非編碼RNA在腦缺血再灌注損傷中的作用*

張 毅， 馮康倪， 陳鑒濤， 梁孟亞

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟外科，廣東廣州510080）

腦卒中（stroke）是導(dǎo)致成年人殘疾和死亡的第二大病因，缺血性腦卒中約占所有腦卒中病例的87%［1］，成為了現(xiàn)代社會(huì)健康和生活質(zhì)量的主要威脅。缺血性腦卒中（ischemic stroke）由于腦血流量嚴(yán)重減少，腦組織缺乏血液和氧氣供應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡和腦梗死［2］。目前臨床上常用的治療缺血性腦卒中的方法是及時(shí)恢復(fù)大腦的血液供應(yīng)，然而部分病人恢復(fù)大腦血供后不僅不能減輕腦缺血引發(fā)的神經(jīng)功能障礙，反而加重腦缺血癥狀，表現(xiàn)出復(fù)雜的病理生理變化，即發(fā)生腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。大腦血液的中斷能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥細(xì)胞以及促使其釋放炎癥因子，誘導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞膜。此外，無(wú)氧代謝成為了缺血性腦卒中過(guò)程中細(xì)胞ATP 合成的重要來(lái)源，提高了細(xì)胞內(nèi)自由基水平和誘發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加之由于缺血造成了細(xì)胞外微環(huán)境的改變，激活細(xì)胞的自噬反應(yīng)。腦組織發(fā)生缺血缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激和自噬反應(yīng)均能極大地促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和壞死，而大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡可使血腦屏障的通透性增加，提高腦缺血性腦卒中后腦水腫和繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷的發(fā)生率。然而，隨后大腦血液的恢復(fù)則可能進(jìn)一步加重上述病理?yè)p傷機(jī)制。因此，CIRI 的病理過(guò)程主要包括細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬、血腦屏障破壞等，并最終導(dǎo)致大腦神經(jīng)元大量死亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙［3］。目前對(duì)缺血性腦卒中的治療主要受到幾種因素的限制，包括缺血后腦損傷的快速發(fā)展、細(xì)胞信號(hào)通路之間的復(fù)雜相互作用以及較窄的治療窗口［4］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）廣泛存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中［5］，參與RNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪接、細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生物學(xué)過(guò)程［6］。微小RNA（mi?croRNA，miRNA，miR）已被證明在炎癥性疾病、腫瘤性疾病和心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［7］。隨著對(duì)缺血再灌注損傷重視程度的提高和研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)包括lncRNA 與miRNA在內(nèi)的非編碼RNA 在缺血再灌注損傷的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。已有研究報(bào)道大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型血清中l(wèi)ncRNA 的水平存在顯著差異［8］，此外在腦卒中患者血液中，根據(jù)腦卒中亞型分類的不同，miRNA 的表達(dá)也存在顯著差異［9］，提示了lncRNA 和miRNA可能參與腦卒中的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，但詳細(xì)的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。本文主要就非編碼RNA在CIRI 中的相關(guān)分子機(jī)制作一綜述，旨在為CIRI的機(jī)制研究提供新思路。

1 非編碼RNA概述

全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）顯示，在人類基因組中，約有98%以上的基因組被轉(zhuǎn)錄，但能夠編碼蛋白質(zhì)的基因僅占總基因組的約3%，絕大多數(shù)基因沒(méi)有編碼潛力。人們以往將大量非編碼蛋白質(zhì)的基因稱為“噪音”或“垃圾“DNA，然而越來(lái)越多的研究表明，這種非編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本有很大一部分能夠作為RNA 分子，在細(xì)胞分子層面發(fā)揮重要的作用。非編碼RNA 可以分為小非編碼RNA（＜200 nt），即miRNA、轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA）和小核仁RNA（small nucleolar RNA），以及較長(zhǎng)的非編碼RNA（＞200 nt），包括核糖體RNA（ribosomal RNA）、天然反義轉(zhuǎn)錄本（natural antisense transcripts）和lncRNA［10］。其中l(wèi)ncRNA 與miRNA 被認(rèn)為是執(zhí)行功能最為重要及研究較多的兩類非編碼RNA。

