結(jié)核性與惡性胸腔積液中微小核糖核酸內(nèi)參基因篩選的初步研究

董靜 賈紅彥 孫琦 李自慧 魏榮榮 杜博平 邢愛(ài)英 潘麗萍 張宗德

結(jié)核性胸膜炎是病理性胸腔積液形成的主要原因之一[1]。由于其臨床表現(xiàn)不典型，需病原學(xué)檢測(cè)來(lái)確診。但目前胸腔積液的多種病原學(xué)檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用均不理想，如分枝桿菌抗酸染色和BACTEC MGIT 960快速液體培養(yǎng)的陽(yáng)性率均較低，僅為10%和20%左右；γ干擾素釋放試驗(yàn)難以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌潛伏感染，特異度較低[2]；穿刺活檢和胸腔鏡活檢病理學(xué)檢查雖可使陽(yáng)性率提升至56%以上，但患者難以耐受侵入式檢查，并發(fā)癥較多，對(duì)醫(yī)生操作水平和設(shè)備的要求也較高[3]；而新一代實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)(GeneXpert MTB/RIF Ultra)技術(shù)也對(duì)30%～50%的疑似患者無(wú)法確診[4-6]。臨床亟需有效的新型檢測(cè)方法。

微小核糖核酸(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[7-8]，主要通過(guò)3′UTR區(qū)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合相應(yīng)靶mRNA 來(lái)抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯[9]。相對(duì)于蛋白和長(zhǎng)鏈RNA，miRNA具有抗酸、抗堿、抗核糖核酸酶，反復(fù)凍融不易降解的穩(wěn)定性質(zhì)[10]，且已被大量研究證實(shí)，miRNA的動(dòng)態(tài)變化與疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有著十分密切的關(guān)系[1, 11-12]。但胸腔積液中miRNA含量較少、豐度偏低、缺乏公認(rèn)的可相對(duì)定量檢測(cè)的內(nèi)參基因，阻礙了對(duì)胸腔積液中miRNA的相關(guān)研究[1]。為評(píng)估胸腔積液中miRNA內(nèi)參基因定量檢測(cè)的可行性，本研究選取了7個(gè)應(yīng)用頻次較高的定量檢測(cè)胸腔積液及其他體液中miRNA表達(dá)量的內(nèi)參基因，通過(guò)geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析并了解其在胸腔積液標(biāo)本中定量檢測(cè)的穩(wěn)定性和表達(dá)豐度，為后期研究胸腔積液miRNA的動(dòng)態(tài)變化與疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸關(guān)系提供基礎(chǔ)支撐。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

搜集2016年9月至2018年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院經(jīng)胸腔積液常規(guī)生化和涂片鏡檢、核酸檢測(cè)、細(xì)菌和真菌培養(yǎng)、分枝桿菌改良羅氏培養(yǎng)，以及細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)、胸部CT掃描等檢查結(jié)果確診治療的47例結(jié)核性胸膜炎患者和31例并發(fā)胸腔積液的癌癥患者作為研究對(duì)象。所有入選患者均排除HIV感染、乙型和丙型病毒性肝炎、梅毒螺旋體感染、妊娠，以及有免疫抑制劑用藥史、結(jié)核病病史和結(jié)核病密切接觸史者。

78例患者中，男51例(65.4%)，女27例(34.6%)；年齡25～88歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為60(30，68)歲。其中，結(jié)核性胸膜炎患者中，男35例(74.5%)，女12例(25.5%)；年齡18～86歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為46(25，64)歲；胸腔積液分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性15例(31.9%)、涂片抗酸桿菌染色陽(yáng)性5例(10.6%)、PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因保守序列檢測(cè)陽(yáng)性12例(25.5%)、GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性14例(29.8%)，GeneXpert MTB/RIF和PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因保守序列同時(shí)陽(yáng)性1例(2.1%)。并發(fā)胸腔積液的癌癥患者中，男16例(51.6%)，女15例(48.4%)；年齡38～88歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為65(59，69)歲；經(jīng)組織病理檢測(cè)和既往病史確診腺癌(包括腺癌轉(zhuǎn)移)21例(67.7%)，其他類(lèi)型癌癥(包括鱗癌、小細(xì)胞肺癌、間皮瘤肺轉(zhuǎn)移、霍奇金淋巴瘤肺部轉(zhuǎn)移等)10例(32.3%)。本研究通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[(2020)年臨審第(2號(hào))]。

