冷榨菜籽蛋白的堿性電解水提取工藝及其結(jié)構(gòu)性能表征

楊萬富，黃桃翠，劉和平，張祖清，Waleed A.S. Aldamarany，高羽歌，鐘 耕※

（1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715； 2. 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，重慶 400060；3. 重慶市凱欣糧油有限公司，重慶 401121）

0 引 言

菜籽餅是油菜籽榨取油脂的副產(chǎn)物，中國近幾年菜籽餅?zāi)戤a(chǎn)750 萬t 以上，通常用于動物飼料和農(nóng)業(yè)肥料，經(jīng)濟(jì)效益低，而冷榨菜籽餅蛋白質(zhì)（質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%～40%）因壓榨條件相對溫和，是開發(fā)高附加值產(chǎn)品[1-3]的優(yōu)質(zhì)資源。菜籽蛋白含有豐富的甲硫氨酸和半胱氨酸[4]，具有平衡的氨基酸組成[5]、良好的乳化、起泡、凝膠等功能特性[6-8]和較高的營養(yǎng)價值。目前菜籽蛋白的提取方法主要包括pH 分段控制法（堿、酸、鹽）結(jié)合超聲、微波、膜分離、納濾等手段和其他方法（奧斯本-門德爾分離法、醇溶液提取、反膠束、酶解和微生物發(fā)酵等）[9]。

為滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)要求，pH 分段控制法是提取分離植物蛋白的主要方法，該法使用大量的強(qiáng)酸/堿調(diào)節(jié)提取液pH 值，產(chǎn)品提取率低、色澤及溶解性差、能耗高且提取蛋白產(chǎn)生的廢水、廢渣不易處理，對環(huán)境不友好[9-10]。堿性電解水是酸性電解水的副產(chǎn)品，為小分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，表面張力較低、滲透性較強(qiáng)，可以作為較好的溶劑，且易逐漸恢復(fù)為普通水[11]，對環(huán)境無污染，采用不同電解質(zhì)可以制得pH 值達(dá)12 以上的堿性電解水。此外， 堿性電解水具有一定的氧化還原電位（Oxidation-Reduction Potential, ORP），其可以保護(hù)蛋白質(zhì)的活性基團(tuán)免受氧化，并提高最終產(chǎn)品的質(zhì)量[11-12]。Toge 等[13]利用堿性電解水提取魚油，其提取率較Bligh-dyer 法高。苗雨欣等[14]用pH 值12.5 堿性電解水提取靈芝多糖與傳統(tǒng)水提法相比，靈芝多糖得率提高了74.72%。李志豪等[15]用pH 值為8.5～10 的堿性電解水提取籽瓜種仁蛋白，其提取率比傳統(tǒng)的堿溶酸沉法高1.7～8.3 個百分點。譚曉妍等[16]采用堿性電解水耦合酶提取茶渣蛋白，不僅提高了茶渣蛋白的提取率，而且提高了蛋白質(zhì)抗氧化能力。Li 等[17]研究表明超聲輔助堿性電解水提取南極磷蝦蛋白質(zhì)可以減少30.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氫氧化鈉消耗量，同時保護(hù)了羰基、游離巰基等活性基團(tuán)。

堿性電解水制作簡單，與生產(chǎn)傳統(tǒng)化學(xué)試劑相比成本低廉，且具有堿性特質(zhì)和高滲透性，較NaOH 使用安全可靠[16]。因此本試驗以冷榨雙低菜籽餅為研究對象，對堿性電解水提取冷榨菜籽餅蛋白（簡稱菜籽蛋白）工藝進(jìn)行優(yōu)化研究?？疾炝藟A性電解水pH 值、料液比、提取溫度和時間等因素對菜籽蛋白提取率的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化菜籽蛋白的提取工藝；并對比分析了相同條件下傳統(tǒng)酸/堿法調(diào)配pH 水（Ultrapure water extracted Rapeseed Protein，URP）與堿性電解水（Alkaline electrolyzed water extracted Rapeseed Protein，ARP）對菜籽蛋白提取率、結(jié)構(gòu)和功能特性方面的影響。目前利用ORP 值和高pH 值電解水提取油料餅粕蛋白的研究還未見報道，本研究對菜籽蛋白的高效綠色提取和應(yīng)用提供技術(shù)支持，可促進(jìn)油料蛋白資源的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