lncRNA 是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。目前研究認(rèn)為，lncRNA 可以通過(guò)各種分子機(jī)制在多種生物學(xué)過(guò)程中擔(dān)任重要角色，如細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡和分化等［11］。lncRNA 能在不同水平上干擾基因的表達(dá)，如表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［12］。在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控階段，lncRNA 主要有以下幾種功 能：（1）lncRNA 結(jié) 合 前體 信使RNA（premRNA），干擾RNA 剪接體與目標(biāo)序列的結(jié)合，從而導(dǎo)致剪接變異體的形成；（2）lncRNA 能夠直接結(jié)合mRNA 并影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和翻譯過(guò)程；（3）作為miRNA 的 宿主基因，控制著miRNA 的形成；（4）lncRNA 含有與某些miRNA 的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，能夠直接結(jié)合目標(biāo)miRNA。因此，lncRNA 可以作為“分子海綿”“吸附”一些特定的miRNA，消除其對(duì)下游目標(biāo)mRNA 的抑制作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)了lncRNA 能夠作為mRNA 的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competitive en?dogenous RNA，ceRNA），調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種分子機(jī)制過(guò)程。

miRNA 是一類普遍存在的、保守的、內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度通常為19～25 個(gè)核苷酸，可通過(guò)互補(bǔ)序列特異性識(shí)別目標(biāo)靶向mRNA 的3'-非翻譯區(qū)域（untranslated region，UTR）以及引導(dǎo)RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）與靶向mRNA 結(jié)合，促進(jìn)mRNA 降解和翻譯抑制，在基因的轉(zhuǎn)錄后階段充當(dāng)調(diào)控因子［2，13］。據(jù)報(bào)道，miRNA 參與了許多生物學(xué)事件，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、激素分泌和個(gè)體發(fā)育［14］。多項(xiàng)研究顯示，通過(guò)合成miRNA 模擬物或者抑制劑寡核苷酸改變miRNA 的水平，在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物模型中能顯著減輕CIRI［15］，提示miRNA 干預(yù)可能在CIRI 中有很好的神經(jīng)保護(hù)作用。然而miRNA 在CIRI 中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

2 在CIRI中非編碼RNA對(duì)細(xì)胞凋亡的作用

細(xì)胞凋亡是由基因控制的程序性細(xì)胞死亡（pro?grammed cell death，PCD），在正常細(xì)胞周轉(zhuǎn)、免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能、胚胎發(fā)育和化學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中起著至關(guān)重要的作用，然而細(xì)胞凋亡不足可引起自身免疫疾病或癌癥［16］，腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡加速則可引起大腦繼發(fā)性缺血性損傷或神經(jīng)退行性病變。

2.1 lncRNA 在細(xì)胞凋亡中的作用 Tian 等［17］在體外氧-葡萄糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，OGD 后細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NR_120420 的表達(dá)顯著升高，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，敲除NR_120420 后核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65蛋白的磷酸化顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著下降，初步證明lncRNA NR_120420 的升高與CIRI 后細(xì)胞凋亡的加重密切相關(guān)。Xu 等［18］發(fā)現(xiàn)lncRNA CAMK2D 相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（CAMK2D-associ?ated transcript 1，C2DAT1）通過(guò)上調(diào)鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶IIδ（calcium/calmodulin-dependent pro?tein kinase II δ，CaMKIIδ）水平以及促進(jìn)NF-κB 抑制劑激酶α/β（inhibitor of NF-κB kinase α/β，IKKα/β）磷酸化，降低了缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。Yan等［19］在體內(nèi)外缺血再灌注模型中均發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3的表達(dá)上調(diào)，敲除MEG3 后細(xì)胞凋亡率降低。進(jìn)一步的研究表明，MEG3 過(guò)表達(dá)激活了p53 的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)了神經(jīng)元的死亡。此外，亦有研究報(bào)道在大鼠腦缺血再灌注模型中l(wèi)ncRNA MEG3 可能通過(guò)WNT/β-catenin 信號(hào)通路負(fù)調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）水平，提高神經(jīng)元的死亡率［20］。

