牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白納米抗體篩選及反應(yīng)原性檢測(cè)

李巖，肖盛中，楊艷，張彥紅，蔡卓軒，周子恒，張哲，盛金良

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

牛病毒性腹瀉黏膜病(bovine viral diarrheamucosal disease，BVD-MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV) 引起的牛等多種動(dòng)物感染的一種重要傳染性疾病。BVDV感染牛后，牛群出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，可造成嚴(yán)重的消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病及免疫抑制等[1-2]。該病呈世界性分布，中國(guó)、美國(guó)、阿根廷、歐洲等已普遍報(bào)道，許多養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家均存在該病[3]。

BVDV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員[4-5]，為一種單股 RNA，有囊膜的病毒，呈圓形，與豬瘟病毒和羊邊界病毒為同屬病毒[6]。BVDV基因組是由一個(gè)開放閱讀框(open reading frame, ORF)構(gòu)成的單股正鏈RNA[7]。根據(jù)基因組的編碼和翻譯，BVDV中至少包含11個(gè)成熟蛋白，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白C、Erns、E1、E2，7種非結(jié)構(gòu)蛋白Npro、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B[8]。BVDV-E2蛋白通?？梢哉T導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有特異針對(duì)性的抗體，其產(chǎn)生的抗體往往可以中和該病毒，從而在某種程度上避免了同源毒株的攻毒和對(duì)細(xì)胞的破壞[9]。E2蛋白能夠參與并介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)，也是病毒與宿主細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和吸附的主要部位[10-11]。該蛋白的基因容易發(fā)生變異，因此其保守性較低，是BVDV變異較高的結(jié)構(gòu)蛋白，使病毒對(duì)環(huán)境有較好的適應(yīng)性[12]，同時(shí)這也是導(dǎo)致持續(xù)性感染和疫苗保護(hù)性差的主要原因[13]。

在駱駝科動(dòng)物體內(nèi)，除了傳統(tǒng)的IgG抗體以外，還存在一種天然缺失輕鏈和重鏈第一個(gè)恒定區(qū)的特殊IgG，被稱作重鏈抗體[14]。納米抗體的大小僅是普通IgG抗體的1/10，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、分子量小，可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，借助穿膜肽還可以透過(guò)細(xì)胞膜，具有開發(fā)成為新型抗病毒藥物的潛力[15]。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)BVDV納米抗體相關(guān)報(bào)道較少，且針對(duì)不同抗原蛋白，2015年，張國(guó)奇等[16]篩選出BVDV-NADL納米抗體，2017年丁金花等[17]篩選出BVDV-E0蛋白納米抗體。本試驗(yàn)利用BVDV滅活疫苗免疫羊駝，將抗BVDV的納米抗體在噬菌體展示系統(tǒng)中展示，構(gòu)建展示文庫(kù)，運(yùn)用E2蛋白篩選與之穩(wěn)定結(jié)合的納米抗體，為診斷和防控牛病毒性腹瀉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質(zhì)粒pET30a-E2由南京德泰生物技術(shù)有限公司合成；BVDV滅活苗購(gòu)自內(nèi)蒙古金宇生物技術(shù)有限公司；羊駝一只，飼養(yǎng)于石河子大學(xué)獸醫(yī)院；駱駝外周血淋巴細(xì)胞提取試劑盒購(gòu)自Solarbio；pCANTAB5E載體、TG1和BL21均由本實(shí)驗(yàn)室保存；輔助噬菌體M13K07由西北農(nóng)林科技大學(xué)趙欽副教授贈(zèng)送；限制性內(nèi)切酶NedⅠ、HindⅢ、SfiⅠ和NotⅠ以及T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA Marker分別購(gòu)自TRANSGEN和北京天根生化科技公司；Anti-M13-HRP購(gòu)自Sino Biological；Anti-E-tag-HRP購(gòu)自金斯瑞生物科技股份有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 BVDV-E2蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

預(yù)先將所需感受態(tài)細(xì)胞置于冰塊上預(yù)冷，吸取10 μL連接產(chǎn)物加入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，吹打混勻，置于冰塊上靜置30 min，預(yù)熱水浴鍋至42 ℃。使用計(jì)時(shí)器在42 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱擊90 s，立即轉(zhuǎn)至冰塊上靜置3 min。向EP管中加入600～800 μL無(wú)抗性LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床 200 r/min活化 60 min。室溫條件5 500 r/min離心5 min，棄去上清，加入100 μL無(wú)抗LB培養(yǎng)基混勻，涂板。

