牛蛙源達(dá)卡氣單胞菌的分離鑒定及毒力特性分析

潘紀(jì)汶，王昕，楊諾，韓語(yǔ)，郭桂英，曾紀(jì)鋒，鄭繼平*

(1. 海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 海南大學(xué)理學(xué)院，海南 ?？?570228；3. 海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，海南 ?？?570228)

牛蛙(Ranacatesbiana)隸屬于兩棲綱、無(wú)尾目、蛙科。由于肉質(zhì)鮮美滑嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，其皮、油、腺體等其他組織是工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)藥業(yè)的重要原材料[1]，目前已成為我國(guó)主要水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一，年產(chǎn)量已超15萬(wàn)t[2]。近年來(lái)養(yǎng)殖密度增加和水體環(huán)境逐漸惡化，誘發(fā)大量細(xì)菌病害例如氣單胞菌菌(Aeromomas)、葡萄球菌(Staphylococcus)、愛(ài)德華菌(Edwardsiella)和鏈球菌(Streptococcus)等[3-5]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

達(dá)卡氣單胞菌(Aeromonasdhakensis)是氣單胞菌屬一新種。2002年，該菌首次從孟加拉達(dá)卡城的一個(gè)腹瀉的兒童病例中分離獲得，命名為嗜水氣單胞菌達(dá)卡亞種(Aeromonashydrophilasubsp.dhakensis)[6]。2008年，該菌又從葡萄牙一個(gè)觀賞魚養(yǎng)殖箱水中分離得到，誤認(rèn)為是一個(gè)新種而命名為水族箱氣單胞菌(Aeromonasaquariorum)[7]。2013年，嗜水氣單胞菌達(dá)卡亞種與水族箱氣單胞菌，經(jīng)新的分子技術(shù)鑒定為同一分類單元，并經(jīng)全基因測(cè)序分析證實(shí)達(dá)到種的水平，重新定名為達(dá)卡氣單胞菌(Aeromonasdhakensis)[8]。該菌是一種人、獸和水產(chǎn)動(dòng)物共患的機(jī)會(huì)性致病菌，對(duì)人、海豚、鱷魚、魚、蝦等均有感染，主要表現(xiàn)為敗血癥、肺炎、胃腸炎、皮膚與軟組織炎等病癥[9-12]。

2019年8月，海南文昌市某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)大量牛蛙死亡，發(fā)病牛蛙出現(xiàn)腹部腫脹和體表皮膚出血，剖檢見(jiàn)大量腹水，肺充血，肝臟腫大淤血病變。本研究從發(fā)病牛蛙肝臟組織中分離獲得到一株優(yōu)勢(shì)菌株，采用形態(tài)觀察、生理生化鑒定、結(jié)合16S rRNA和gyrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，確認(rèn)其為達(dá)卡氣單胞菌；同時(shí)對(duì)該菌進(jìn)行致病性試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、耐藥基因和毒力基因檢測(cè)，以期為牛蛙細(xì)菌病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

病蛙來(lái)自海南省文昌市某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重為100 ～200 g；健康牛蛙購(gòu)自海口市沿江三農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，體重為120 ～165 g，體表均無(wú)損傷活性較好，在25～28 ℃水溫下飼養(yǎng)7 d； Mueller-Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液(BHI)培養(yǎng)基、革蘭染液購(gòu)自Solarbio公司；生化反應(yīng)管、藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master Mix購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 細(xì)菌分離純化及形態(tài)特征觀察

無(wú)菌采集患病牛蛙的心血、肺、肝、脾、腎組織樣品分別劃線接種于腦心浸液瓊脂平板(BHI)，在28℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)菌的形態(tài)特征，挑取優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行劃線純培養(yǎng)，挑取純化后單菌落進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡觀察其形態(tài)特征。

1.3 分離菌生理生化鑒定

將分離純化后的菌株命名為WC0803，劃線于接種BHI平板中，28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。將WC0803菌株接種于生化反應(yīng)管，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，試驗(yàn)參照BMSAB分類方法[13]進(jìn)行判定。

1.4 16S rRNA基因及gyrA基因序列測(cè)定分析

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取WC0803菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，采用16S rRNA引物(F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′)，gyrA引物(F:5′-ATGAGCGATCTGGCCAGAGA/R：5′-CGCGCCTTGTTCACCTGATA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16S rRNA PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；gyrAPCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s；55 ℃ 15 s；72 ℃ 10 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物純化回收后由廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)分析，再根據(jù)分析結(jié)果通過(guò)MEGA7.0使用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 抗菌藥物敏感試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer法[14]對(duì)WC0803菌株進(jìn)行20種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，使用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕号渲茷?.5 McFarland(1×108CFU/mL)濃度的菌懸液，在MH平板表面涂布均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司抗菌藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.6 耐藥基因及毒力基因檢測(cè)