除了調(diào)節(jié)下游靶點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，lncRNA 也能通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA 參與細(xì)胞的凋亡。Zhong 等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAINK4基因座中反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in theINK4locus，ANRIL）可以通過(guò)直接負(fù)調(diào)控miR-199a-5p 來(lái)提高陷窩蛋白1（caveolin-1，CAV-1）的表達(dá)，進(jìn)而激活MEK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated ki?nase，ERK）磷酸化，促進(jìn)OGD 誘導(dǎo)的N2a（Neuro-2a）細(xì)胞的抗凋亡作用。此外，Liu 等［22］報(bào)道ANRIL能夠直接抑制miR-127 水平，促進(jìn)了髓系細(xì)胞白血病1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）基因的表達(dá)，增加細(xì)胞活力和減少細(xì)胞的凋亡。Gao 等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS5 在體內(nèi)深低溫停循環(huán)（deep hy?pothermic circulatory arrest，DHCA）大鼠模型中高表達(dá)，通過(guò)“分子海綿”機(jī)制直接結(jié)合并下調(diào)了miR-23a的表達(dá)，從而提高了PTEN 和Bax 蛋白的水平，降低了Bcl-2 和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）磷酸化水 平，誘 導(dǎo) 細(xì) 胞 的 凋 亡。Wei 等［24］報(bào) 道lncRNA AK038897 能 作為miR-26a-5p 的ceRNA，抑制miR-26a-5p 表達(dá)，提高下游靶向mRNA DAPK1 的表達(dá)水平，加重腦缺血再灌注后神經(jīng)元的死亡和神經(jīng)功能障礙。

2.2 miRNA 在細(xì)胞凋亡中的作用 彭志鋒等［25］利用體外OGD/R 細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b過(guò)表達(dá)能夠靶向抑制自噬相關(guān)蛋白5（autophagy-related protein 5，Atg5）的表達(dá)，顯著提高了神經(jīng)元的凋亡率，而miR-181b 拮抗劑則能夠顯著上調(diào)Atg5 的表達(dá)水平，減輕神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Chen 等［26］發(fā)現(xiàn)，miR-1306-5p 在體外OGD/R 模型中表達(dá)下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-1306-5p可以抑制胱天蛋白酶3（caspase-3）激活和細(xì)胞凋亡，顯著提高細(xì)胞活力。雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告實(shí)驗(yàn)證明，miR-1306-5p 與BIK（Bcl-2-interacting killer）的mRNA 直接結(jié)合。提高BIK 的表達(dá)能夠增加乳酸脫氫酶（lactate dehydro?genase，LDH）的釋放，提高caspase-3 的活性，從而逆轉(zhuǎn)miR-1306-5p 對(duì)OGD/R 處理的保護(hù)作用。Fang等［27利用缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-128能夠負(fù)調(diào)節(jié)靶向Wnt1 mRNA，提高Bcl-2、降低Bax的水平，從而減輕腦組織損傷程度并提高小鼠的學(xué)習(xí) 和 記 憶 能力］。Yao 等［28］在SH-SY5Y 細(xì) 胞系 的OGD/R 模型中觀察到BCL2L14基因的表達(dá)上調(diào)；BCL2L14是Bcl-2 家族的促凋亡成員，敲除BCL2L14降低了細(xì)胞的死亡率；進(jìn)一步研究證實(shí)BCL2L14是miR-496 的潛在靶點(diǎn)，miR-496 通過(guò)直接下調(diào)BCL2L14來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，在CIRI中發(fā)揮保護(hù)作用。因此，lncRNA 和miRNA 能夠通過(guò)調(diào)控下游目標(biāo)靶點(diǎn)參與腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

3 在CIRI中非編碼RNA對(duì)炎癥損傷的作用

在正常情況下，炎癥是一種對(duì)抗入侵的病原體，恢復(fù)受損的細(xì)胞，并保護(hù)組織健康的細(xì)胞分子過(guò)程［29］。然而，在腦IR 的病理?xiàng)l件下，過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞、趨化白細(xì)胞、釋放炎癥因子以及發(fā)生腦水腫，從而加重大腦神經(jīng)功能損傷。

