夾帶劑對超臨界萃取技術(shù)處理肌腱的影響△

駱井萬，胡 凱，，李 淼，，汪晶晶，，李 矛，陳維明，，白玉龍，*，陳金發(fā)

（1常州市亙從生物力學(xué)研究中心，江蘇常州213003；2上海亞朋生物技術(shù)有限公司，上海201201；3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，北京100730）

臨床上肌腱和韌帶損傷非常常見，尤其是在高危人群亞群中，如新兵、娛樂和精英跑步者以及職業(yè)運動員［1，2］。運動醫(yī)學(xué)科和手外科對肌腱移植材料的需求最大［3］。目前肌腱移植材料主要分為自體肌腱、同種異體肌腱、組織工程肌腱以及人工肌腱等［4］。自體肌腱被認(rèn)為是肌腱大面積缺損移植的金標(biāo)準(zhǔn)。自體肌腱移植雖排斥反應(yīng)較小，但因其來源有限且有創(chuàng)，無法滿足臨床需要［5，6］。同種異體肌腱移植可以避免上述缺點，實現(xiàn)肌腱較好的愈合，但由于免疫原性以及疾病傳播風(fēng)險等因素導(dǎo)致其使用受到阻礙［7］。肌腱的抗原性主要源自細胞、血液等成分，因此組織清潔和脫細胞是減輕抗原性的必要措施。本研究采用添加不同夾帶劑的超臨界萃取技術(shù)（supercritical CO2fluid extraction,SCCO2）對同種異體肌腱進行一步法脫細胞處理，以期在不損害其生物力學(xué)性能的情況下有效的縮短處理時間，制備生物相容性良好和脫細胞化的同種異體肌腱。

1 資料與方法

1.1 材料制備

將肌腱原料去除肌肉等軟組織后純化水漂洗三遍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜黾‰觳牧嫌缮虾喤笊锛夹g(shù)有限公司提供，常規(guī)作血型檢查，各型肝炎病毒、HIV病毒等傳染性疾病的檢測合格。

超臨界萃取條件：同種異體肌腱室溫下解凍，包裝于特衛(wèi)強袋中，裝載到壓力容器中，在37°C和35 MP下，分別加入以下不同夾帶劑后，保溫保壓2 h，再萃取2 h。在30 min內(nèi)緩慢減壓，取出肌腱并進行兩層密封備用。

A組：-80℃?zhèn)溆眉‰欤唇?jīng)處理；B組：SCCO2處理，且夾帶劑為無水乙醇；C組：SCCO2處理，且夾帶劑為無水乙醇+1%乙二胺四乙酸；D組：SCCO2處理，且夾帶劑為環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷共聚醚二醇（ethylene oxide/propylene oxide polyether glycol,EO/PO）。

1.2 力學(xué)性能測試

采用萬能材料試驗機（型號CTM8010，上海協(xié)強儀器制造有限公司），作勻速單軸加載試驗，速度20 mm/min。同種異體肌腱兩端2 cm處用濕潤的紗布包裹，增加力學(xué)機夾具的摩擦力，對樣品進行拉伸直至斷裂，每組樣品重復(fù)測量數(shù)量為5根。

1.3 組織學(xué)觀察

同種異體肌腱15 min復(fù)水之后，經(jīng)10%甲醛固定24 h以上，脫水、透明、石蠟包埋，肌腱縱切面切片，隨機取三個不同的層面進行切片，按常規(guī)方法進行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡400倍視下進行形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 體外細胞增殖測試

將兩層密封的A-D組的同種異體肌腱，放于紫外下照射30 min后備用。

將1×105個/ml小鼠成纖維細胞L929細胞懸液以每孔100 μl接種于96孔板中，并在細胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2，＞90%濕度）中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長至80%左右，棄去96孔板內(nèi)原培養(yǎng)基，在96孔板相應(yīng)孔內(nèi)各加入100 μl 100%同種異體肌腱浸提液（A-D組）和陽性組（5% DMSO），以及陰性組（不加任何樣品）。每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后取出96孔板，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，然后去除液體，每孔加入50 μl MTT（終濃度為1 mg/ml），置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2小時后去除上清，每孔加入100 μl異丙醇溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測定570 nm波長下的吸光度值，計算其細胞毒性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 8.5軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體外觀