雙低油菜籽：重慶市紅蜻蜓油脂有限公司提供，經(jīng)冷榨機(jī)（東都寶電器科技有限公司，D02，浙江溫州）榨油得冷榨菜籽餅，其基本成分見表1，符合國家雙低菜籽餅標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 417-2000）。冷榨菜籽餅于室溫1:10 (g/mL)石油醚脫脂12 h，通風(fēng)干燥，直到?jīng)]有明顯的石油醚氣味，粉碎并過60 目篩。

表1 冷榨菜籽餅基本成分含量Table 1 The components content of cold presed rapeseed meal

牛血清白蛋白、芥酸、植酸均為標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸鹽、溴酚藍(lán)等試劑均為分析純，重慶市鈦新化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能富氫水制備器，廣東新康公司；Sartorius pH計，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；5840R 冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；SY-10 真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；759 系列紫外可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；L8900-全自動氨基酸分析儀、F-2500 熒光分光光度計，日本日立公司；CM-5分光測色儀，日本KonicaMinolta 公司；Spectrum100 紅外光譜儀，珀金埃爾默公司；NanoZS90 納米粒度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文公司。

1.3 方 法

1.3.1 堿性電解水的制備

堿性電解水由廣東新康科技有限公司XK-A7 電解水生成器制備得到，其中pH 值為 8.5、9.5、10.5 電解水由電解水生成器電解自來水不同時間所得；pH 值11.5 和12.5 電解水為電解飽和氯化鈉溶液一定時間所得。每隔一定時間取少量電解水用pH 計測定其pH 值，待其達(dá)到所需pH 值的堿性電解水即可，電解水可放置一年時間，pH 值保持不變。

1.3.2 冷榨菜籽餅基本成分的測定

冷榨菜籽餅中粗蛋白含量、水分含量均參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定[18-19]。硫代葡萄糖苷測定參照吳謀成等[20]方法。芥酸測定參照李笑笑等[21]方法。植酸測定參照Zhang 等[22]方法。

1.3.3 冷榨菜籽蛋白制備及提取率的計算

準(zhǔn)確稱取脫脂冷榨菜籽餅粉20.0 g，與一定比例的堿性電解水混合，在一定溫度下水浴鍋中磁力攪拌提取一定時間，提取液離心10 min（4 ℃、5 000 r/min），取上清液，用HCl（1.0 mol/L）溶液調(diào)pH 值至4.5，離心10 min（4 ℃、8 000 r/min），收集沉淀，水洗至中性，?80 ℃預(yù)凍12 h，經(jīng)真空冷凍干燥得粉狀物，冷藏（4 ℃）備用。

對照組分離蛋白采用傳統(tǒng)堿溶酸沉法制備：準(zhǔn)確稱取20.0 g 粉碎脫脂粉，與一定比例的堿水（用1.0 moL/L NaOH 調(diào)節(jié)純水至相應(yīng)pH 值）混合，其余操作與堿性電解水提取相同。

參考Zhang 等[22]的方法利用Bradford 法測定上清液蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=6.890 5x+0.018 8（R2=0.998 7）x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度mg/mL；y為595 nm 處吸光度。

菜籽蛋白提取率按下式計算：

式中C為上清液蛋白含量，mg/mL；V為上清液體積，mL；m為脫脂粉蛋白質(zhì)量，g。

1.3.4 菜籽蛋白提取工藝優(yōu)化

分別研究料液比（1:7～1:12 g/mL）、pH 值（8.5～12.5）、提取溫度（20～60 ℃）和提取時間（20～80 min）4 個因素對菜籽蛋白提取率的影響，其中以料液比1:10 g/mL、堿性電解水pH 值9.5、提取溫度20 ℃、提取時間60 min 為固定水平因素。

采用JMP Trial 16 軟件，參考單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Bhenken 原則進(jìn)行試驗設(shè)計，以料液比、堿性電解水pH 值、提取溫度、提取時間為考察因素，菜籽蛋白提取率（Y）為評價指標(biāo)，試驗設(shè)計如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計與水平設(shè)定Table 2 Experimental factor and levels setting of Box-Behnken design

