H3N2亞型犬流感病毒頭部缺失血凝素蛋白的真核表達及抗原性研究

李思宇，趙丹，溫霞，劉永杰

(南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

犬流感是由犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)引起的以流涕、咳嗽、發(fā)熱，甚至死亡為主要臨床表現(xiàn)的一種病毒性疾病[1]。2004年在美國的佛羅里達州，H3N8亞型流感病毒由馬傳播至犬，引起犬呼吸系統(tǒng)疾病，并在犬群內傳播，被命名為“H3N8亞型犬流感病毒”[2]；隨后，在韓國[3]、中國[4]、泰國[5]以及美國[6]等多個國家和地區(qū)相繼出現(xiàn)了H3N2亞型犬流感病毒的報道。近年來，還發(fā)現(xiàn)了許多其他亞型，如H1N1、H5N1、H5N2、H10N8等流感病毒感染犬[7]，特別是不同亞型流感病毒感染犬后可出現(xiàn)基因重組現(xiàn)象，如Song等[8]分離出的H3N1亞型流感病毒為H1N1(CA/09)及H3N2亞型病毒重組的結果。CIV不僅對犬的生存和健康帶來嚴重危害，同時也給人類健康帶來巨大的風險。犬是人類最親密的伴侶動物，與人密切接觸機會較多，存在犬作為中間宿主將流感病毒傳播給人的風險。因此開展犬流感的防控研究具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

疫苗免疫是防控流感最有效的手段。由于可感染犬的流感病毒亞型較多，針對某一特定亞型的犬流感疫苗保護范圍較小，研制一種可抵御不同亞型流感病毒感染的廣譜疫苗已成為目前的研究熱點。流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)的莖部區(qū)域較為保守，是研制流感通用亞單位疫苗的理想靶向區(qū)域[9]。為減少HA頭部區(qū)免疫顯性帶來的影響，本研究將HA基因的頭部區(qū)去除，使得免疫應答定向在HA保守莖部結構域，從而為研發(fā)具有更廣泛保護作用的犬流感廣譜疫苗，抵御多種亞型流感病毒的感染奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株、細胞及實驗動物

H3N2亞型CIV毒株A/Canine/Jiangsu/06/2010的血凝素基因HA，GenBank序列號為JN247619，由Lin等[10]分離；H1N1亞型人源流感病毒毒株A/Jiangsu/1/2009 (H1N1)，由江蘇省疾病預防控制中心祁賢研究員饋贈；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞，購自上海唯地生物科技有限公司；草地貪夜蛾細胞(sf-9)由江蘇省農科院獸醫(yī)研究所王永山研究員饋贈；犬胚胎腎細胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)，購自ATCC并由本實驗室保存；6周齡雌性BALB/c小鼠購自揚州大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑

抗His-Tag鼠單克隆抗體，購自艾比瑪特(Abmart)生物醫(yī)藥(上海)有限公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG 抗體、硝酸纖維素膜(NC)，購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；His(組氨酸)蛋白純化鎳柱、超靈敏化學發(fā)光檢測試劑盒，購自上海雅酶生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，購自Gibco公司；cDNA反轉錄試劑盒、DNA連接試劑盒、2×PCR Mix、高保真酶Prime STAR HS、EcoRⅠ、X-gal、IPTG、反轉錄酶 (M-MLV) 、pMD19-T Simple Vector試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；BAC/PAC DNA Isolation Kit、RNA提取試劑盒，購自Omega公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；pFastBac HTA質粒購自上海唯地生物科技有限公司。H3N2亞型CIV陰、陽性抗小鼠血清由南京農業(yè)大學獸醫(yī)微生物學實驗室保存。

1.3 病毒RNA的反轉錄

根據(jù)Geneaid病毒RNA提取試劑盒說明書操作。提取H3N2亞型CIV病毒RNA，并以其為模板，進行反轉錄。采用20 μL反轉錄體系：4 μL 4×gDNA wiper Mix，1 μL Uni12，1 pg～1 μg RNA，用移液器輕輕吹打混勻，于PCR儀中42 ℃加熱2 min；在上述體系再加入5 μL 5×HisScript Ⅱ Select qRT SuperMix Ⅱ，上述溶液混合均勻后于PCR儀中50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，產物即為cDNA，于-20 ℃保存。