二、研究方法

1.miRNA內(nèi)參基因的選擇：選擇胸腔積液及其他體液中用于miRNA表達(dá)量定量檢測(cè)應(yīng)用頻次較高的5個(gè)內(nèi)參基因(包括miR-16、miR-20a、miR-192、U6、Cel-miR-39)[7, 13-14]，以及前期研究中高通量篩選獲得的2個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的miRNA(包括miR-1268和miR-4281)。

2.標(biāo)本收集與處理：留存每例研究對(duì)象常規(guī)檢測(cè)后的胸腔積液標(biāo)本2 ml，4 ℃下2000×g離心10 min，再經(jīng)16 000×g離心10 min，吸取上清，根據(jù)實(shí)際情況分裝，每管200 μl，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ａ聿杉?例患者胸腔積液標(biāo)本各1 ml，各等分為5管，其中1管采集后直接如上離心處理，另3管采集后分別放置1 h、2 h、4 h后如上離心處理，最后1管反復(fù)凍融2次后如上離心處理。5管處理后均于-80 ℃凍存?zhèn)溆?，用以分析放置不同時(shí)間及2次凍融后胸腔積液內(nèi)miRNA內(nèi)參基因表達(dá)量的變化比較。

3.RNA提取：采用miRNeasy Serum/Plasma kit血液/血漿RNA提取純化試劑盒(德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：217184)提取胸腔積液標(biāo)本中的RNA。操作步驟如下：取200 μl胸腔積液標(biāo)本，加入1 ml RNA提取試劑，室溫放置5 min，再加入3.5 μl Spike-In control工作液(德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：219610，5.6×108拷貝，2.67×10-1pmol/ml)和200 μl三氯甲烷，振蕩15 s，放置2 min，4 ℃環(huán)境下12 000×g離心15 min，棄上清，加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇，置于試劑盒配套的收集柱內(nèi)，10 000×g離心15 s，先后經(jīng)洗液Ⅰ、洗液Ⅱ和80%乙醇洗滌，收集RNA。再以微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)測(cè)定RNA含量。為分析同1例患者的2份胸腔積液標(biāo)本中miRNA定量檢測(cè)的一致性，從上述標(biāo)本中任意挑選5例患者的2管200 μl胸腔積液標(biāo)本，進(jìn)行如上操作，以測(cè)定重復(fù)標(biāo)本miRNA檢測(cè)的一致性。

4.加尾法逆轉(zhuǎn)錄：按照miScript Ⅱ RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：218161)配套說(shuō)明書(shū)進(jìn)行如下逆轉(zhuǎn)錄操作：取4 μl高特異性反轉(zhuǎn)錄緩沖濃縮液(5×miScript HiSpec緩沖液)、2 μl核酸混合物濃縮液(miScript nucleics mix)、2 μl反轉(zhuǎn)錄酶(miScript reverse transcriptase mix)、100 ng RNA和適量無(wú)酶水(RNase-free ddH2O)組成20 μl反轉(zhuǎn)錄體系。37 ℃孵育60 min，95 ℃滅活5 min，完成反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物于-80 ℃保存。

5.PCR預(yù)擴(kuò)增檢測(cè)：按照miScript PreAMP PCR Kit預(yù)擴(kuò)增PCR試劑盒(德國(guó)qiagen公司，批號(hào)：331452)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，其中，7個(gè)待檢miRNA引物均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。操作步驟如下：取待檢測(cè)miRNA的引物濃縮液各10 μl，混合并稀釋至工作液，制成引物混合物備用。按說(shuō)明書(shū)配置成25 μl預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系，在Mycycler普通PCR儀上(美國(guó)Bio-Rad公司)設(shè)置反應(yīng)程序如下：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 3 min，循環(huán)12次。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和熔解曲線分析：使用miScript SYBR Green PCR Kit實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：218073)，按照說(shuō)明書(shū)配置20 μl擴(kuò)增體系。程序設(shè)置為：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，循環(huán)40次，在Thermofisher Quantistudio 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)上完成。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到引物擴(kuò)增效率和miRNA的內(nèi)參基因表達(dá)量[循環(huán)閾值(Ct值)]。Ct值越低，表示基因表達(dá)量越高，基因表達(dá)的豐度越好，越適合作為內(nèi)參基因用于相對(duì)定量；引物擴(kuò)增效率為90%～110%之間，表示可以用于后續(xù)胸腔積液中miRNA的檢測(cè)；當(dāng)熔解曲線平滑，僅有單一主峰時(shí)，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異度較好。