以WC0803菌株基因組作為模板，使用耐藥基因及毒力基因檢測(cè)引物[15-18]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。9種耐藥基因分別為：β-內(nèi)酰胺類耐藥基因tem、ctxM；氨基糖苷類耐藥基因ant3、strA；喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrS；磺胺類耐藥基因sul1；四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetC；9種毒力基因包括：氣溶素(aer)、細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)、細(xì)胞毒性腸毒素(act)、熱穩(wěn)定腸毒素(ast)、磷脂酶(lip)、ADP-核糖基化毒素(aexT)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)內(nèi)膜組分(ascV)、彈性蛋白酶(ela)和鞭毛蛋白(fla)。

表1 引物序列信息

1.7 致病性試驗(yàn)

為檢測(cè)WC0803菌株致病性強(qiáng)弱，以牛蛙為試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定。采用菌落計(jì)數(shù)法將菌懸液濃度調(diào)整為2.36×109CFU/mL后，使用PBS緩沖液稀釋為108～105CFU/mL共4個(gè)濃度。試驗(yàn)在40 cm×35 cm×37 cm的塑料桶中進(jìn)行，每桶飼養(yǎng)健康牛蛙6只作為一組，試驗(yàn)組分別肌肉注射不同濃度菌懸液0.3 mL，對(duì)照組注射同等劑量無(wú)菌PBS緩沖液，連續(xù)觀察7 d并記錄死亡情況，解剖死亡牛蛙并采集肝、脾、腎和腸等組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)特征

從患病牛蛙心血和肝臟無(wú)菌取樣的BHI瓊脂上，均生長(zhǎng)出形態(tài)單一，呈圓形，中間凸起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)的灰白色菌落。革蘭染色鏡檢顯示為呈單個(gè)排列的紅色短桿菌，為革蘭陰性桿菌。

2.2 分離菌生理生化鑒定

生化試驗(yàn)結(jié)果如表2所示,分離菌株WC0803生理生化特性與達(dá)卡氣單胞菌參考菌株基本一致，初步判斷WC0803菌株為達(dá)卡氣單胞菌。

表2 分離菌株WC0803生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S rRNA及gyrA基因序列分析

分離菌株WC0803的16S rRNA及gyrA基因PCR擴(kuò)增后，分別獲得大小為1 398 bp和815 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上采用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示分離菌株WC0803的16S rRNA及gyrA基因與達(dá)卡氣單胞菌參考菌株同源性均為99%以上。采用MEGA7.0軟件，通過(guò)Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示該菌株均與達(dá)卡氣單胞菌位于同一進(jìn)化分支(圖1、圖2)。

根據(jù)細(xì)菌形態(tài)觀察、生理生化鑒定結(jié)果及16S rRNA及gyrA基因序列分析，可確定分離菌株WC0803為達(dá)卡氣單胞菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片法對(duì)分離菌株WC0803進(jìn)行20種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。該菌對(duì)頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢唑林、青霉素、阿莫西林、氨芐西林、萬(wàn)古霉素、磺胺異惡唑和鏈霉素10種抗生素耐藥；對(duì)卡那霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氨曲南、四環(huán)素、頭孢噻肟和慶大霉素7種抗生素敏感；對(duì)阿米卡星、復(fù)方新諾明和多西環(huán)素3種抗生素中介耐藥。

?本試驗(yàn)分離菌珠

?本試驗(yàn)分離菌珠

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 耐藥基因及毒力基因檢測(cè)

耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，在9種耐藥基因中檢測(cè)出5種，分別是喹諾酮類藥物耐藥基因(qnrA、qnrS)、氨基糖苷類藥物耐藥基因(ant3)和β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因(tem、ctxM)。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，在9種毒力基因中檢測(cè)出7種，分別是ascV、aer、act、ast、lip、ela和fla，說(shuō)明該菌攜帶多種毒力因子，表明其具有強(qiáng)致病性。見(jiàn)圖3、圖4。

2.6 致病性試驗(yàn)

采用牛蛙進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。試驗(yàn)組在72 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，死亡牛蛙體表存在大量出血點(diǎn)，腹腔腫大存在積液，腸道出血等癥狀，對(duì)照組未出現(xiàn)明顯癥狀。從死亡牛蛙體內(nèi)分離出菌落形態(tài)和生理生化特性與WC0803菌株一致的菌株。采用改良寇氏法計(jì)算出WC0803菌株對(duì)牛蛙的LD50為4.68×106CFU/mL，該菌致病性較強(qiáng)，可確認(rèn)WC0803菌株為此次牛蛙死亡致病菌。