1.4 頭部缺失HA基因片段的克隆與鑒定

1.4.1 引物的設計與合成

根據(jù)HA基因(GenBank登錄號JN 247619)設計引物，見表1。優(yōu)化的頭部區(qū)去除的HA片段構建見圖1。用四甘氨酸接頭肽取代位于C 52～C 277的HA球狀頭部結構域(紅色區(qū)域)；片段1為四甘氨酸接頭肽前的HA莖部區(qū)域；為保證頭部缺失HA片段蛋白質的正確折疊[11]，將T4折疊三聚體結構序列基因分成4段，通過引物合成的方式分別加在片段2、片段3、片段4和片段5的下游引物序列中，得到含T4折疊三聚體結構(以下簡稱為T4)的頭部區(qū)去除HA片段；片段2：片段1+HA2+T4 的前27個堿基；片段3：片段2+T4的28～55個堿基；片段4：片段3+T4的56～77個堿基；片段5：片段4+T4的78～81個堿基；片段6：含T4結構的頭部去除區(qū)HA片段。所用引物序列信息見表1，所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.4.2 頭部缺失HA片段的基因擴增與克隆

以反轉錄回收的cDNA為模板，以HA1-1-F、HA1-1-R為引物擴增片段1，以HA2-T4(27)-F、HA2-T4(27)-R為引物擴增片段2；以片段2為模板，以HA2-T4(55)-F、HA2-T4(55)-R為引物擴增片段3；以片段3為模板，用HA2-T4(77)-F、HA2-T4(77)-R為引物擴增片段4；以片段4為模板，用HA2-T4-F、HA2-T4-R為引物擴增片段5；將片段1和片段5進行融合PCR，用1%的瓊脂糖凝膠分別對產物進行電泳，按照DNA膠回收試劑盒步驟回收純化得到906 bp大小的片段6。將片段6同源重組連接到pMD19-T載體中，轉化至大腸桿菌DH5α；藍白斑篩選白色菌落，菌液PCR鑒定正確的質粒送測序，測序正確得到含T4結構的頭部缺失HA片段質粒，命名為T-HAj-T4。

1.5 重組桿狀病毒轉移載體及穿梭質粒的構建

按照質粒提取試劑盒說明書提取T-HAj-T4質粒，用EcoR和XhoⅢ限制性核酸內切酶對T-HAj-T4和pFastBac HTA質粒進行酶切，膠回收目的片段，按分子克隆法連接、轉化，在氨芐霉素平板上挑取單菌落，酶切鑒定，陽性質粒命名為HAj-T4-pFastBac。將HAj-T4-pFastBac轉化至含Bacmid DNA和Helper plasmid的DH10Bac感受態(tài)，在LB培養(yǎng)基中于37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，用LB培養(yǎng)液稀釋至10-2，涂布卡那霉素(50 mg/L)、慶大霉素(7 mg/L) 、四環(huán)素(10 mg/L) 3種抗性的平板(含100 mg/L X-gal和40 mg/L IPTG),藍白斑篩選, 挑取白色菌落，用流感病毒通用引物M 13(上游5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′，下游5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)進行PCR鑒定，鑒定正確的質粒命名為HAj-T4-DH10，空載體質粒pFastBac HTA作為陰性對照。

表1 引物序列

圖1 頭部去除區(qū)HA片段的設計及優(yōu)化

1.6 穿梭質粒轉染昆蟲細胞

用BAC/PAC DNA Isolation Kit質粒提取試劑盒抽提HAj-T4-DH10質粒。按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System說明書步驟將穿梭質粒HAj-T4-DH10轉染至對數(shù)生長期的昆蟲細胞sf-9，另一加入等量脂質體的細胞孔作為陰性對照，72 h后在顯微鏡下觀察細胞有無病變。當細胞發(fā)生明顯病變后, 收集細胞上清，即為第1代重組桿狀病毒，命名為P1-HAj-T4。用第1代重組病毒感染對數(shù)生長期的sf-9昆蟲細胞，72 h后收集細胞上清，為第2代重組桿狀病毒。按此方法獲得第3代病毒P3-HAj-T4。試驗同步設立未插入目的基因片段的空載體質粒pFastBac HTA轉染sf-9細胞作為對照。