3.1 lncRNA 在炎癥中的作用 Feng 等［30］通過(guò)臨床上對(duì)急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者和非AIS 患者的研究發(fā)現(xiàn)，AIS 患者中l(wèi)n?cRNA ANRIL 的表達(dá)低于對(duì)照組；使用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，ANRIL 的表達(dá)與AIS 患者的疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；ANRIL 的表達(dá)與 超 敏C 反 應(yīng) 蛋白（hypersensitive C-reactive pro?tein，HSCRP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fac?tor α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）的水平呈負(fù)相關(guān)，而與IL-10 的水平呈正相關(guān)關(guān)系，這些結(jié)果表明lncRNA ANRIL 作為一種抗炎基因參與AIS 的進(jìn)展，其表達(dá)水平的下調(diào)與AIS 患者腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增加、疾病嚴(yán)重程度升高和炎癥升高有關(guān)。Zhang 等［31］在大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain micro?vascular endothelial cells，BMECs）的OGD 模型中發(fā)現(xiàn)，lncRNA 人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的表達(dá)是下降的；進(jìn)一步的研究證實(shí)，MALAT1 能夠通過(guò)抑制促炎癥因子IL-6、單核細(xì)胞趨 化 蛋 白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和E-選擇素（E-selectin）的表達(dá)發(fā)揮抗炎癥作用。此外，Qi 等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 小核仁RNA 管 家基 因14（small nucleolar RNA host gene 14，SNHG14）通過(guò)抑制miR-145-5p，提高靶向胞漿磷脂酶A2 組4A（cytosolic phospholipase A2 group IVA，PLA2G4A）mRNA 的水平，從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α、NO 等促炎癥因子，引發(fā)更為嚴(yán)重的神經(jīng)功能損害。

3.2 miRNA 在炎癥中的作用 Tian 等［33］在大鼠MCAO 和OGD/R 模型中發(fā)現(xiàn)miR-216a 的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)miR-216a 可以減少靶基因Janus 酪氨酸激酶2（Janus tyrosine kinase 2，JAK2）和下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal trans?ducer and activator of transcription 3，STAT3）的磷酸化水平，抑制炎癥相關(guān)酶如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（in?ducible nitric oxide synthase，iNOS）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 的釋放，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Feng等［34］的研究發(fā)現(xiàn)，在抑制miR-301a的表達(dá)之后，大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積顯著降低，提示下調(diào)miR-301a 可能在腦IR 損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。隨后研究證實(shí)，抑制miR-301a 能夠上調(diào)靶基因NDRG2 的水平，從而抑制NF-κB，下調(diào)促炎癥因子TNF-α、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-6 和IL-1β的表達(dá)，發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)。亦有研究報(bào)道m(xù)iR-199a-5p通過(guò)下調(diào)DDR1基因的表達(dá)，降低NF-κb和下游促炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的水平［35］。在體外OGD/R 模型中研究發(fā)現(xiàn)miR-127 水平顯著升高，阻止了SIRT1 的mRNA 表達(dá)，降低AMP 活化蛋白激酶α（AMP-activated protein kinase α，AMPK-α）磷酸化，提高神經(jīng)元p65 蛋白磷酸化水平，增強(qiáng)了神經(jīng)元的炎癥反應(yīng)［36］。一些研究報(bào)道在體內(nèi)和體外缺氧模型中，miR-145和miR-216a的表達(dá)均下調(diào)，從而提高了下游靶基因Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，經(jīng)過(guò)NF-κB通路促進(jìn)促炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的釋放［37-38］。上述結(jié)果表明，lncRNA 和miRNA 均能在腦IR 后的炎癥反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

4 在CIRI中非編碼RNA對(duì)氧化應(yīng)激的作用

氧化應(yīng)激是由于機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生氧自由基相關(guān)酶系統(tǒng)和清除自由基相關(guān)酶系統(tǒng)之間的不平衡而引發(fā)的一系列生物學(xué)事件。研究發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen spe?cies，ROS）可直接對(duì)腦細(xì)胞中的DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其他大分子造成損傷［39］。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激在腦水腫、炎癥和凋亡的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，并促進(jìn)CIRI 后繼發(fā)性神經(jīng)功能缺損。

4.1 lncRNA 在氧化應(yīng)激中的作用 Yao 等［40］發(fā)現(xiàn)大鼠缺血再灌注后腦組織中l(wèi)ncRNA RIAN 的表達(dá)顯著降低，而在體外OGD 處理的N2a 細(xì)胞中miR-144-3p 的表達(dá)升高，通過(guò)RNA 免疫沉淀和RT-qPCR 證實(shí)了RIAN 能夠直接結(jié)合miR-144-3p。進(jìn)一步研究表明，miR-144-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控GATA3基因，提高細(xì)胞中Bax、caspase-3、ROS 以及降低Bcl-2 的水平，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞的凋亡；而過(guò)表達(dá)RIAN 和GATA3 均能減輕miR-144-3p 誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激以及降低細(xì)胞凋亡率，因此RIAN可能作為ceRNA吸附結(jié)合miR-144-3p，上調(diào)GATA3 的表達(dá)，延緩CIRI的進(jìn)展。如前所述，RIAN/miR-144-3p/GATA3 信號(hào)可能是一種新的、潛在有效的CIRI治療方法。然而，目前對(duì)于lncRNA 在神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