經(jīng)SCCO2處理的同種異體肌腱表現(xiàn)出明顯的干燥脫水現(xiàn)象，且較為堅硬，不易形變，浸泡在純化水中至少15分鐘后，肌腱才恢復(fù)典型的白色或淺黃色和光澤紋理，且較為柔軟。

2.2 力學(xué)性能

四組肌腱力學(xué)檢測結(jié)果見表1。四組同種異體肌腱的最大載荷差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與A組相比，D組的抗拉強度變?。≒＞0.05），且彈性模量顯著變小以及斷裂伸長率顯著增大（P＜0.05）。D組的抗拉強度小于B組和C組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），D組的彈性模量小于 B組和 C組（P＞0.05），但斷裂伸長率顯著大于B組和C組（P＜0.05）。

表1 四組同種異體肌腱的力學(xué)測試結(jié)果（±s）與比較

表1 四組同種異體肌腱的力學(xué)測試結(jié)果（±s）與比較

*，#表示與D組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

images/BZ_58_240_416_558_483.png最大載荷（N）彈性模量（MPa）images/BZ_58_558_416_902_483.png736.12±66.49 448.79±146.92*images/BZ_58_902_416_1278_483.png894.51±159.09 431.53±114.93images/BZ_58_1278_416_1663_483.png777.05±146.17 439.45±118.86images/BZ_58_1663_416_2028_483.png755.75±60.04 284.84±78.19images/BZ_58_2028_416_2311_483.pngimages/BZ_58_240_549_558_615.pngimages/BZ_58_558_549_902_615.pngimages/BZ_58_902_549_1278_615.pngimages/BZ_58_240_682_558_748.pngimages/BZ_58_558_682_902_748.pngimages/BZ_58_1278_549_1663_615.pngimages/BZ_58_1663_549_2028_615.pngimages/BZ_58_2028_549_2311_615.pngimages/BZ_58_902_682_1278_748.pngimages/BZ_58_1278_682_1663_748.pngimages/BZ_58_1663_682_2028_748.pngimages/BZ_58_2028_682_2311_748.png0.179 0.127

2.3 組織形態(tài)學(xué)

四組肌腱組織切片HE染色結(jié)果見圖1?？梢娢唇?jīng)處理的同種異體肌腱（A組）具有明顯的肌腱細胞存在，細胞結(jié)構(gòu)細長且沿著肌腱纖維縱向排列分布。而添加無水乙醇、無水乙醇+1%EDTA的SCCO2技術(shù)處理的同種異體肌腱（B組，C組）具有少量的細胞存在，并不能達到完全脫細胞效果。添加EO/PO的SCCO2處理的同種異體肌腱（D組）則無細胞和細胞核存在，只有細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，表明此方法能有效的脫細胞。同時所有經(jīng)SCCO2處理的同種異體肌腱纖維組織排列整齊且未被破壞。

圖1 各組肌腱組織學(xué)觀察（HE，×400） 1a:A組（單純冷凍），可見大量細胞 1b:B組（無水乙醇SCCO2處理），組織結(jié)構(gòu)完整，但細胞成份顯著減少 1c:C組（EDTA-SCCO2處理），組織結(jié)構(gòu)完整，細胞成份明顯減少 1d:D組（EO/PO-SCCO2處理），組織結(jié)構(gòu)完整，細胞消失

2.4 體外細胞增殖試驗

體外細胞增殖試驗結(jié)果見圖2，L929細胞在A組和經(jīng)SCCO2處理的同種異體肌腱B-D組條件中，24 h的細胞增殖吸光度值分別為（0.88±0.12）、（0.87±0.08）、（0.92±0.15）和（0.92±0.12），與陰性對照組（1.00±0.19）的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與陽性對照組（0.32±0.10）的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 同種異體肌腱24 h細胞增殖情況圖

3 討論

限制同種異體肌腱應(yīng)用主要有兩方面因素:（1）肌腱本身的免疫原性；（2）經(jīng)處理后肌腱的強度變化。本質(zhì)上說肌腱在體內(nèi)就是起到力量傳遞作用，所以肌腱本身必須保持一定的抗拉伸強度及韌度，否則將直接導(dǎo)致手術(shù)的失?。?，9］。同時脫細胞化是軟組織移植制造中的關(guān)鍵步驟。目前使用的物理（如反復(fù)凍融）和化學(xué)處理技術(shù)（如十二烷基硫酸鈉）對同種異體肌腱生物力學(xué)性能的有害影響已經(jīng)引起了人們的關(guān)注，這可能導(dǎo)致臨床性能不佳和移植失?。?0］。

