豬源奇異變形桿菌的分離鑒定、耐藥性分析及毒力基因檢測

黎娜銘，王彬，舒正強，曾智勇，黃濤，湯德元，吳學祥

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省獨山縣麻尾鎮(zhèn)人民政府，貴州 獨山 558206；3. 貴州省黔西南州農(nóng)業(yè)農(nóng)林局，貴州 興義 562400)

奇異變形桿菌是廣泛分布于自然界、動物糞便、臨床標本以及人和動物腸道內(nèi)的重要條件致病菌，主要以其在瓊脂平板上成群分化的模式以及與尿路感染患者腎結(jié)石的發(fā)展相關而聞名，可引起人和動物尿路感染、胃腸炎和敗血癥等[1-2]。奶牛、羊、火雞、鵝和虎等多種動物被奇異變形桿菌感染，可引起肺炎、腹瀉、關節(jié)炎等癥狀[3-7]。奇異變形桿菌能引起豬腹瀉、敗血癥等[8-10]，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。本試驗對病死豬內(nèi)臟分離菌進行形態(tài)特征、生化特性鑒定，初步鑒定該分離菌為變形桿菌，通過16S rRNA基因序列分析，從分子水平確定該分離菌為奇異變形桿菌，并對其進行耐藥性分析、毒力基因檢測和小鼠攻毒試驗，旨在為該蘇感染的防治及其分子流行病學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源及實驗動物

病料來源于貴州某屠宰場突發(fā)死亡豬的心、肝、脾、肺和腎等內(nèi)臟器官；實驗動物為6～8周齡SPF昆明小鼠，購自遼寧長生生物技術股份有限公司。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；PremixTaq(TaKaRaTaqVersion 2.0 plus dye)購自寶生物工程(大連)有限公司；DL2000 plus DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司；鮮血培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；麥康凱培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購自海博生物技術有限公司；水解酪蛋白瓊脂(MH瓊脂)、細菌微量生化反應管和藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司;質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 引物合成

根據(jù)相關參考文獻引物序列[9]，由上海生工生物工程股份有限公司合成(見表1)。

1.4 細菌分離與純化

用接種環(huán)無菌穿刺病死豬心、肝、脾、肺和腎等病料，接種于含血清和NAD的TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和鮮血培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取典型菌株進行劃線和搖菌純化，觀察菌落在培養(yǎng)基上生長形態(tài)，對純化菌進行革蘭染色鏡檢。

1.5 生化試驗

將生化管在超凈工作臺中用齒輪割開，無菌接種純化菌液于6.5%高鹽肉湯、馬尿酸鈉、七葉苷、甘露醇、山梨醇、乳糖 、菊糖、綿實糖、海藻糖、水楊苷等生化管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，記錄試驗結(jié)果。

1.6 16S rRNA基因序列測定及分析

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書抽提細菌基因組DNA，用上述16S rRNA基因引物進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物送華大基因有限公司進行測序。測序結(jié)果于GenBank上BLSAT進行同源性比較，選取同源性較高的9個菌株16S rRNA基因序列，用DNASTAR Megalign軟件對選取的菌株序列建立進化樹并進行分析。

表1 引物序列

1.7 藥物敏感試驗

吸取純化菌液100 μL 均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基上菌液稍干，用無菌鑷子夾取藥敏片平放在培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基均勻放置5種藥敏片。將培養(yǎng)基放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中16～18 h，觀察并測量該菌抑菌圈大小，并參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的紙片擴散法標準進行判定。

1.8 毒力基因檢測

挑取單個菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18 h，用移液槍吸取1.5 mL菌液于無菌EP管中12 000 r·min-1離心1 min，后用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，測定濃度，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆?，用毒力基因引物擴增細菌基因組DNA毒力基因。

1.9 小鼠攻毒試驗

將SPF小鼠隨機分2組，每組5只。試驗組小鼠每只腹腔注射菌液0.2 mL(通過平板計數(shù)法計算原菌液濃度，測定LD50后，調(diào)整攻毒菌液濃度為1×108CFU·mL-1)，對照組小鼠每只注射滅菌TSB液體培養(yǎng)基0.2 mL，每8 h對小鼠發(fā)病及死亡情況進行一次觀察記錄，將死亡小鼠解剖觀察并對其內(nèi)臟器官中分離菌進行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

分離菌株在TSA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上呈圓形透明濕潤菌落，當培養(yǎng)基水分較充足時，分離菌在培養(yǎng)基上呈“霧蔓”式生長，形成厚薄交替層層波狀的同心環(huán)樣菌苔(圖1)。革蘭(圖2)染色鏡檢呈細小或中等短桿狀或絲狀革蘭陰性桿菌。

圖1 分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上的生長情況

圖2 分離菌株鏡下呈短桿狀或絲狀(1 000×)