4.2 miRNA在氧化應(yīng)激中的作用 Zhang等［41］在體外OGD/R 細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF15 基因能夠誘導(dǎo)糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）表達(dá)失活，提高核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）表達(dá)和激活Nrf2/抗氧化反應(yīng)原件（antioxidant response element，ARE）信號(hào)通路，減輕ROS的產(chǎn)生，減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)和減少神經(jīng)元凋亡。進(jìn)一步的研究表明，miR-302b-3p 作為FGF15 的上游miRNA，負(fù)向調(diào)節(jié)FGF15，干擾FGF15對(duì)神經(jīng)元的積極保護(hù)作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)miR-29能夠靶向抑制KEAP1（Kelch-like ECH-associated protein 1）的表達(dá)水平，提高Nrf2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞內(nèi)ROS 水平發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用［42］。Huang 等［43］利用H2O2誘導(dǎo)B35 細(xì)胞氧化損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-34b亦可通過(guò)下調(diào)KEAP1的表達(dá)，激活下游Nrf2信號(hào)蛋白的表達(dá)，影響NO、3-硝基酪氨酸（3-nitroty?rosine，3-NT）、超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dis?mutase，SOD）和錳超氧化物歧化酶（manganese su?peroxide dismutase，MnSOD）水平，改善H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。然而，Liang 等［44］發(fā)現(xiàn)，OGD/R 處理的PC12 細(xì)胞中miR-125b 的表達(dá)顯著升高；miR-125b 通過(guò)下調(diào)CH2α，誘導(dǎo)NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）2 和NOX4 活化，提高ROS 水平，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

5 在CIRI中非編碼RNA對(duì)自噬的作用

自噬是細(xì)胞在應(yīng)激或者缺乏營(yíng)養(yǎng)的狀態(tài)下進(jìn)行自我分解的過(guò)程［45］。作為一種溶酶體依賴的降解途徑，自噬廣泛存在于細(xì)胞正常的生理過(guò)程中，通過(guò)降解衰老、損傷細(xì)胞器維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及通過(guò)吞噬細(xì)胞內(nèi)微生物病原體行使天然免疫功能，然而自噬過(guò)度或自噬不足都可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡（II 型PCD）［46］。事實(shí)上，細(xì)胞自噬功能障礙參與了多種疾病的發(fā)生機(jī)制，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［47］。目前研究發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可以減輕或加重腦損傷，但人們對(duì)于自噬在腦IR損傷中的具體機(jī)制還未十分清楚。

5.1 lncRNA 在細(xì)胞自噬中的作用 Li 等［48］研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-26b的表達(dá)和功能，參與OGD/R 條件下BMECs 的自噬過(guò)程。在缺氧條件下，miR-26b 的過(guò)表達(dá)抑制BMECs 的自噬和提高其凋亡率，而MALAT1則逆轉(zhuǎn)了miR-26b的消極作用。以往的研究報(bào)道ULK2 參與了由mTOR 啟動(dòng)以及自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，ATG）相關(guān)的自噬過(guò)程［49］。在此研究中研究者發(fā)現(xiàn)BMECs 中ULK2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)升高，雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ULK2 是miR-26b 的直接靶點(diǎn)，因此該研究提示MALAT1/miR-26b/ULK2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能參與了細(xì)胞的自噬過(guò)程。然而，Guo 等［50］的研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)外缺血再灌注模型中MALAT1 的表達(dá)顯著升高，過(guò)表達(dá)MALAT1 負(fù)向調(diào)控miR-30a 的功能，減弱了miR-30a對(duì)其靶向mRNA beclin-1 的抑制作用，提高了beclin-1依賴的自噬過(guò)程，促進(jìn)神經(jīng)元死亡和加重缺血性腦梗死。而下調(diào)MALAT1 的水平通過(guò)miR-30a抑制be?clin-1依賴的自噬途徑，減輕神經(jīng)元細(xì)胞死亡。