1.3.5 菜籽蛋白成分測定

氨基酸組成參照GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》方法測定。

蛋白質(zhì)分子質(zhì)量采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，參考Li 等[23]的方法并略作修改如下：采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%濃縮膠和12%分離膠。吸取20μL 蛋白樣品（5 mg/mL）與5μL 樣品緩沖液混合，煮沸5 min，冷卻后分別加入到膠孔。恒壓80 V 電泳30 min，待進(jìn)入分離膠后采用120 V 電泳至溴酚藍(lán)跑到分離膠底部。電泳結(jié)束后剝膠并水洗3 次，用溶于甲醇∶乙酸∶水（5∶1∶4，v/v/v）的0.12 g/mL 考馬斯亮藍(lán)R-250 浸泡過夜，最后與脫色劑（甲醇∶乙酸∶水=5∶1∶4，v/v/v）混合，脫去背景色至條帶清晰。

1.3.6 菜籽蛋白理化特性測定

色澤采用CM-5 分光測色儀測定，由L*、a*、b*的值量化。

參考Chen 等[24]的方法略作修改，測定菜籽蛋白表面疏水性。取適量菜籽蛋白于離心管，用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer，PBS，0.01 mol/L，pH=7.0）配制2 mg/mL 蛋白溶液，再吸取0.5 mL 1 mg/mL 溴酚藍(lán)溶液（Bromophenol Blue，BPB）與之混合。同時制備對照組樣品，5 mL PBS 和0.5 mL BPB。所有樣品旋渦5 min 后離心10 min（4 ℃，8 000 r/min)。取0.5 mL 上清液和5 mL PBS 混勻，于595 nm 處測定吸光值。

巰基和二硫鍵含量參考Li 等[17]的方法略作修改。測定總巰基含量時，用含8 mol/L 尿素Tris-Gly 緩沖液配制3 mg/mL 蛋白溶液，加入60μL 4 mg/mL 2-硝基苯甲酸（5,5-Dithiobis-2-nitrobenzoicaci，DTNB），室溫下反應(yīng)1 h后離心15 min（5 000 r/min），取上清液在412 nm 處測定吸光值，以含60μL DTNB 溶液和Tris-Gly 溶液為空白對照。測定游離巰基時用不含尿素Tris-Gly 緩沖液配制3 mg/mL 蛋白溶液其余操作與測定總巰基含量相同。

粒徑參照Li 等[23]的方法測定，水折射率1.330，材料折射率1.450。

Zeta 電位參照Crudden 等[25]的方法測定。用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH=7.0）配制1 mg/mL 蛋白溶液，取0.9 mL 蛋白溶液室溫下用粒度儀測定。

1.3.7 菜籽蛋白結(jié)構(gòu)測定

采用Spectrum 100 傅里葉紅外光譜分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)64 次。

內(nèi)源熒光參考Jiang 等[26]的方法測定，用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH=7.0）配制0.1 mg/mL 蛋白溶液，使用5 nm 狹縫在激發(fā)波長295 nm 下記錄300～400 nm 發(fā)射光譜。

1.3.8 菜籽蛋白功能特性測定

參照Purkayastha 等[27]的方法測定菜籽蛋白溶解度（Solubility, S），持水性（Water Absorption Activity, WA），持油性（Fat Absorption Activity, FA），乳化性（Emulsifying Activity, EA），乳化穩(wěn)定性（Emulsifying Stability, ES），起泡性（Foaming Capacity, FC）和起泡穩(wěn)定性（Foaming Stability, FS）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 Orign 2021 pro 軟件作圖和單因素中的Tukey 檢驗進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05 表示顯著），JMP Trial 16 軟件進(jìn)行回歸分析和t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜籽蛋白提取單因素試驗結(jié)果

由圖1a 可知，菜籽蛋白提取率在料液比1:10 g/mL時取得最大值，當(dāng)料液比小于1:10 g/mL 時，菜籽蛋白提取率隨料液比增加而顯著提高，這是由于隨著料液比增大，體系黏度降低，物料與介質(zhì)充分接觸，均勻分散在水相中，促進(jìn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移[28]。當(dāng)料液比大于1∶10 g/mL時，菜籽蛋白提取率略有降低，可能為體系中游離油脂與部分蛋白乳化所致[29]。因此，選用料液比1∶9～1∶11 g/mL 作為后續(xù)工藝優(yōu)化。