2.2 細菌生化鑒定

生化試驗結(jié)果(表2)顯示，分離株能分解尿素和硫化氫，能利用棉子糖、山梨醇、血清菊糖、覃糖、木糖，動力試驗陽性，不能發(fā)酵乳糖、甘露醇、馬尿酸，精氨酸水解和七葉苷水解為陰性，與奇異變形桿菌的生理生化特性基本一致。

表2 分離株的生理生化特征

2.3 分離菌株16S rRNA 基因序列的測定與分析

分離菌株用細菌16S rRNA基因通用引物擴增后，獲得1 401 bp目的條帶(如圖4)。經(jīng)測序，在NCBI上進行BLAST，發(fā)現(xiàn)該菌株與奇異變形桿菌同源性高達100%，選取同源性較高的9個菌株16S rRNA基因序列：KR133627.1(中國四川株)、MH396765.1(尼日利亞株)、KF471509.1(巴基斯坦株)、KX495210.1(印度株)、MH532480.1(中國北京株)、KF811051.1(中國黑龍江株)、KJ190018.1(日本株)、MH643694.1(中國江蘇株)、KC456549.1(中國云南株)，用DNASTAR Megalign軟件建立進化樹，結(jié)果顯示，該菌株與奇異變形桿菌KR133627.1(中國四川株)在同一分支(如圖5)，親緣關系最近，從分子層面確定分離菌株為奇異變形桿菌，命名為GZ2-2。

M. DNA標準 DL2000 plus；1. 陰性對照；2～4. 樣品

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果(表3)表明，該分離菌株對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、呋喃唑酮等6種藥物耐藥，對卡那霉素和米諾環(huán)素2種藥物中敏，對哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、丁胺卡那、慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素，共11種藥物敏感。

2.5 毒力基因檢測

擴增細菌基因組DNA毒力基因，結(jié)果顯示8種毒力基因均能被擴增出目的條帶(如圖5)，表明該分離菌株攜帶rsbA、atfA、pmfA、mrpA、zapA、ureC、atfC、ucaA基因。

?本試驗分離菌珠

表3 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

M. DNA標準 DL2000 plus；1～3. ucaA基因；4～6. atfC基因；7～9. ureC基因；10～12. zapA基因；13～15. mrpA基因；16～18. pmfA基因；19～21. atfA基因；22～24. rsbA基因

2.6 小鼠攻毒試驗

試驗組小鼠腹腔接種分離菌株培養(yǎng)液12 h后，出現(xiàn)精神萎靡，喜呆角落，并將頭鉆進墊料中等現(xiàn)象，18 h后小鼠陸續(xù)死亡，72 h內(nèi)小鼠全部死亡，部分死亡小鼠肛門沾有稀便，將死亡小鼠剖檢，發(fā)現(xiàn)肺充血、出血，胸腔和腹腔中的器官均有不同程度纖維素性炎，腸黏膜充血，并從死亡小鼠體內(nèi)分離到奇異變形桿菌，而對照組小鼠無明顯癥狀及死亡。

3 討論

奇異變形桿菌隸屬腸桿菌科變形桿菌屬，形態(tài)為短桿狀、球桿狀、長線狀，運動活潑，在濕潤瓊脂表面可呈游散生長[11-12]。本試驗從病死豬組織器官中分離出一株奇異變形桿菌，在鮮血培養(yǎng)基中呈白色圓形菌落，在TSA培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上呈半透明、圓形濕潤菌落，在濕潤LB培養(yǎng)基中長出一圈一圈的波紋狀菌苔，與其他學者的研究結(jié)果相同[13-15]。

近年來，奇異變形桿菌耐藥越來越嚴重。謝秀蘭等[16]研究發(fā)現(xiàn)，羊源奇異變形桿菌分離株對氨基糖苷類抗生素(阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素)、氟苯尼考及頭孢菌素類抗生素敏感，而對大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素和克林霉素)、復方新諾明、恩諾沙星全部耐藥；對青霉素類(哌拉西林、氨芐西林、阿莫西林)、喹諾酮類(環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)、四環(huán)素、萬古霉素、慶大霉素呈現(xiàn)不同程度的耐藥。劉娜等[3]研究表明，分離出的雞源奇異變形桿菌僅對氨基糖苷類耐藥。Hadjer等[17]研究表明，166株奇異變形桿菌分離株中的14株(8.43%)對以下主要抗生素耐藥，包括阿莫西林、克拉維酸、頭孢噻肟、慶大霉素和環(huán)丙沙星。

本試驗中，分離菌株對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、呋喃唑酮等6種藥物耐藥，對卡那霉素和米諾環(huán)素2種藥物中敏，對哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、丁胺卡那、慶大霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素，共11種藥物敏感；說明該分離菌株與其他研究者有所區(qū)別，可能由于不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖場的用藥制度、用藥方法不同，導致不同分離菌株的耐藥情況不一樣。 Wasfi等[18]研究表明，在MIC以下濃度的抗菌劑中，環(huán)丙沙星在減少奇異變形桿菌生物膜形成方面最有效，頭孢曲松和環(huán)丙沙星對部分清除預先形成的生物膜生物量有效，當尿液中達到高抗菌濃度時，環(huán)丙沙星在殺死細菌細胞方面更有效。這解釋了本試驗分離菌對頭孢曲松、環(huán)丙沙星敏感的這一結(jié)果。