5.2 miRNA 在細(xì)胞自噬中的作用 Sun 等［51］的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-298 抑制了NF-κB 激活因子1（NF-κB activator 1，Act1）的表達(dá)，增加了下游c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和Bcl-2 的 磷 酸 化 及beclin-1 的 水 平，降 低 了NF-κB 和mTOR的磷酸化水平，而NF-κB的磷酸化可以通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR 信號(hào)通路抑制自噬，因此過(guò)表達(dá)miR-298可能通過(guò)直接調(diào)節(jié)Act1/JNK/NF-κB 通路，激活細(xì)胞的自噬過(guò)程，促進(jìn)了缺血性腦卒中后的神經(jīng)元死亡。該團(tuán)隊(duì)的另一研究報(bào)道，miR-215 可以通過(guò)抑制Act1 蛋白的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，在大鼠MCAO模型中，miR-215的表達(dá)顯著下降，伴隨著Act1、白細(xì)胞介 素17 受 體A（interleukin-17 receptor A，IL-17RA）、JNK、p-Bcl-2 和beclin-1 水平的增加，導(dǎo)致自噬過(guò)程被激活。這些結(jié)果表明miR-215 通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)Act1/IL-17RA 和 抑 制JNK/p-Bcl-2/beclin-1 通 路 來(lái) 抑制自噬［52］。此外，在CIRI 后，大鼠腦海馬CA1 區(qū)的miR-138 表達(dá)下 調(diào)，其 下游SIRT1 的mRNA 表 達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致beclin-1 和LC3-II 的水平升高，從而激活細(xì)胞的自噬過(guò)程，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用［53］。因此，雖然已有研究表明lncRNA 和miRNA 均能夠參與細(xì)胞自噬過(guò)程，但其在CIRI 中的作用機(jī)制仍存在較大的爭(zhēng)議。

6 miRNA在血腦屏障中的作用

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是由具有緊密連接（tight junction，TJ）結(jié)構(gòu)的大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。TJ蛋白破壞、內(nèi)皮細(xì)胞死亡、TJ蛋白與細(xì)胞骨架偶聯(lián)減少，都可能破壞血腦屏障的完整性，促使大量的炎癥因子進(jìn)入缺血損傷區(qū)，加重細(xì)胞的死亡和大腦神經(jīng)功能障礙［54］。

Wu 等［55］通過(guò)共培養(yǎng)大鼠BMECs 和星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外建立了模擬BBB 模型，研究發(fā)現(xiàn)miR-9-5p的上調(diào)可以減輕大鼠BBB 損傷和炎癥反應(yīng)。過(guò)表達(dá)miR-9-5p 通過(guò)下調(diào)PTCH-1 來(lái)提高血腦屏障緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白ZO-1、occludin 和claudin 5 水平。此外，過(guò)表達(dá)miR-9-5p通過(guò)激活Hedgehog 通路促進(jìn)NF-κB和Akt/GSK3β 通路，降低細(xì)胞中MMP-9、IL-1β、IL-6和TNF-α 的水平，從而降低BMECs 的凋亡和BBB 的通透性。亦有研究報(bào)道，miR-539 能夠抑制MMP-9基因的表達(dá)，提高血腦屏障的通透性［56］。Armulik等［57］的研究發(fā)現(xiàn)，MCAO 大鼠的大腦缺血邊界區(qū)（ischemic boundary zone，IBZ）中miR-149-5p 的表達(dá)降低，而S1PR2 的表達(dá)顯著增加。周細(xì)胞能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接，其與BMECs 的相互支持對(duì)于血腦屏障的形成和維持維持血腦屏障的完整性至關(guān)重要。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血管周細(xì)胞中的S1PR2的升高能夠誘導(dǎo)周細(xì)胞的遷移和抑制N-鈣黏附蛋白（N-cadherin）的表達(dá)，從而導(dǎo)致BBB 通透性升高。隨后研究證實(shí)S1PR2 是miR-149-5p 的直接靶點(diǎn)，過(guò)表達(dá)miR-149-5p 可顯著抑制周細(xì)胞遷移，增加N-cad?herin 的表達(dá)，改善缺血性腦卒中后BBB 的通透性［58］。

7 在CIRI中非編碼RNA對(duì)血管生成的作用

血管生成是指在已有的毛細(xì)血管基礎(chǔ)上形成的新的血管，在大腦發(fā)生缺血缺氧性損傷后，血管生成可為大腦提供血液營(yíng)養(yǎng)和氧氣，減輕腦缺血缺氧狀態(tài)，從而加速大腦損傷組織的恢復(fù)，最終促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［59］。因此，促進(jìn)血管生成可作為治療缺血性腦卒中的一種可靠的臨床策略。