由圖1b 可知，隨堿性電解水pH 值增大菜籽蛋白提取率呈先增大后降低趨勢，當(dāng)pH 值≥12 會引起蛋白質(zhì)變性和賴-丙氨酸復(fù)合物形成[28]，降低營養(yǎng)價值；且多酚易氧化成醌類物質(zhì)與蛋白質(zhì)的氨基和游離巰基發(fā)生加成反應(yīng)[30]，使菜籽蛋白提取液顏色變?yōu)辄S綠色、綠褐色[31]。因此選擇pH 值為9.5～11.5 堿性電解水進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化。

由圖1c 可知，菜籽蛋白提取率隨提取時間延長而增大，20 到40 min 內(nèi)蛋白提取率迅速增加，50 min 時達(dá)到最大值，其后提取率無明顯變化，這可能是可溶性蛋白已基本完全溶解達(dá)到傳質(zhì)平衡。因此，從降低能耗和產(chǎn)量考慮，選擇40～60 min 進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化。

由圖1d 可知，菜籽蛋白提取率隨溫度增加呈先增大后降低的趨勢，在40 ℃時達(dá)到最大值。這是由于在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高可以降低體系黏度從而加快分子運動，增加蛋白溶解度[32]，因此選擇30～50 ℃進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面工藝優(yōu)化與結(jié)果分析

2.2.1 Box-Behnken 試驗結(jié)果與方差分析

根據(jù)Box-Behnken 原則按照表2 因素和水平建立4因素3 水平試驗設(shè)計，詳細(xì)試驗方案及結(jié)果見表3。對表3 中菜籽蛋白提取率（Y，%）和4 因素運用JMP Trail16 軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合得到菜籽蛋白提取率的回歸方程為

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 The experimental de-results of Box-Behnken

2.2.2 回歸模型分析

通過t檢驗對模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果如表4所示。由表可得，一次項（A、B、C、D）、二次項（A2、B2、C2、D2）和交互項BC、AD、BD的P值均<0.05，表明各變量系數(shù)對模型影響顯著?；貧w模型系數(shù)絕對值大小可以看出，各因素對蛋白提取率的影響程度由大到小為：B>A>C>BC>D>AD，即堿性電解水pH 值、溫度、料液比、堿性電解水pH 值與料液比、時間、溫度與時間。

2.2.3 回歸模型方差分析和失擬項性檢驗

對回歸模型進(jìn)行F檢驗和方差分析，結(jié)果如表5 所示。由表可得，模型P值<0.000 1 和失擬項P值>0.05，且回歸模型調(diào)整決定系數(shù)R2=0.93，表明該回歸模型在試驗范圍內(nèi)能較好地預(yù)測和優(yōu)化堿性電解水提取冷榨菜籽蛋白工藝。

表5 模型方差分析及失擬項檢驗Table 5 Model variance analysis and lack of fit test

2.2.4 工藝優(yōu)化與驗證

利用JMP 軟件對堿性電解水提取冷榨菜籽蛋白工藝參數(shù)優(yōu)化，當(dāng)提取溫度45.23 ℃、pH 值11.5、液料比1∶9.727 g/mL、提取時間60 min，此時理論提取率為59.79%。考慮到實際操作，調(diào)整為溫度45℃、pH 值11.5、料液比1:10 g/mL 和提取時間60 min，并在此條件進(jìn)行驗證試驗和對比試驗，結(jié)果如表6 所示，堿性電解水的蛋白提取率為59.34%與預(yù)測值相差不大，表明該模型可用于預(yù)測和分析堿性電解水提取冷榨菜籽蛋白工藝。由對比試驗可知，ARP 提取率比URP 高8.62 個百分點，這是由于堿性電解水具有小分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，表面張力低，滲透性強(qiáng)，且含有較多OH-促進(jìn)H+脫離碳原子和硫酸鹽基團(tuán)以及氫鍵斷裂[15]，增加了蛋白質(zhì)表面電荷數(shù)，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)間靜電斥力和水合作用[17]，使溶解度增加。與URP相比，每處理1 kg 菜籽餅，可減少1.28 g NaoH 用量。Li[17]等研究表明超聲輔助堿性電解水提取南極磷蝦蛋白質(zhì)可以減少30.9%氫氧化鈉消耗量。Watanbe 等[33]在不添加酸或堿情況下，通過電解不同電解質(zhì)來調(diào)節(jié)溶液pH值，不僅提高了米糠蛋白提取率，而且還減少了蛋白脫鹽。且因其活性成分不穩(wěn)定，易與光、空氣及有機(jī)物等接觸逐步放電分解，其ORP 值逐漸下降并趨于正常，還原為普通的水[16]。因而較NaOH 使用安全可靠。