7.軟件評(píng)估及判讀：使用geNorm(https://genorm.cmgg.be/)、NormFinder(https://moma.dk/Normfinder-software)和BestKeeper(http://www.gene-quantification.de/bestkeeper.html)3種軟件分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。其中，通過(guò)geNorm軟件可計(jì)算出代表每個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M值來(lái)篩選出穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因，M值越小表示內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，該軟件設(shè)定的閾值為1.5；通過(guò)NormFinder軟件計(jì)算出的穩(wěn)定值越小，表示內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好；而B(niǎo)estKeeper軟件主要通過(guò)表格內(nèi)置公式，計(jì)算出待測(cè)基因的Ct值的“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”和變異系數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)越小，表示內(nèi)參基因越穩(wěn)定，越適合作為內(nèi)參基因。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、miRNA表達(dá)豐度的分析

78份標(biāo)本中，7種內(nèi)參基因miR-1268、Cel-miR-39、miR-16、miR-192、miR-20a、miR-4281、U6檢測(cè)的Ct值從低至高分別為19.16±4.40、24.17±0.73、24.52±1.65、27.54±1.36、28.47±1.72、28.58±2.09、30.31±1.56；擴(kuò)增效率分別為90%、101%、110%、93%、97%、97%、90%，均可以用于后續(xù)胸腔積液miRNA檢測(cè)；且7種內(nèi)參基因的熔解曲線均為平滑且僅有單一主峰，顯示特異度均較好。

二、miRNA表達(dá)穩(wěn)定性的分析

通過(guò)3種軟件的分析，Cel-miR-39更適合作為內(nèi)參基因，具體如下：

1. geNorm軟件分析：Cel-miR-39、miR-192、U6、miR-20a、miR-16等5種內(nèi)參基因的M值分別為0.994、1.003、1.224、1.376、1.484，均符合軟件設(shè)定的閾值(<1.5)，穩(wěn)定性較好。而miR-4281和miR-1268的M值分別為1.612和2.078，均不符合軟件設(shè)定的閾值，穩(wěn)定性較差。

2.NormFinder軟件分析：Cel-miR-39的穩(wěn)定值為0.674，優(yōu)于其他6種內(nèi)參基因，即U6、miR-192、miR-20a、miR-16、miR-4281、miR-1268分別為0.813、0.890、0.936、1.057、1.140、3.041。

3.BestKeeper軟件分析：Cel-miR-39在78份標(biāo)本中的Ct值為24.17±0.73，低于除miR-1268外其他內(nèi)參基因的Ct值，且標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)均較低；而miR-1268雖然Ct值較低，但是標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)高，并不適合作為相對(duì)定量檢測(cè)的內(nèi)參基因，具體見(jiàn)表1。

三、miRNA檢測(cè)重復(fù)性分析

對(duì)5例患者胸腔積液標(biāo)本(各2份)miRNA含量進(jìn)行可重復(fù)性檢測(cè)顯示： 7個(gè)內(nèi)參基因兩次檢測(cè)Ct值的比較，結(jié)果均未見(jiàn)差異(表2)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)對(duì)胸腔積液標(biāo)本中RNA提取和miRNA定量檢測(cè)均具有較好的穩(wěn)定性。

四、不同標(biāo)本處理方法對(duì)胸腔積液miRNA定量檢測(cè)的影響

對(duì)不同處理時(shí)間和2次凍融胸腔積液標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：在標(biāo)本采集后1 h、2 h、4 h及反復(fù)凍融2次后，7種內(nèi)參miRNA的表達(dá)量與采樣后立即處理時(shí)的表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表2 胸腔積液標(biāo)本中miRNA檢測(cè)重復(fù)性分析