1.2.2 BVDV-E2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

使用接種環(huán)蘸取含有目的基因片段的菌液，在50 μg/mL的Kan+抗性LB平板上畫線培養(yǎng)。倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃過(guò)夜。次日觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑選單克隆，接種至4 mL Kan+(50 μg/mL)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)至菌液OD600至0.6～0.8時(shí)，吸取1 mL菌液1 200 r/min離心1 min，棄上清后，加入80 μL去離子水和 20 μL 5×蛋白Loading Buffer，作為0 h誘導(dǎo)樣本，-20 ℃保存。取樣后向菌液中加入終濃度0.1 mmol/L IPTG，充分混勻，在37 ℃進(jìn)行過(guò)夜誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)果使用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。

1.2.3 BVDV滅活疫苗免疫羊駝

使用BVDV滅活苗對(duì)羊駝進(jìn)行免疫，分別在第0、21、49及70天采集全血，分離淋巴細(xì)胞及血清，使用分離后的血清通過(guò)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。取對(duì)應(yīng)抗體效價(jià)較高的淋巴細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

引物AIPVh-LD和CH2-R引自參考文獻(xiàn)[18]，VHH-F和VHH-R引自參考文獻(xiàn)[19]送至北京華大基因合成。詳見表 1。

表1 目的基因擴(kuò)增所需引物

1.2.5 羊駝外周血淋巴細(xì)胞RNA的提取

按照每200 μL淋巴細(xì)胞 加入1 mL TRIZol的比例 ，使用氯仿、異丙醇和無(wú)水乙醇提取總RNA,通過(guò)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA反應(yīng)條件為42 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。

1.2.6 VHH目的片段的擴(kuò)增和重組載體pCANTAB5E+VHH的構(gòu)建

使用AIPVh-LD和CH2-R對(duì)獲得的cDNA進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s、57 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)束后會(huì)在900 bp和700 bp的位置出現(xiàn)2個(gè)條帶，切取700 bp位置條帶，膠回收，作為第二輪PCR模板。再用VHH-F 和VHH-R 進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃ 45 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 40 s、68 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶大約為400 bp，切取目的片段，進(jìn)行膠回收，膠回收產(chǎn)物凍于-20 ℃保存。用SfiⅠ和NotⅠ對(duì)目的片段和質(zhì)粒進(jìn)行酶切并鑒定，使用T4 DNA連接酶將切好的目的片段和質(zhì)粒以3∶1的比例在10 μL的體系中進(jìn)行連接，反應(yīng)條件為4 ℃ 16 h，連接產(chǎn)物放于-20 ℃保存。

1.2.7 納米抗體噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建

取連接好的重組質(zhì)粒pCANTAB5E+VHH 10 μL 加入到100 μL TG1感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30 min，42 ℃ 熱激45 s，冰上靜置2 min，加入900 μL AMP-LB液體培養(yǎng)基，放于搖床200 r/min 37 ℃搖50 min，取出后用離心機(jī)6 000 r/min離心3 min，吸出上清，再加入100 μL AMP-LB液體培養(yǎng)基混勻菌體沉淀，涂布到AMP-LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)8 h。隨機(jī)挑取平板中的單克隆96個(gè)，在AMP-LB液體培養(yǎng)基中，放于搖床200 r/min 37 ℃搖8 h后，使用第二輪PCR引物進(jìn)行菌液PCR，計(jì)算庫(kù)容。

1.2.8 噬菌體抗體文庫(kù)救援

取構(gòu)建好的噬菌體展示文庫(kù)100 μL接種于100 mL 2×YT/AMP-GLU培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，加入100 μL輔助噬菌體(4.2×1012PFU/mL)輕輕混勻，37 ℃靜置30 min，2 800g離心10 min，棄上清，菌體用200 mL 2×YT/AMP-GLU培養(yǎng)基重懸，37 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)液分裝至50 mL離心管，4 ℃，3 800g，離心30 min，收集上清，加入1/5體積預(yù)冷的PEG/NaCl上下顛倒混勻，冰上靜置2 h。3 800g，4 ℃離心30 min后，棄上清，每管加入0.5 mL 無(wú)菌PBS 重懸菌體沉淀。12 000g4 ℃ 離心15 min 收集上清。加入1/5體積預(yù)冷的PEG/NaCl上下顛倒混勻，冰上靜置2 h。10 000g4 ℃ 離心10 min棄上清，用1 mL PBS重懸噬菌體沉淀，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，使噬菌體充分溶解。