1.7 頭部缺失HA片段在昆蟲細胞中的表達

用第3代重組病毒P3-HAj-T4感染對數(shù)生長期的sf-9昆蟲細胞，72 h后分別收集上清和細胞沉淀。用Binding Buffer按照原體積的1%重懸細胞沉淀后進行超聲破碎，離心去除沉淀，使用His蛋白純化鎳柱進行蛋白純化。

1.8 穿梭質粒在昆蟲細胞中的表達產物鑒定

將純化后的頭部缺失HA結構蛋白與 SDS蛋白上樣緩沖液按照4∶1混合，沸水煮樣5 min，濃縮膠電壓80 V，分離膠120 V進行SDS-PAGE，電泳后切下包含目的蛋白大小位置的凝膠。按照0.8 mA/cm2通電轉印1.5 h，將蛋白轉印至NC膜上后，用5%的脫脂乳4 ℃封閉過夜，分別與抗His標簽抗體、CIV全病毒抗體室溫結合1 h，PBST洗滌3次后，與HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶2 000) 室溫結合1 h。PBST洗滌3次。應用超靈敏ECL發(fā)光液為底物溶液顯色5～30 min后進行曝光顯色觀察。

1.9 小鼠血清抗體的制備

取10只6周齡雌性BALB/c小鼠，后腿部肌肉注射純化后的頭部缺失HA蛋白，首次免疫劑量為100 μg/只，二免和三免的免疫劑量為150 μg/只；每組小鼠均免疫3次，每次免疫間隔14 d。收集三免后14 d的小鼠血清，以10 μg/mL的頭部缺失HA蛋白包被酶標板，4 ℃過夜，用5%脫脂乳37 ℃封閉2 h。將待測血清2倍比稀釋后按100 μL/孔加入96孔反應板中，設立陰性對照及小鼠陽性血清對照，37 ℃孵育1.5 h后洗滌，加入1∶5 000稀釋的HRP標記山羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1.5 h后洗滌。最后加入TMB單組分顯色液顯色，2 mol/L硫酸終止液終止顯色，用酶標儀讀取每孔的OD450值。

1.10 血清抗體的中和試驗

為了驗證頭部缺失HA結構蛋白血清中抗體能否抑制不同亞型流感病毒感染所致的細胞病變效應(CPE)，在MDCK細胞上進行了微量細胞中和試驗。將免疫組小鼠的血清抗體起始濃度調整為1 mg/mL，在1.5 EP管中預先進行2倍比稀釋，100 μL/孔，每個稀釋度做3個重復，計算所需用量，分別加入96孔板中。將實驗室保存的甲型H1N1流感病毒稀釋至200TCID50，100 μL/孔加入不同稀釋度的血清抗體，37 ℃靜置孵育1 h后，吸出每孔內液體，加至匯合度為80%左右MDCK細胞的96孔板中，同時設置陽性對照(已知陽性抗體)、病毒對照(只加病毒)及空白對照(只加培養(yǎng)液)。觀察CPE產生情況；同樣的方法觀察血清抗體與實驗室保存的甲型H3N2流感病毒的作用情況。中和效價以抗體中和病毒使50%細胞不產生病變的最高稀釋度來表示[12]。

2 結果

2.1 頭部缺失HA片段基因的擴增

提取病毒總RNA，以反轉錄回收的cDNA為模板，分別擴增得到片段1、片段2、片段3、片段4和片段5，片段1和片段5進行PCR融合得到片段6(頭部缺失HA片段)(圖2)。

2.2 重組供體質粒的鑒定

使用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切重組供體質粒HAj-T4-pFast Bac，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析可見4 790 bp大小的載體片段和906 bp大小的目的基因片段(見圖3)。

