超聲波輔助提取血橙皮渣中橙皮苷及抗氧化研究

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林吉林 132000）

0 引言

血橙皮渣含有豐富的多糖、果膠、色素、維生素、橙皮苷等有效成分［1］，橙皮苷（Hesperidin），又稱川陳皮素［2］，化學式為 C28H34O15，是一種天然功能性組分，在陳皮、橘皮、血橙皮中含量較高。橙皮苷屬于黃酮類的一種，對人體無毒無害，還具有調(diào)節(jié)免疫力，防治疾病的功能，是成藥“脈通”的主要原料之一［3］。血橙同時還能促進血液循環(huán)，溫潤補血，具有抗氧化性，預防心血管疾病，抗癌癥等保健作用。

植物成分提取方法一般有水提醇沉法、酸浸提法、堿浸提法等［4-6］。但這些提取方法存在很多缺點和不足，在能耗、收率和純度等方面遠不及超聲波輔助法。超聲波輔助提取法具有效率高、耗能低、溶劑用量少等特點，已應用于多種植物有效成分提?。?-8］。李建鳳［9］等在研究超聲波輔助提取血橙皮渣中橙皮苷的最佳工藝得到了驗證。但本文不僅采用超聲波輔助提取法提取橙皮苷，還與響應面實驗結(jié)合，并對其抗氧化進行研究，這種研究方法在橙皮苷研究中還未見報道，分析了超聲功率、乙醇濃度、提取時間和料液比4個因素對血橙皮中的橙皮苷得率所具有的影響。本文研究旨在為橙皮苷提取尋求最佳工藝及抗氧化劑開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與試驗方法

1.1 試驗材料與試劑

血橙市售、橙皮苷標準品（97%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司售），乙醇溶液，鹽酸溶液，甲醇溶液，鋅粉，pH試紙，水楊酸溶液，硫酸亞鐵溶液，過氧化氫溶液，DPPH試劑，硝酸鋁溶液（以上試劑由吉林農(nóng)業(yè)科技學院理化試驗室提供）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

血橙皮→晾干→粉碎過篩→加入乙醇溶劑→超聲波處理→冷卻過濾→調(diào)pH值→加熱析晶→離心→得橙皮苷→甲醇溶解→測量計算→抗氧化分析

1.2.2 具體步驟

（1）原料預處理：血橙皮通過篩選后清洗，平整的鋪放于干燥箱內(nèi)，并設(shè)置干燥溫度50 ℃，烘干時間6 h，待全部烘干后，用粉碎機進行多次粉碎，過40目篩，得到血橙皮粉，備用。

（2）超聲波輔助提?。涸诜治鎏炱缴希瑴蚀_稱量1.000 g預處理后的血橙皮粉，放入50 mL的錐形瓶中，再在錐形瓶中按一定料液比添加乙醇溶劑。玻璃棒攪拌均勻后，按一定的比例設(shè)定不同的超聲功率和超聲時間進行超聲提取，獲得超聲波輔助提取血橙皮渣中橙皮苷的最佳提取工藝條件，將粗物提冷卻過濾，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液pH值至4～5，在110 ℃左右的電熱爐上析晶，4 500 r/min離心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到的橙皮苷粗品用75%甲醇溶液稀釋，進行定性定量分析。然后將血橙皮渣中橙皮苷做抗氧化分析，初步探索其體外抗氧化性。

1.2.3 單因素試驗方法

（1）料液比對橙皮苷得率的影響。準確稱取處理過的血橙皮粉1 g五份，放入50 mL的錐形瓶中，在不同料液比（1：15、1：20、1：25、1：30、1：35 g/mL）的條件下進行超聲提取，冷卻過濾，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液pH值至4～5，在110 ℃左右的電熱爐上析晶，4 500 r/min離心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到的橙皮苷粗品用75%甲醇溶液稀釋。在480 nm處測吸光度，計算得率。

（2）提取時間對橙皮苷得率的影響。準確稱取處理過的血橙皮粉1.00 g五份，放入50 mL的錐形瓶中，不同提取時間（15、20、25、30、35 min）的條件下進行超聲提取，冷卻過濾，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液pH值至4～5，在110 ℃左右的電熱爐上析晶，4 500 r/min離心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到橙皮苷粗品用甲醇溶液稀釋，在480 nm處測吸光度，計算得率。

（3）乙醇濃度對橙皮苷得率的影響。準確稱取處理過的血橙皮粉1.00 g五份，放入50 mL的錐形瓶中，不同乙醇濃度（45%、55%、65%、75%、85%）的條件下進行超聲提取，冷卻過濾，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液pH值至4～5，在110 ℃左右的電熱爐上析晶，4 500 r/min離心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到橙皮苷粗品用甲醇溶液稀釋，在480 nm處測吸光度，計算得率。

