時，表明有n個內(nèi)參基因即可滿足實驗要求。BestKeeper軟件則直接對原始Ct值進行計算，通過計算的標準偏差(SD)、相關系數(shù)(r)及變異系數(shù)(CV)來選擇表達穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因。其中r值越大，CV和SD就越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性就越差；而當SD>1時，表示該內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定[20]。

2 結果與分析

2.1蠶豆樣品總RNA的提取及檢測利用植物總RNA提取試劑提取在不同濃度NaCl處理過的蠶豆幼苗的葉、莖和根的總RNA?？俁NA濃度檢測結果顯示：A260/A280為2.138～2.275 (表2)，且葉片總RNA濃度在1 000 ng/μL左右，根與莖的總RNA濃度為303.12～650.84 ng/μL，表明總RNA的質(zhì)量較好；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測蠶豆幼苗葉、莖和根分別在0 mmoL/L、50 mmoL/L、100 mmoL/L和150 mmoL/L NaCl脅迫下的總RNA結果顯示 (圖1)，28SrRNA、18SrRNA的條帶清晰明亮， 5SrRNA條帶較暗，這說明所提取的RNA未降解，完整性較好，可用于后續(xù)試驗。

表2不同鹽濃度下蠶豆不同組織的總RNA質(zhì)量和純度檢測Tab.2 Total mass of RNA and purity testing of faba bean tissues under the different concentrations of NaCl

圖1 蠶豆不同組織的總RNA電泳檢測結果Fig.1 Electrophoresis results of total RNA in the different tissues of faba bean

2.2內(nèi)參基因的特異性分析圖2為1%瓊脂糖溶液凝膠電泳檢測候選內(nèi)參基因普通PCR擴增產(chǎn)物的結果，圖中1、2、3、4、5、6 分別為TUA、 18SrRNA、CYP2、ELF1A、GAPA和ACT2 六個候選內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的電泳條帶，均為單一條帶，無引物二聚體和非特異性條帶，且產(chǎn)物大小均為100～250 bp。在此基礎上，利用RT-qPCR技術驗證6對引物，結果顯示候選內(nèi)參基因的溶解曲線都表現(xiàn)為單一信號峰(圖3)。以上分析結果表明，各候選內(nèi)參基因的引物特異性較好，可用于后期分析。

圖2 6對引物在鹽脅迫下蠶豆不同組織PCR電泳檢測Fig.2 PCR analysis with 6 pairs of primers in the different tissues of faba bean under the salt stress

圖3 鹽脅迫下蠶豆不同組織中6個內(nèi)參基因 RT-qPCR 溶解曲線Fig.3 RT-qPCR dissolution curves of 6 reference genes in the different tissues of faba bean under the salt stress

2.3 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

圖4 六個候選內(nèi)參基因在鹽脅迫下蠶豆不同組織中的表達豐度Fig.4 Abundance of expressions of 6 candidate reference genes in the different tissues of faba bean under the salt stress

(1)候選內(nèi)參基因表達豐度分析。內(nèi)參基因的Ct值是衡量某一基因表達量的主要指標，Ct值越大,基因表達量越低；反之越高[20]。本試驗所篩選的六個候選內(nèi)參基因在蠶豆樣品中表達豐度較高，Ct值在10～35(圖4)。其中ELF1A基因Ct值范圍為10.85～12.89，在根、莖、葉中表達量最高；而TUA基因Ct值范圍為29.47～35.73，在根、莖、葉中的表達量最低。ELF1A、ACT2及18SrRNA三個基因在根莖葉中的表達量較穩(wěn)定，而GAPA基因在根中表達量較低，在莖和葉片中的表達量較高。