表6 電解水與純水提取冷榨菜籽蛋白試驗對比Table 6 Comparison of the experiment between ARP and URP of extraction rapeseed protein

2.3 不同提取方法對菜籽蛋白理化性質(zhì)影響

2.3.1 不同提取方法對菜籽蛋白色澤的影響

使用色差儀CM-5 測定菜籽蛋白色澤，結(jié)果如表7所示，堿性電解水對菜籽蛋白的L*，a*和b*值均有顯著作用（P<0.05）。結(jié)果表明堿性電解水能增加菜籽蛋白的亮度，降低紅色偏向和黃色偏向，使蛋白色澤更淺。

表7 不同提取方法對菜籽蛋白色澤的影響Table 7 Effects of extraction method on the colour of rapeseed protein

2.3.2 不同提取方法對菜籽蛋白組成的影響

據(jù)報道，菜籽蛋白主要包含12S 球蛋白（44.3～66.4 kDa），球蛋白由α-肽鏈（30.0～40.0 kDa）和β-多肽（20.0 kDa）鏈，以及1.7/2S 白蛋白（約為14 kDa）。由圖2 可知，ARP 與URP 分子量分布集中在14、20～30、32～66.4 kDa 之間，兩者分子量無顯著差異；其中ARP蛋白質(zhì)條帶較URP 蛋白質(zhì)條帶明顯，這是由于蛋白質(zhì)在高堿性提取條件下發(fā)生水解[23]。

由表8 可知，ARP 純度比URP 高，且天冬氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、疏水性氨基酸和酸性氨基酸含量顯著高于URP（P<0.05），谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和堿性氨基酸含量顯著小于URP（P<0.05）。另外ARP 中半胱氨酸和甲硫氨酸含量顯著高于URP（P<0.05），這可能是因為半胱氨酸是對氧化修飾最敏感的氨基酸，且二硫鍵在多肽鏈半胱氨酸之間形成[34]。

表8 菜籽蛋白氨基酸組成分析Table 8 Analysis of the amino acid composition of rapeseed protein

2.3.3 不同提取方法對菜籽蛋白理化特性的影響

ARP 法疏水性為(50.92±2.3)μg 顯著大于URP 法疏水性(40.70±2.33)μg（P<0.05），這與李志豪等[15]研究結(jié)果一致，這可能是電解水中離子之間通過靜電屏蔽效應(yīng)，使膠體顆粒表面電勢降低而非極性基團(tuán)疏水作用增強(qiáng)[35]。

ARP 法總巰基含量和游離巰基含量分別為22.64 和16.88μmol/g 均顯著大于URP 法的20.43 和15.00μmol/g（P<0.05），且ARP 法中的二硫鍵含量2.88μmol/g 略高于URP 法2.72μmol/g，這與表8 中ARP 法半胱氨酸含量顯著大于URP 法結(jié)果一致。

由圖3 可知，ARP 顆粒大小分布在8.72～15.70 和91.30～396.00 nm 之間；URP 顆粒大小分布在11.70～18.20 和122.00～459.00 nm 之間。結(jié)果表明ARP 粒徑比URP 小，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間相互作用[15]，增加其乳化性。這可能是提取過程中添加的堿液使菜籽蛋白肽鏈裂解，導(dǎo)致菜籽蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出的疏水基團(tuán)之間的相互作用加強(qiáng)[20]，且URP 疏水性小于ARP，URP 更易形成可溶性聚集體，導(dǎo)致粒徑增大。