由于碳青霉烯酶是指能分解包括碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素的一大類β-內(nèi)酰胺酶，產(chǎn)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)的分離株引起的感染是當今世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。 Cabral等[19]研究發(fā)現(xiàn)，使用質(zhì)粒DNA的PCR試驗證實了blaKPC-2存在于質(zhì)粒中，而由于轉(zhuǎn)座子是可移動的遺傳元件，blaKPC-2可以存在于檢測到的5個質(zhì)粒中的任何一個中(>150，150，120，90和70 kb)，同時其數(shù)據(jù)證實，攜帶blaKPC-2的奇異變形桿菌株正在巴西出現(xiàn)，表明blaKPC在細菌屬之間連續(xù)轉(zhuǎn)移。因此，各養(yǎng)豬場應更加合理使用藥物，避免多重耐藥菌株的出現(xiàn)。

變形桿菌感染的最常見臨床表現(xiàn)是尿路感染，其通過使用多種毒力因子來進入和定殖宿主尿路，包括尿素酶和結(jié)石形成，菌毛和其他黏附素，鐵和鋅的獲取，蛋白酶和毒素，生物膜的形成以及發(fā)病機理的調(diào)節(jié)[20]。同時，像其他革蘭陰性細菌一樣，變形桿菌在侵入血液時會釋放內(nèi)毒素，從而引發(fā)其他宿主炎癥反應，最終導致敗血癥或全身性炎癥反應綜合征(SIRS)，死亡率為20%～50%[21]。本試驗的死亡豬有肚子脹氣現(xiàn)象，剖檢發(fā)現(xiàn)血液呈黑褐色且凝固不良，內(nèi)臟器官均有不同程度發(fā)黑，腹腔鼓氣，散發(fā)惡臭；攻毒試驗中，試驗組小鼠均在72 h內(nèi)全部死亡，其剖檢胸腔器官有不同程度的纖維素性炎，各臟器不同程度的充血、出血、有惡臭氣味等與前人研究結(jié)果相符[13, 22]，說明該菌能在動物體內(nèi)產(chǎn)氣，并能夠引起動物體內(nèi)臟器官不同程度的病變，引起全身性炎癥反應，產(chǎn)生菌血癥，最終導致死亡。

奇異變形桿菌主要毒力基因有rsbA、atfA、pmfA、mrpA、zapA、ureC、atfC、ucaA，其中，ureC為尿素酶的功能亞單位，mrpA為MRP菌毛主要結(jié)構亞單位，ucaA為尿道上皮黏附素結(jié)構亞單位，rsbA為“霧蔓”遷徙能力的調(diào)節(jié)基因，pmfA為奇異變型桿菌菌毛(PMF)主要結(jié)構亞單位，atfA為適溫菌毛結(jié)構亞單位，atfC為適溫菌毛合成的分子引物，zapA為金屬蛋白酶結(jié)構亞單位[23]。Mobley等[2]的研究中，脲酶和鞭毛對毒力的貢獻最大，而菌毛則起著更微妙的作用，溶血素似乎對致病性沒有明顯的作用；并且，奇異變形桿菌產(chǎn)生的抗甘露糖變形菌樣菌群(MR/P)，在Zunino等[24]的研究中，通過采用不同的試驗方法對一株奇異變形桿菌臨床分離株和一株不能表達MR/P的等基因突變體進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株比野生型菌株更不容易在上、下泌尿道上定殖，其試驗數(shù)據(jù)證實了MR/P菌毛在奇異變形桿菌尿道感染中的重要性，說明脲酶、鞭毛、菌毛對是奇異變形桿菌的重要毒力基因。在Sun等[25]的研究中，大約92.05%的分離株有生物膜，而7.95%的分離株沒有生物膜；有生物膜菌株的致病力顯著高于無生物膜菌株，同時，生物膜的產(chǎn)生與ureC、zapA、rsmA、hmpA、mrpA、atfA和pmfA的表達顯著相關，說明攜帶ureC、zapA、rsmA、hmpA、mrpA、atfA和pmfA等毒力基因的奇異變形桿菌對動物致病性較強。本試驗分離株攜帶rsbA、atfA、pmfA、mrpA、zapA、ureC、atfC、ucaA基因，說明本分離株具有一定的致病性。尹有勤等[26]的研究報道不同來源的奇異變形桿菌對小鼠的致病力存在較小的差異, 且對小鼠有致病力的基因表型與該毒力基因的分布可能存在一定的相關性。結(jié)合毒力基因檢測和小鼠攻毒試驗，表明本試驗離菌具有較強致病性。本研究為奇異變形桿菌病的防治及其分子層面的探討提供了基礎。