（4）超聲功率對橙皮苷得率的影響。準確稱取處理過的血橙皮粉1.00 g五份，放入50 mL的錐形瓶中，不同超聲功率（60、70、80、90、100 W）的條件下進行超聲提取，冷卻過濾，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液pH值至4～5，在110 ℃左右的電熱爐上析晶，4 500 r/min離心，取沉淀，在40 ℃烘箱烘干，得到橙皮苷粗品用甲醇溶液稀釋，在480 nm處測吸光度，計算得率。

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗

響應面試驗因素水平如表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

1.2.5 標準曲線繪制

準確稱量橙皮苷標準品0.01 g，用75%甲醇溶液溶解并加入0.6 mL硝酸鋁溶液，定容于10 mL容量瓶中，分別移取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 制好的標準品溶液于10 mL比色管，并定容至刻度，吸光度在480 nm處測定，對標準曲線進行繪制。

1.2.6 測定橙皮苷的含量

式中 C——橙皮苷質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——定容體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——質(zhì)量，g。

1.2.7 橙皮苷的定性分析

得到的橙皮苷粗品用甲醇溶解，然后加入硝酸鋁溶液，輕輕搖晃均勻，溶液變成黃色絡(luò)合物，則為橙皮苷。

1.2.8 抗氧化研究

（1）自由基清除能力。取橙皮苷提取物0.100 g，然后加入70%乙醇溶液，定容至100 mL，樣品待測液是將質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 配制而成，用移液管吸取5.6 mL DPPH·溶液與0.4 mL樣品液，將其輕微搖晃混合均勻，并放在黑暗避光處30 min，然后用紫外分光光度計在480 nm處下測A1，為獲得A0，使用70%乙醇溶液做為參比，取其三次平行試驗的平均值，代入以下公式中獲得清除率［10］，陽性對照為維生素C。

式中 A0——空白樣吸光度；

A1——試樣吸光度。

（2）羥基自由基清除能力。分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 樣品待測液 1.0 mL，然后將FeSO4溶液和水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，分別加入樣品待測液中［11］。添加蒸餾水定容至5.0 mL。再分別加入H2O2（6.0 mmol/L）溶液1.0 mL，反應10 min，在480 nm波長處測A1，為獲得A0，取其三次平行試驗的平均值，代入公式中，陽性對照為維生素C。

式中 A0——空白樣吸光度；

A1——試樣吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮苷標準曲線

由圖 1，得標準曲線為：Y=6.119 3X+0.025，R2=0.999 3。

圖1 橙皮苷標準曲線Fig.1 Hesperidin standard graph

2.2 橙皮苷定性分析結(jié)果

溶液變成黃色絡(luò)合物［12］，則為橙皮苷。

2.3 單因素試驗結(jié)果與分析

考察料液比、提取時間、乙醇濃度及超聲功率四個因素對橙皮苷得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同因素對橙皮苷得率的影響Fig.2 Effect of different factors on extraction yield of hesperidin

由圖 2可知，料液比在 1：15（g/mL）至 1：30（g/mL）時，血橙皮渣中橙皮苷的得率呈上升狀態(tài)，并在1：30（g/mL）時達到最大值；溶劑的適當遞增，有效成分擴散達到平衡時，殘留于細胞內(nèi)的濃度越小，得率升高。料液比為1：35（g/mL）時，橙皮苷的得率開始表現(xiàn)趨勢呈下降，料液比增大反而減小了血橙渣中橙皮苷提取量的吸收，浸出隨之減少。所以初步確定最優(yōu)的料液比為1：30（g/mL），選擇 1：25（g/mL）、1：30（g/mL）、1：35（g/mL）進行響應面試驗。提取時間在15 min至20 min中，橙皮苷的得率緩慢遞增，在20 min時為最大值2.91%；之后一直遞減，因為長時間的超聲使得是橙皮苷發(fā)生降解，同時長時間的提取也使乙醇揮發(fā)損失以及增加雜質(zhì)的溶出量，還增加了能量消耗。所以初步確定最優(yōu)的提取時間為 20 min，選擇 15、20、25 min進行響應面試驗。乙醇濃度在45%至65%時，血橙皮渣中橙皮苷的得率呈上升狀態(tài)，并在65%時上升至最大值2.3%；再繼續(xù)增加提取時間至85%時，含堿性乙醇溶液的增加，增加了雜質(zhì)的溶解，影響了橙皮苷的溶解，從而降低了橙皮苷的得率。超聲功率在60 W至80 W時，橙皮苷的得率一直在不斷增加，并在80 W時上升至最大值3.0%；這是因為加大超聲功率后，產(chǎn)生了強烈的空化效應，使超聲作用更明顯，攪拌粉碎作用加強，溶劑的穿透力也有所增加，提取物的溶解能力增強，得率隨之變高。當超聲功率達到100 W時，橙皮苷的得率慢慢下降，所以初步確定最優(yōu)的超聲功率為80 W，選擇70、80、90 W進行響應面試驗。