蛋白質(zhì)是一種含有極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，極性基團(tuán)在溶液中暴露出出來，使蛋白質(zhì)表面帶電，ζ電位可以很好表征蛋白質(zhì)溶液性質(zhì)。在中性磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH=7.0）中ζ均為負(fù)值，這表明菜籽蛋白負(fù)電荷氨基酸大余正電荷氨基酸，且ARPζ絕對值11.90 mV 顯著大于URPζ絕對值10.17 mV（P<0.05）。

2.3.4 不同提取方法對菜籽蛋白結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)常用酰胺I 帶（1 600～1 700 cm-1）來反映，其中α-螺旋和β-折疊為有序結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲為無序結(jié)構(gòu)。由表9 可得，與URP 二級結(jié)構(gòu)相比，ARP 中β-折疊相對含量增加，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲降低，且ARP 中α-螺旋和β-折疊之和顯著大于URP，這表明ARP 結(jié)構(gòu)更加有序。

表9 不同提取方法對菜籽蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 9 Effects of extraction methods on the secondary structure of rapeseed protein

熒光光譜法可以探測蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的微環(huán)境變化，并可以用于研究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)（折疊、解折疊和聚集）變化[36]。熒光強(qiáng)度或發(fā)射波長最大值變化表明色氨酸殘基微環(huán)境變化。由圖4 可知，URP 與ARP 熒光光譜形狀無變化，而ARP 熒光強(qiáng)度大于URP，這表明菜籽蛋白構(gòu)象發(fā)生了變化，堿性電解水可以引起菜籽蛋白去折疊，暴露出更多疏水基團(tuán)，這與ARP 疏水性大于URP結(jié)果一致。

2.3.5 不同提取方法對菜籽蛋白功能特性的影響

由圖5a 可知ARP 溶解度38.40%顯著大于URP 30.62%（P<0.05），這是因為蛋白質(zhì)在強(qiáng)離子強(qiáng)度條件下三級結(jié)構(gòu)容易變得松散和拉伸，從而提高了溶解度[37]。持水性和持油性可以增強(qiáng)食品特性和口感，由5b 可知ARP 持油性2.41 g/g 顯著大于URP 持油性1.86 g/g（P<0.05），而ARP 持水性0.92 g/g 顯著小于URP 持水性1.12 g/g（P<0.05），這是因為ARP 表面疏水性強(qiáng)，且ARP 二硫鍵多，截留水分能力下降，導(dǎo)致水合能力下降。乳化性主要依賴于蛋白質(zhì)分子在油水界面的擴(kuò)散，由圖5c 可得ARP 乳化性（35.13 m2/g）略大于URP（32.92 m2/g），而其乳化穩(wěn)定性19.84 min 顯著小于URP 30.81 min（P<0.05），這與李志豪[15]等研究結(jié)果一致，這是因為電解質(zhì)促使菜籽蛋白肽鏈在提取過程中斷裂，溶解度提高，且可溶性蛋白粒徑小，表面積大，促進(jìn)了蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間相互作用[20]。由圖5d 可知，ARP 起泡性52.92%顯著大于URP 47.17%（P<0.05），而其泡沫穩(wěn)定性53.09%小于URP 64.50%（P<0.05），這是由于ARP游離巰基多，表面疏水性強(qiáng)，且疏水性氨基酸含量多，導(dǎo)致疏水相互作用增強(qiáng)[15]。

3 結(jié) 論

1）在單因素基礎(chǔ)上，通過四因素三水平JMP-Box-Behnken 試驗設(shè)計得到堿性電解水對冷榨菜籽蛋白提取優(yōu)化工藝為：溫度45 ℃、pH 值11.5、料液比1:10 g/mL 和提取時間60 min，提取率為59.34%。

2）在優(yōu)化條件下，堿性電解水提取冷榨菜籽餅分離蛋白（Alkaline electrolyzed water extracted Rapeseed Protein，ARP）提取率比堿溶酸沉法提取菜籽分離蛋白（Ultrapure water extracted Rapeseed Protein，URP）高8.62 個百分點，且純度高；溶解性、持油性、乳化性和起泡性均顯著高于URP（P<0.05），同時ARP 粒徑分布范圍小，表面疏水性、ζ電位絕對值、游離巰基和二硫鍵含量均高于URP，二級結(jié)構(gòu)更有序。此外堿性電解水制備簡單，成本低廉，在提取過程可減少酸堿液用量，對環(huán)境友好。