M. DL2000 DNA Maker; 1. qnA(579 bp); 2. tetA(956 bp); 3. qnrS(417 bp); 4. tetC(588 bp);5. ant3(526 bp); 6. sul1(433 bp); 7. ctxM(538 bp); 8. tem(425 bp); 9. strA(1 640 bp)

M. DL2000 DNA Maker; 1. ascV(577 bp);2. aer(430 bp); 3. act(232 bp); 4. lip(382 bp);5. aexT(226 bp); 6. ast(331 bp); 7. ela(513 bp);8. fla(608 bp); 9. alt(442 bp)

表4 分離菌株致病性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

氣單胞菌屬細(xì)菌廣泛存在于淡水、污水、低鹽度海水及土壤等生境,近年來(lái)，本屬確定了若干新種，目前至少已有36個(gè)種已被報(bào)道[19-20]，新發(fā)病原達(dá)卡氣單胞菌就是一新種。達(dá)卡氣單胞菌廣泛分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，對(duì)人、海豚、鱷魚、魚、蝦等均可感染，主要表現(xiàn)為敗血癥、肺炎、胃腸炎、皮膚與軟組織炎等病癥[9-11]。本研究從海南省文昌市某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病牛蛙肝臟組織分離到一株優(yōu)勢(shì)菌株WC0803，經(jīng)生理生化和分子鑒定確認(rèn)為達(dá)卡氣單胞菌，這是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道牛蛙的達(dá)卡氣單胞菌感染。

由于氣單胞菌種類繁多，生理生化鑒定往往難以區(qū)分相近的種，必須結(jié)合分子鑒定來(lái)確認(rèn)，但16S rRNA基因具有高度保守性，難以區(qū)分同屬內(nèi)親緣關(guān)系較近物種[21]。gyrA等管家基因?qū)鈫伟鷮倬赀M(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析顯示了良好的分辨性和一致性，且與16S rRNA基因序列測(cè)定分析結(jié)果相符[22]。因此，本研究采用生理生化鑒定、結(jié)合16S rRNA和gyrA基因測(cè)序分析，對(duì)WC0803菌株進(jìn)行鑒定，最終確定該菌為達(dá)卡氣單胞菌。

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，WC0803菌株對(duì)恩諾沙星、氨曲南、四環(huán)素和頭孢噻肟等7種藥物敏感，臨床上可使用這些藥物對(duì)由達(dá)卡氣單胞菌引起的牛蛙疾病進(jìn)行防治；對(duì)頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢唑林等10種藥物耐藥，其耐藥譜與先前報(bào)道的羅非魚達(dá)卡氣單胞菌CAIM1873不同[23]，其中β-內(nèi)酰胺類藥物占多數(shù)，這可能與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果中含有β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(tem、ctxM)相關(guān)。值得注意的是，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌對(duì)喹諾酮類抗生素如環(huán)丙沙星和恩諾沙星敏感，但是耐藥基因檢測(cè)顯示攜帶有喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrS)，在其他研究中也發(fā)現(xiàn)此類表型與基因型存在差異的現(xiàn)象[15]。因此在使用抗生素時(shí)，應(yīng)輪換使用敏感藥物以減少耐藥菌株產(chǎn)生。

牛蛙致病試驗(yàn)顯示，菌株WC0803的LD50為4.68×106CFU/mL，表明該菌株具有較強(qiáng)致病性。由于達(dá)卡氣單胞菌致病機(jī)制可能由多重毒力因子共同作用，因此檢測(cè)菌株WC0803所攜帶毒力因子。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，在9種毒力因子中檢測(cè)出ascV、aer、act等7種。其中，Ⅲ型分泌系統(tǒng)內(nèi)膜組分基因ascV與病原菌毒力因子分泌相關(guān)；aer編碼的氣溶素具有細(xì)胞毒性和溶血活性，并且能夠改變細(xì)胞通透性，是氣單胞菌致病性的關(guān)鍵毒力因子[24]；act和ast編碼的腸毒素具有溶血毒性并且裂解細(xì)胞，引起出血和敗血癥狀。此外，鞭毛蛋白、磷脂酶和彈性蛋白酶在增強(qiáng)病原菌黏附及降解宿主細(xì)胞成分上發(fā)揮重要作用[25]。研究表明，氣單胞菌致病性強(qiáng)弱與毒力基因型具有相關(guān)性，并且攜帶毒力基因數(shù)減少將會(huì)導(dǎo)致致病性減弱[26]。本研究中WC0803菌株攜帶多種毒力因子，可能與該菌株具有強(qiáng)致病性相關(guān)。

綜上，本研究首次從發(fā)病牛蛙中分離到1株達(dá)卡氣單胞菌WC0803，通過(guò)致病性試驗(yàn)及毒力基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌具有強(qiáng)致病性，進(jìn)一步的耐藥基因及藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為臨床選用敏感藥物提供參考。