2.3 重組穿梭質粒的鑒定

重組穿梭質粒HAj-T4-DH10經(jīng)M13引物特異性擴增，瓊脂糖凝膠電泳分別得到3 300 bp大小的條帶。未插入目的片段的pFastBac HTA空載體質粒陰性對照經(jīng)PCR擴增得到的片段大小為2 430 bp(圖4)。

M. DNA分子量標準(DL2000)；1～6. 分別為片段1～片段6

M. DNA分子量標準(DL5000)；1. 雙酶切的HAj-T4-pFast Bac質粒

M. DNA分子量標準(DL5000)；1～4. HAj-T4-DH10質粒；5～8. pFastBac HTA-DH10載體質粒

2.4 重組桿狀病毒的鑒定

正常sf-9細胞貼壁生長，呈多角形(圖5A)；穿梭質粒轉染sf-9細胞后第3天，細胞出現(xiàn)脫落、漂浮、破碎等(圖5B)，表明細胞被重組桿狀病毒侵襲。

A. 正常細胞；B. 重組穿梭質粒轉染昆蟲細胞第3天

2.5 重組蛋白的表達與檢測

采用SDS-PAGE分析頭部缺失HA蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)純化的蛋白在47 ku大小的位置上出現(xiàn)單一條帶(圖6A)，大小與預期蛋白分子量相符；采用His標簽抗體作為一抗進行Western blot分析(圖6B)，進一步證實蛋白成功表達；頭部缺失HA蛋白經(jīng)CIV全病毒抗體Western blot驗證(圖6C)，表明其具有良好的免疫反應性。

A. 表達蛋白的SDS-PAGE分析：M. 蛋白Marker；1. 感染pfastBac HTA空載毒的細胞超聲破碎產物；2. 純化的頭部缺失HA蛋白；3. 細胞上清液；4. 未純化的頭部缺失HA蛋白

2.6 間接ELISA法測定小鼠免疫血清抗體

用純化的頭部缺失HA蛋白包被酶標板，以小鼠三免后第14天的血清作為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體作二抗，進行ELISA效價測定，結果顯示免疫組小鼠血清抗體具有較高的效價，為1∶12 800。表明純化的頭部缺失HA蛋白對小鼠具有良好的免疫原性，可誘導小鼠產生特異性抗體。

2.7 頭部缺失HA結構蛋白血清抗體的中和活性測定

正常的MDCK細胞呈長梭形單層上皮樣細胞形態(tài)(圖7A)。當H3N2亞型毒株A/Canine/Jiangsu/06/2010感染MDCK細胞后出現(xiàn)明顯細胞病變(圖7B)，血清抗體稀釋320倍時(圖7C),MDCK細胞無明顯細胞病變；而當血清抗體稀釋640倍時(圖7D)，部分細胞發(fā)生病變。因此頭部缺失HA蛋白制備的小鼠抗血清對H3N2亞型流感病毒感染引起的細胞病變效應有一定的抑制作用，其中和效價為1∶320。

A. 正常細胞組；B.H3N2病毒對照組；C. 1∶320稀釋血清抗體組(H3N2感染)；D. 1∶640稀釋血清抗體組(H3N2感染)；E. H1N1病毒對照組；F. 1∶160稀釋血清抗體組(H1N1感染);G. 1∶320稀釋血清抗體組(H1N1感染)

當H1N1亞型毒株A/Jiangsu/1/2009(H1N1)感染的陽性對照出現(xiàn)明顯細胞病變(圖7E),血清抗體稀釋160倍時(圖7F),MDCK細胞無明顯細胞病變；而當血清抗體稀釋320倍時(圖7G)，部分細胞發(fā)生病變。因此頭部缺失HA結構小鼠血清抗體對H1N1亞型流感病毒感染引起的細胞病變效應有一定的抑制作用，其中和效價為1∶160。