1.2.9 重組噬菌體淘選

將E2蛋白以10 μg/孔的包被量包被到ELISA板上，另取一孔加入PBS，4 ℃包被過(guò)夜。用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。用PBST洗滌4次后37 ℃孵育稀釋后的重組噬菌體2 h。用PBST洗滌5次后再用PBS洗滌3次。每孔加入0.1 mol/L三乙胺，室溫靜置10 min，迅速用等體積1 mol/L pH為7.4的Tris-HCl中和。收集中和后的洗脫液，并測(cè)定滴度。重復(fù)3次上述步驟，確定最后一輪淘選后噬菌體滴度。

1.2.10 重組納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)

取第三輪篩選后洗脫產(chǎn)物，用2×YT稀釋后取100 μL與100 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TG1混合，37 ℃靜置15 min。將感染后的TG1涂布于AMP/LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑去96個(gè)單克隆菌落，依次標(biāo)記，接種于100 μL LB/AMP-GLU液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。每個(gè)單克隆取10 μL，分別接種于1 mL TB培養(yǎng)基中，放置于搖床37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將剩余的單克隆培養(yǎng)樣本保存于-80 ℃。菌液OD600到達(dá)0.6～0.8時(shí)每管菌液加入含10 mmol/L IPTG的TB培養(yǎng)基中，放于搖床37 ℃，200 r/min誘導(dǎo)過(guò)夜。將過(guò)夜誘導(dǎo)產(chǎn)物4 ℃ 3 200g離心10 min，棄上清，置于-20 ℃冷凍40 min，取出室溫放置15 min，每管加入無(wú)菌PBS 500 μL，重懸菌體，放于搖床200 r/min 30 min。取出后放于離心機(jī)，4 ℃ 3 800g離心15 min，收集上清(上清即為可溶性納米抗體粗提物)。

1.2.11 可溶性重組納米抗體的ELISA檢測(cè)

將E2以10 μg/mL的包被量包被在ELISA板上，同時(shí)包被兩板，4 ℃過(guò)夜，空白孔直接加入PBS作為無(wú)抗原對(duì)照。棄去孔中包被液，拍干后加入200 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h。用PBST洗板3次，取可溶性納米抗體，用封閉液1∶1稀釋后，每孔100 μL，37 ℃孵育40 min。用PBST洗板3次，兩板分別孵育稀釋好的抗M13抗體和抗E-tag抗體，37 ℃孵育40 min。用PBST洗板3次，加入顯色液，37 ℃顯色15 min，每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸終止，測(cè)量OD450的值。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET30a-E2重組質(zhì)粒酶切鑒定

使用NdeⅠ和HindⅢ對(duì)構(gòu)建pET-30a-E2原核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果如圖1，雙酶切后，E2目的基因片段與預(yù)期分子量相符。

2.2 E2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

表達(dá)菌在37 ℃經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，如圖2所示，在39 kDa左右出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，表明蛋白均成功表達(dá)。

1. 質(zhì)粒對(duì)照；2. 雙酶切產(chǎn)物；M. DNA Marker

M. 蛋白Marker；1. 0 h對(duì)照；2. 37 ℃誘導(dǎo)16 h

2.3 VHH目的片段擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖3，在400 bp左右出現(xiàn)目的條帶。

2.4 重組質(zhì)粒pCANTAB5E+VHH的酶切鑒定

將連接好的pCANTAB5E+VHH用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切鑒定，在4 500 bp左右和400 bp左右出現(xiàn)2個(gè)條帶，結(jié)果如圖4。

2.5 文庫(kù)容量鑒定

通過(guò)隨機(jī)挑取的96個(gè)單克隆的菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，計(jì)算庫(kù)容。結(jié)果如圖5、圖6。陽(yáng)性率為90.8%，庫(kù)容為4.9×1014CFU/mL。

M. DNA Marker；1～5. PCR產(chǎn)物

M. DNA Marker；1～3. pCANTAB5E+VHH酶切產(chǎn)物

圖5 文庫(kù)庫(kù)容量鑒定

2.6 重組噬菌體淘選

將E2蛋白作為包被抗原篩選特異性納米抗體。在篩選過(guò)程中，通過(guò)檢測(cè)每輪洗脫液中重組噬菌體的滴度來(lái)評(píng)估特異性VHH 重組噬菌體的富集效果。結(jié)果如表2。根據(jù)表2，噬菌體的加入量記為Input，洗脫量記為P，陰性對(duì)照孔中噬菌體洗脫量記為N，P/Input表示回收率，P/N值表示特異性噬菌體所占比。結(jié)果顯示特異性噬菌體得到了明顯的富集。