2.4 響應面試驗

2.4.1 試驗設(shè)計與結(jié)果分析

使用Design-Expert8.0軟件對表3結(jié)果進行統(tǒng)計分析［13］，建立以下二次方程：Y=3.27-0.16A+0.11+0.086C-0.28AB-0.31AC+0.057BC-0.29A2-0.59B2-0.41B2。

對二次回歸方程進行方差分析，模型的F=55.23，P＜0.0001＜0.01，說明試驗采用的回歸模型是高度顯著水平，對于失擬項（P=0.4707＞0.05）不顯著，由此說明該模型合理［14］。由表可知，A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2的 P 值均小于 0.05，說明對橙皮苷得率影響顯著，BCP值大于0.05，說明對橙皮苷得率影響顯著較差，各因素對血橙皮渣中橙皮苷得率影響由大到小順序為：料液比＞超聲功率＞提取時間。

2.4.2 響應面及等高線分析結(jié)果

各因素交互作用對橙皮苷得率的影響如圖3所示。

圖3 各因素交互作用對橙皮苷得率的影響Fig.3 Effects of interactions of various factors on extraction yield of hesperidin

由圖3（a）可知，三維圖坡度較陡，說明料液比和超聲功率的交互效應顯著，在提取時間不變的情況下，超聲功率增大，料液比增大，得率先增加，達到各因素的中心值，后減小，原因在于超聲功率和料液比的增加，得率升高，然后根據(jù)超聲波的空化效應，使其速度加快，溶劑的穿透力也有所增加，提取物的溶解能力增強，得率隨之變高。

由圖3（b）可知，三維圖的變化明顯，這說明提取時間和料液比交互效應顯著，在超聲功率不變的情況下，提取時間增大，料液比增大，得率先增加，達到各因素的中心值，后減小，原因在于料液比和提取時間的增加，使血橙皮粉充分浸泡，得率升高，但料液比的增加和時間的延長，使橙皮苷分解，導致得率減小。

由圖3（c）可知，三維圖坡度較緩，說明超聲功率和提取和時間的交互效應較差，在料液比不變的情況下，提取時間延長，超聲功率增大，得率先增加，達到各因素的中心值，后減小，原因在于提取時間和超聲功率的增加，在超聲波的空化效應下，加速橙皮苷溶出，得率不斷升高，但時間過長，超聲波對組織破壞，使橙皮苷降解，影響試驗，導致得率降低。

由圖3可知，兩交互作用由大到小的順序依次是：料液比和提取時間＞料液比和超聲功率＞提取時間和超聲功率。

根據(jù)上述數(shù)據(jù)進行分析和整理，最終確定條件為：料液比 1∶30（g/mL），超聲功率 80 W，提取時間為20 min。并設(shè)置3次平行試驗進行驗證，測得得率為3.35%，與模型預測值差異較小，結(jié)果具有可靠性。

2.5 抗氧化結(jié)果

2.5.1 DPPH·清除力

由圖4可知，DPPH·的清除率表現(xiàn)出不斷增強的變化，在濃度較低時，橙皮苷和維生素C對DPPH·的清除力差異不明顯，在試驗范圍內(nèi)，橙皮苷的清除率雖然整體比維生素C低，但當橙皮苷濃度達到0.6（mg/mL）時，清除率最大達到55.80%。

圖4 橙皮苷對DPPH·的清除作用Fig.4 Inhibitory effects of hesperidin on DPPH·

2.5.2 羥基清除力

由圖5可知，·OH的清除率表現(xiàn)出不斷增強的變化，而維生素C的曲線趨勢變化則更為明顯。維生素C清除·OH的能力明顯強于橙皮苷，但橙皮苷也表現(xiàn)出具有一定清除·OH的能力。當濃度達到0.6（mg/mL）時，清除率最大值為64.02%。

圖5 橙皮苷對·OH的清除作用Fig.5 Inhibitory effects of hesperidin on·OH

3 結(jié)語

通過單因素試驗，響應面試驗對血橙皮渣中橙皮苷的提取進行了研究。最終得出提取橙皮苷的適宜條件為：料液比1：30（g/mL），提取時間20 min，超聲功率80 W，在此條件下試驗測得的血橙皮渣中橙皮苷的得率為3.35%，與理論值相差較小，因此采用修改后的工藝條件得到的血橙皮渣中橙皮苷的得率的數(shù)值也是準確可靠的。

朱玉昌等［15］用ABTS和DPPH法評價了7個甜橙品種的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)血橙的總抗氧化能力最強。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過對于血橙渣中的橙皮苷的抗氧化研究，清除率與橙皮苷濃度均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，當濃度為0.6（mg/mL）時，對 DPPH·清除率為 55.80%，對·OH 的清除率為64.02%，表明橙皮苷抗氧化性較強。由于純化等未在實驗中進行，在今后的研究中會進一步后續(xù)純化及結(jié)構(gòu)與抗氧化性的關(guān)系等相關(guān)性研究。本文為提升血橙營養(yǎng)保健和經(jīng)濟價值提供了部分依據(jù)和參考。