3 討論

犬流感是一種新發(fā)傳染病，由于其在公共衛(wèi)生上的重要意義，開展疫苗研究防控犬流感病毒的傳播和流行勢在必行。目前對CIV疫苗研究已取得一些進展，主要集中在全病毒滅活苗上。2009年，美國農業(yè)部批準的H3N8亞型CIV疫苗上市，有效減少了該亞型病毒的傳播；2012年，韓國針對H3N2 CIV的疫苗獲得授權；2016年美國農業(yè)部批準H3N2犬流感疫苗上市。盡管目前流行的犬流感病毒以H3亞型為主[13]，但由于流感病毒變異非?？欤⑷菀装l(fā)生重組，因此研發(fā)一種能夠針對不同亞型或同一亞型不同突變株提供最大限度保護作用的通用疫苗非常必要。

2004年，在犬體內發(fā)現(xiàn)馬源犬流感病毒后，人源、豬源、禽源等多種不同動物來源的犬流感病毒相繼出現(xiàn)[14]。這些病毒在犬體內復制、重配，甚至通過犬傳播至其他宿主，對其他動物造成威脅。犬源H3N2與人源H1N1病毒的基因片段具有高度相容性，北美三重配體H3N2、歐亞類禽H1N1和pdm09/H1N1三種流感病毒在豬體內重配產生獨立的兩種H1N1流感病毒，感染犬后與H3N2病毒重配產生豬源重配犬流感病毒H1N1[7]。該豬源CIV對人類的威脅更為嚴重，對人類的適應性較強，能在人體內成功復制，因此重組H1N1 CIV 病毒能跨種傳播至人類。目前在犬體內流行較為常見的亞型為H3N2，而H1N1亞型在人類較為多見，因此本試驗以犬源H3N2和人源H1N1亞型流感病毒為研究對象，探究頭部缺失HA的血清抗體抵御病毒感染的能力，為后續(xù)研發(fā)具有廣譜性保護作用的頭部缺失HA亞單位疫苗奠定基礎。

目前已有的流感疫苗誘導產生的抗HA抗體大多針對HA頭部，研究表明針對相對保守的HA莖部的廣譜中和抗體能中和不同亞型的流感病毒，是近年來流感疫苗研究的一個熱點[15]。Wang等[16]根據(jù)廣譜單克隆抗體12D1的結合表位設計并合成了基于HA2的多肽疫苗，證實該疫苗能保護小鼠抵抗H3N2、H1N1和H5N1等亞型流感病毒的感染，為廣譜流感疫苗的設計提供參考。連接HA1半胱氨酸 C52和C277的保守二硫鍵的側翼環(huán)狀結構構成了HA球形頭部結構域的主體，而HA1的N51和C52氨基酸從半胱氨酸橋向下延伸并形成莖部區(qū)域[17]。由于C52和C277在HA的三維結構中接近，有研究表明用短接頭肽取代中間環(huán)不會破壞分子其余部分的折疊[17]，因此本研究設計用四甘氨酸接頭肽代替HA1頭部，去除有免疫優(yōu)勢的HA1頭部，使得免疫反應針對更加保守的HA莖部結構域，又不破壞HA莖部分子三維結構，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達頭部缺失HA蛋白，證實其具有良好的抗原性；進一步通過中和試驗驗證了該血清抗體對H3N2、H1N1兩種不同亞型流感病毒感染均有一定的保護作用。但整體來看中和效價不高，分析原因可能是HA1球狀頭部被四甘氨酸接頭肽取代后，HA血清抗體的中和位點形成空間位阻, 從而降低了血清抗體的中和活性。

為保護蛋白天然構象，本試驗在HA莖部添加了T4折疊三聚體，其對抗原蛋白免疫效果是否存在影響需要進一步研究。另外，本研究雖然在昆蟲細胞內成功表達了頭部缺失HA蛋白，但蛋白產量偏低，限制了其作為亞單位疫苗在臨床中的應用，未來試驗中將進一步優(yōu)化蛋白表達條件。另外，以該頭部缺失HA片段為亞單位疫苗的免疫效果尚需后續(xù)通過動物試驗進一步驗證。

綜上，本研究成功構建了含頭部缺失HA基因的穿梭質粒并驗證了其轉染昆蟲細胞后真核表達的蛋白能夠誘導小鼠產生特異性免疫應答，這為后續(xù)以頭部缺失HA區(qū)域為靶向的廣譜性犬流感疫苗研究奠定基礎。