圖6 菌液PCR鑒定VHH文庫(kù)陽(yáng)性率

表2 E2蛋白篩選過(guò)程中特異性噬菌體富集情況

2.7 Phage ELISA

從E2蛋白第三輪篩選后的細(xì)菌平板上隨機(jī)挑取96個(gè)單克隆，經(jīng)擴(kuò)增誘導(dǎo)后，制備可溶性重組納米抗體粗提物，分別用HRP鼠抗M13和HRP標(biāo)記的E-tag作為二抗，通過(guò) ELISA檢測(cè)，初步鑒定納米抗體克隆與E2重組蛋白的反應(yīng)性，ELISA結(jié)果如圖7、圖8所示。圖中橫坐標(biāo)為單克隆菌落序號(hào)，縱坐標(biāo)為OD600的值，以O(shè)D600的值超過(guò)對(duì)照組4倍為陽(yáng)性樣本，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖7 ELISA檢測(cè)重組納米抗體與E2的反應(yīng)性(HRP鼠抗M13)

圖8 ELISA檢測(cè)重組納米抗體與E2的反應(yīng)性(E-Tag)

選取兩組ELISA均為陽(yáng)性，且OD值較高的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR，將PCR結(jié)果送至北京華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列分析后，得到與駝源的VHH具有較高同源性且與E2蛋白具有良好反應(yīng)性的序列2條。分別命名為Nb-YT1、Nb-YT2。其中在其FR2區(qū)均由典型親水氨基酸，且在其CDR3區(qū)均有半胱氨酸，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一對(duì)半胱氨酸可形成二硫鍵，穩(wěn)定納米抗體抗原結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu)。氨基酸序列如圖9。

圖9 特異性納米抗體氨基酸序列

3 討論

有研究表明，BVDV的結(jié)構(gòu)蛋白變異性較大，特別是E2的變異種類最多[20]。變異的結(jié)果通常會(huì)導(dǎo)致BVDV對(duì)宿主細(xì)胞以及環(huán)境的適應(yīng)能力更好，生存能力更強(qiáng)，同時(shí)這也是導(dǎo)致某些疫苗以及藥物的功能性喪失的重要原因[21]。由于E2能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，故目前研制的新型疫苗多為針對(duì)E2蛋白。E2基因在 BVDV不同毒株以及與瘟病毒屬各毒株之間高度不穩(wěn)定[22]。E2的高度不穩(wěn)定性使 BVDV更好的適應(yīng)環(huán)境，這也是導(dǎo)致疫苗保護(hù)失效和持續(xù)性感染的主要原因[23]。本研究成功獲得了BVDV-E2納米抗體氨基酸序列，納米抗體不但可以用于研究E2蛋白的表達(dá)和功能，還可以用于為BVDV的檢測(cè)與預(yù)防。

納米抗體具有特異性識(shí)別位于病毒表面、病毒縫隙甚至被包埋的病毒抗原表位的功能，因此，納米抗體具有優(yōu)越于傳統(tǒng)抗體的結(jié)合能力，從而高效率地并高針對(duì)性地靶向目標(biāo)病毒，實(shí)現(xiàn)中和病毒的功效[21]。2015年張國(guó)奇[16]篩選出來(lái)針對(duì)BVDV-NADL株的納米抗體對(duì)病毒的復(fù)制有阻斷效果；2017年丁金花[17]篩選出來(lái)針對(duì)BVDV-E0的納米抗體均能與病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明其具有細(xì)胞毒性。

本試驗(yàn)通過(guò)全病毒免疫羊駝，分離全血中的淋巴細(xì)胞，提取總RNA，通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增，得到目的片段，將其與表達(dá)載體連接后，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)，獲得噬菌體展示文庫(kù)。本試驗(yàn)獲得的文庫(kù)庫(kù)容為1.02×107CFU/mL，插入率為90.8%。經(jīng)過(guò)3次淘選，挑取第三輪的洗脫產(chǎn)物與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TG1結(jié)合后的單克隆，使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)ELISA測(cè)試反應(yīng)性，OD值較高的克隆測(cè)序結(jié)果顯示有2個(gè)與駝源VHH具有較高同源性且不完全一致。本試驗(yàn)獲得的Nb-YT1、Nb-YT2的氨基酸序列可通過(guò)大量表達(dá)純化后，進(jìn)行標(biāo)記，用于BVDV致病機(jī)理、診斷及治療。