最近的研究顯示，超臨界二氧化碳是一種可替代傳統(tǒng)滅菌方式的溫和滅菌方法，在超臨界狀態(tài)下，CO2具有低粘度和零表面張力的特點，具有穿透復(fù)雜結(jié)構(gòu)和多孔材料的能力［11］。低表面張力促進CO2滲透到生物材料中，這使得材料在結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)保持完整的情況下并達到高效滅菌的效果［12，13］。另外由于SCCO2對非極性和極性分子的溶解能力體現(xiàn)在生物材料中各種活性成分的浸漬過程中，從組織中去除細胞成分而獲得細胞外基質(zhì)，因此超臨界二氧化碳具有很好的脫脂效果［14］。使用合適的夾帶劑可以提高超臨界二氧化碳浸潤和萃取效果以及脫細胞效果，研究中發(fā)現(xiàn)B組，C組可見少量細胞核，D組未觀察到細胞核和細胞殘余現(xiàn)象，只觀察到紅色的細胞外基質(zhì)，表明此方法獲得了理想的脫細胞材料。從脫細胞作用機理來看，無水乙醇作為一種有機溶劑，使得細胞脫水、溶解和去除脂質(zhì)而裂解［15］，EDTA是一種能與Mg、Ca等二價金屬離子結(jié)合的螯合劑。由于多數(shù)核酸酶類和有些蛋白酶類的作用需要這些二價金屬，因此通過破壞酶類活動達到降低細胞對細胞外基質(zhì)的黏附［16］。EO/PO是一種醚類非離子表面活性劑且具有良好的生物相容性，通過破壞DNA-蛋白、脂質(zhì)和脂質(zhì)蛋白的相互作用來脫細胞［10，17］，使組織或器官中的蛋白質(zhì)在經(jīng)過非離子型表面活性劑處理后仍留有功能性的構(gòu)象。相比于無水乙醇和EDTA，EO/PO對肌腱的滲透和溶解細胞能力更強，更容易達到脫細胞的效果。同時進一步驗證基于SCCO2處理的肌腱的細胞毒性，通過細胞毒性測試結(jié)果表明經(jīng)SCCO2處理的同種異體肌腱與陰性組無顯著性差異（P＜0.05），表明該方法不會導(dǎo)致細胞毒性，有利于細胞增殖與生長。

肌腱移植材料最重要的是要具備良好的生物力學(xué)性能，以降低手術(shù)失敗率［3，18］。與A組肌腱相比，在使用不同夾帶劑的SCCO2處理的同種異體肌腱在最大載荷和抗拉強度均無顯著性差異，這一定程度上證實了SCCO2脫細胞方法能夠保持肌腱的機械完整性。這一發(fā)現(xiàn)與之前關(guān)于SCCO2處理的肌腱和膠原軟組織的研究結(jié)果一致［19］，從HE染色結(jié)果可以看出不同夾帶劑SCCO2處理的同種異體肌腱纖維組織排列整齊無斷裂，從而最大程度地保留了超微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性。這從側(cè)面印證了SCCO2處理方法對肌腱的最大載荷和抗拉強度無影響，但添加EO/PO的SCCO2處理的同種異體肌腱，彈性模量顯著變小以及斷裂伸長率有明顯的增大。可能是無水乙醇使得膠原蛋白變性的作用導(dǎo)致肌腱硬度增加。而EO/PO則破壞脂質(zhì)和脂質(zhì)蛋白的連接從而降低肌腱的硬度，同時斷裂伸長率有所提高。

綜上所述，使用不同夾帶劑（無水乙醇，無水乙醇+1%EDTA，EO/PO）的SCCO2處理的同種異體肌腱，在保留了原有的肌腱纖維和良好的生物力學(xué)性能的同時，通過達到了有效的脫細胞效果，有利于降低其免疫原性且具有良好的生物相容性。SCCO2是一種相對較好的肌腱制備方法，為同種異體肌腱制備的進一步研究奠定理論基礎(chǔ)。