表3 七種內(nèi)參基因在不同處理方式胸腔積液標(biāo)本中的表達(dá)情況

討 論

當(dāng)前，結(jié)核性胸膜炎的臨床診斷和鑒別診斷仍存在困難，通過(guò)選擇合適的生物標(biāo)志物進(jìn)行組織液活檢用于輔助診斷越來(lái)越受到關(guān)注[15]。胸腔積液是臨床上常見(jiàn)的一種病理狀態(tài)，主要分為漏出液和滲出液。前者常通過(guò)成分和詳細(xì)詢(xún)問(wèn)病史來(lái)進(jìn)行臨床判斷，而后者的病因種類(lèi)繁多，最常見(jiàn)于結(jié)核性胸腔積液和癌性胸腔積液[16-17]，分別占比為40%和30%左右[18-19]。由于筆者所在醫(yī)院的特殊性，可選擇用于研究的患者標(biāo)本均為結(jié)核性和惡性胸腔積液，故本研究對(duì)所選取的研究對(duì)象進(jìn)行胸腔積液miRNA內(nèi)參基因相對(duì)定量的檢測(cè)的結(jié)果具有一定的代表性。

現(xiàn)階段關(guān)于miRNA定量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要有基因芯片、二代測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。前兩種方法屬高通量檢測(cè)，常用于初步篩查；而熒光定量PCR技術(shù)由于較敏感，易出現(xiàn)誤差，常通過(guò)目的基因與內(nèi)參基因的差值來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，已成為現(xiàn)階段主要的實(shí)驗(yàn)方法。因此，選擇合適的內(nèi)參基因?qū)τ趯?shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀呈現(xiàn)有著重要意義[20]。既往研究提示，在某種類(lèi)型標(biāo)本中公認(rèn)的穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并不一定在其他類(lèi)型標(biāo)本中也穩(wěn)定[7]。針對(duì)不同標(biāo)本類(lèi)型，通常應(yīng)有相對(duì)的特異性標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參基因，如血漿或細(xì)胞中miRNA的相關(guān)研究通常使用U6[13]。但在對(duì)胸腔積液miRNA的定量檢測(cè)研究中，并沒(méi)有業(yè)界認(rèn)可的統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參基因。在生物標(biāo)識(shí)物研究中，大多數(shù)的研究者為了保證內(nèi)參基因表達(dá)的均一穩(wěn)定，會(huì)在開(kāi)始進(jìn)行正式的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本類(lèi)型和研究疾病嘗試多種比較常見(jiàn)的內(nèi)參基因，或通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以選擇出有針對(duì)性的內(nèi)參基因。

通過(guò)前期檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，筆者發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性基因U6、RNU44、RNU48、miR-192、miR-20a均被較多地應(yīng)用于胸腔積液miRNA內(nèi)參基因的定量檢測(cè)中[14]。并在2014年前后被較多研究證實(shí)，相對(duì)于RNU44、RNU48，U6更合適作為內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，并在其后的一段時(shí)間內(nèi)被廣泛應(yīng)用于很多相關(guān)實(shí)驗(yàn)中[13]。但本次研究發(fā)現(xiàn)，雖然U6的應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)，但其Ct值較大，豐度較低，且在個(gè)別標(biāo)本中存在未能成功擴(kuò)增的現(xiàn)象，故筆者認(rèn)為U6不是結(jié)核性和惡性胸腔積液miRNA相對(duì)定量檢測(cè)中最合適的內(nèi)參基因。此外，雖然Han等[7]建議選擇miR-192作為內(nèi)參基因來(lái)對(duì)胸腔積液miRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，但在對(duì)胸腔積液細(xì)胞的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，其可作為鑒別良惡性胸腔積液的敏感性生物標(biāo)識(shí)[21]，且在2018年被Filipska等[22]發(fā)現(xiàn)其在鱗狀細(xì)胞肺癌細(xì)胞化學(xué)治療的耐藥性和侵襲性方面有生物學(xué)作用，故筆者認(rèn)為miR-192并不能作為胸腔積液miRNA檢測(cè)最合適的內(nèi)參基因。miR-20a也曾被證實(shí)參與了抑癌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[23]，而miR-16僅作為內(nèi)參基因應(yīng)用于血液miRNA的定量檢測(cè)[24]。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)以上miRNA內(nèi)參基因在胸腔積液中的表達(dá)穩(wěn)定性較差，可能并不適合作為結(jié)核性和惡性胸腔積液miRNA定量檢測(cè)的內(nèi)參基因，提示在一些研究中相對(duì)穩(wěn)定的U6或miR-16并不能推廣于結(jié)核性和惡性胸腔積液標(biāo)本檢測(cè)，可能與不同標(biāo)本和疾病類(lèi)型之間的表達(dá)譜存在差異有關(guān)。

miR-4281和miR-1268是筆者團(tuán)隊(duì)在前期進(jìn)行胸腔積液miRNA高通量篩選中獲得的標(biāo)本間相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的miRNA內(nèi)參基因。但由于前期高通量篩選的標(biāo)本數(shù)量有限，導(dǎo)致在擴(kuò)大研究后發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNA內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性并不好，并不適合作為內(nèi)參基因。這也提示在選擇內(nèi)參基因時(shí)，應(yīng)慎重選擇那些通過(guò)高通量篩選技術(shù)獲得的相對(duì)穩(wěn)定的miRNA，不能僅基于高通量檢測(cè)結(jié)果而盲目選擇。