(2)GeNorm軟件分析結果。GeNorm軟件分析結果顯示(圖5)，鹽脅迫下蠶豆不同組織中六個候選內(nèi)參基因平均表達穩(wěn)定系數(shù)M值均小于1.5。葉中候選內(nèi)參基因的平均表達穩(wěn)定性為ACT2>18SrRNA>GAPA>ELF1A>CYP2>TUA；莖中候選內(nèi)參基因的平均表達穩(wěn)定性為CYP2>ACT2>GAPA>ELF1A>18SrRNA>TUA；根中候選內(nèi)參基因的平均表達穩(wěn)定性為CYP2>ELF1A>18SrRNA>ACT2>TUA>GAPA。本次研究結果表明，在鹽脅迫下蠶豆葉中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因為ACT2和18SrRNA，莖中相對穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因是CYP2、ACT2，根中相對穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因是CYP2和ELF1A。另外，從配對變異系數(shù)(V)可以看出Vn/Vn+1值均小于0.15(圖6)，表明在鹽脅迫下的蠶豆不同組織中選取兩個內(nèi)參基因就可以得到準確結果。

圖5 GeNorm軟件分析內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性Fig.5 Expression stability of reference genes analyzed via GeNorm

圖6 GeNorm 分析候選內(nèi)參基因的配對變異值Fig.6 Paired variation of reference genes analyzed via GeNorm

(3)NormFinder 軟件分析。從NormFinder軟件分析結果得出(表3)，在鹽脅迫下蠶豆葉中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是ACT2和18SrRNA，在莖中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP2，在根中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP2和ELF1A。

表3 NormFinder 軟件分析結果Tab.3 Analysis results of NormFinder

(4)BestKeeper 軟件分析結果。BestKeeper軟件分析結果(表4)顯示，除TUA以外的候選基因的標準差(SD)均小于1.5，說明所選候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定較好。鹽脅迫下蠶豆葉中ACT2基因表達最穩(wěn)定，莖和根中CYP2基因表達最穩(wěn)定。該結果與GeNorm和NormFinder軟件分析的結果大致相同，部分差異可能由于軟件間的計算原理不同所導致。

表4 BestKeeper 軟件分析結果Tab.4 Analysis results of BestKeeper

3 討論與結論

實時熒光定量PCR是研究基因表達變化的主要手段，為確保實驗結果的準確性和可靠性，RT-qPCR需要選用表達較為穩(wěn)定的持家基因來控制樣品間的非特異性變異[21]。然而，近年來研究結果表明，并未有表達絕對穩(wěn)定的內(nèi)參基因，即使在同一物種或組織中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，其穩(wěn)定性會因?qū)嶒灄l件的影響而表現(xiàn)出差異性[22-23]。因此，篩選出在不同物種、不同組織中適宜的內(nèi)參基因就顯得十分重要。Gutierrez等[17]以不同組織、基因型和接種幾種重要的病原體的蠶豆為研究對象，進行內(nèi)參基因的篩選，結果顯示ACT1基因、CYP2基因和ELF1A基因可作為理想的內(nèi)參基因。本研究以不同鹽濃度脅迫下的蠶豆不同組織為材料，對六個植物常見的候選內(nèi)參基因進行篩選，結果表明，在鹽脅迫下的蠶豆葉片中，ACT2和18SrRNA基因表達相對穩(wěn)定，在莖中CYP2基因表達相對穩(wěn)定，而根中CYP2和ELF1A基因表達相對穩(wěn)定?；贕eNorm、NormFinder和BestKeeper 軟件分析候選內(nèi)參基因的結果存在一些差異，可能由于軟件間的計算原理不同所導致(GeNorm軟件和NormFinder軟件利用相對表達量Q來計算內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值，而BestKeeper軟件直接利用原始Ct值進行計算)。由于在試驗過程中，內(nèi)參基因表達量也會受到樣品質(zhì)量的影響。因此，在試驗過程中確保樣本RNA、cDNA等的質(zhì)量、純度及操作細節(jié)的準確性是確保得到穩(wěn)定內(nèi)參基因的基礎。本研究篩選的鹽脅迫下蠶豆不同組織中穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為后期研究蠶豆耐鹽基因表達分析方面奠定了理論基礎。