相對(duì)于細(xì)胞和組織，除血液外，在胸腔積液、腦脊液等體液中能夠穩(wěn)定表達(dá)的miRNA內(nèi)參基因并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，這也是研究人員嘗試引入外源性miRNA基因來(lái)進(jìn)行定量檢測(cè)的主要原因[25]。Cel-miR-39就是其中1個(gè)被引入最多的內(nèi)參基因[25-26]。Cel-miR-39是人工合成的線蟲(chóng)序列miRNA，是在RNA提取過(guò)程中人為添加的外源性對(duì)照，其含量與體內(nèi)病理變化沒(méi)有直接聯(lián)系，通常作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的外源性對(duì)照[27]，但在胸腔積液中并沒(méi)有太多的研究。僅發(fā)現(xiàn)Wang等[28]在2017年對(duì)胸腔積液外泌體miRNA的研究中使用其作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的參照基因。結(jié)合本研究結(jié)果可以初步認(rèn)為，在未發(fā)現(xiàn)胸腔積液中存在更加穩(wěn)定表達(dá)的其他內(nèi)參基因時(shí)，可以選擇Cel-miR-39作為內(nèi)參基因進(jìn)行miRNA的定量檢測(cè)。

目前，國(guó)內(nèi)外并沒(méi)有對(duì)于內(nèi)參基因綜合評(píng)價(jià)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，而geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件是內(nèi)參基因篩選常用的軟件，在其他類(lèi)型標(biāo)本中已被廣泛應(yīng)用[29-30]。本研究使用這3個(gè)軟件分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cel-miR-39在3個(gè)軟件中均表現(xiàn)出最佳的穩(wěn)定性，且7個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序并不完全相同，與既往的研究中發(fā)現(xiàn)“NormFinder軟件顯示U6的穩(wěn)定性?xún)?yōu)于miR-192，但BestKeeper軟件顯示miR-192的穩(wěn)定性?xún)?yōu)于U6”的結(jié)果相似[7]，可能與不同軟件內(nèi)置的計(jì)算模式不相同有關(guān)。但本研究?jī)H通過(guò)這3個(gè)軟件來(lái)評(píng)估7個(gè)miRNA內(nèi)參基因的檢測(cè)穩(wěn)定性和表達(dá)豐度，可能存在評(píng)估不全面的問(wèn)題；而且，在以?xún)?nèi)參基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)時(shí)，還要考慮擴(kuò)增效率的因素。當(dāng)靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率基本一致時(shí)，才能保證檢測(cè)的客觀性和準(zhǔn)確性[7]。此外，有學(xué)者提出可同時(shí)采用內(nèi)源性和外源性?xún)?nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)[26]，但如何將內(nèi)源性和外源性基因進(jìn)行聯(lián)合，抑或是分別基于內(nèi)源性和外源性?xún)?nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，目前并沒(méi)有明確的標(biāo)準(zhǔn)或依據(jù)。因此，本研究也未聯(lián)合多個(gè)內(nèi)參基因用于定量檢測(cè)評(píng)價(jià)。但希望在未來(lái)研究中，能開(kāi)發(fā)出基于數(shù)學(xué)模型的miRNA多內(nèi)參基因的聯(lián)合定量檢測(cè)。

綜上所述，本研究針對(duì)胸腔積液中miRNA的定量檢測(cè)進(jìn)行了內(nèi)參基因的篩選，通過(guò)3個(gè)計(jì)算軟件比較了7個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，并分析了標(biāo)本不同處理方式對(duì)miRNA檢測(cè)的影響，發(fā)現(xiàn)Cel-miR-39穩(wěn)定性最好，表達(dá)豐度適中，適宜作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)胸腔積液miRNA表達(dá)量的內(nèi)參基因。