7.1 lncRNA 在血管生成中的作用 Liu 等［60］的研究報(bào)道，大鼠MCAO 模型后lncRNA MEG3 的表達(dá)下調(diào)，刺激Notch 和Notch 通路靶基因HES-1 和HEY-1的表達(dá)，促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成，而過(guò)表達(dá)lncRNA MEG3 則抑制了上述過(guò)程，延緩了腦卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)。Wang 等［61］發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1 通過(guò)下調(diào)miR-199a 來(lái)提高低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)了血管形成；在體外OGD/R條件下，過(guò)表達(dá)lncRNA SNHG1 促進(jìn)了BMECs 的增殖遷移和毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)的形成，這闡明了SNHG1在OGD 損傷后血管形成的作用和機(jī)制。Zhou 等［62］在體外實(shí)驗(yàn)中研究表明，lncRNA NEAT1 可直接靶向下調(diào)miR-377 的表達(dá)，提高BMECs 的活力和血管生成；miR-377通過(guò)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascu?lar endothelial growth factor A，VEGFA）、SIRT1和bclxl基因的表達(dá)，從而抑制OGD 后BMECs 的細(xì)胞活力，而NEAT1 則抵消了miR-377 的抑制作用，因此，lncRNA NEAT1 可能作為一種ceRNA 參與腦缺血損傷的過(guò)程。

7.2 miRNA 在血管生成中的作用 Du 等［63］發(fā)現(xiàn)AIS 患者血漿中miR-191 的水平升高，隨后在體內(nèi)和體外OGD/R研究中證實(shí)了這一觀點(diǎn)。在人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì) 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中過(guò)表達(dá)的miR-191 直接抑制Vezf1，導(dǎo)致Vezf1靶向的包括內(nèi)皮素1（endothelin 1，EDN1）、MMP1 和STMN1（stathmin 1）在內(nèi)的血管生成相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，影響HUVECs 的增殖、遷移和血管形成。Liang 等［64］研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)在體外OGD/R 模型中，miR-26a 高表達(dá)通過(guò)PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)HIF-lα 和VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)了BMECs的增殖和管腔形成。Qu 等［65］發(fā)現(xiàn)在大鼠MCAO 后，過(guò)表達(dá)miRNA-126有助于大腦血管形成和神經(jīng)功能的恢復(fù)。隨后體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)miRNA-126 通過(guò)下調(diào)PTPN9 及激活A(yù)KT 和ERK 通路，提高了HUVECs 的增殖、遷移和管腔形成。除此之外，miR-126 還增加了血管長(zhǎng)度和血管直徑，提示miR-126 有利于促進(jìn)血管重塑，對(duì)缺血性腦卒中的治療和神經(jīng)功能的整體恢復(fù)具有重要的生物學(xué)意義。

如前所述，lncRNA 和miRNA 均參與了大腦缺血損傷后血管生成的一系列機(jī)制過(guò)程，為臨床上通過(guò)促進(jìn)血管生成來(lái)改善損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

8 總結(jié)與展望

綜上所述，越來(lái)越多的研究證實(shí)了以lncRNA 和miRNA 為代表的非編碼RNA 在CIRI 中所扮演的角色和其重要的功能。lncRNA 和miRNA 通過(guò)調(diào)控下游靶分子的表達(dá)，參與了腦IR 損傷中的細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激、自噬、血管生成等生物學(xué)過(guò)程（表1）。

然而，由于lncRNA和miRNA結(jié)構(gòu)和功能的多樣性、時(shí)間空間上的多態(tài)性以及在物種之間的保守性差，阻礙了人們探索其詳細(xì)的生物學(xué)作用機(jī)制和功能，因此目前人們對(duì)于lncRNA和miRNA在缺血性腦卒中的具體作用機(jī)制尚未完全清楚。隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)將會(huì)識(shí)別出更多的與腦缺血損傷相關(guān)的lncRNA 和miRNA，闡明它們之間的相互作用機(jī)制，將有助于今后為缺血性腦卒中提供新的診斷依據(jù)、防治方法和判斷預(yù)后提供新的理論數(shù)據(jù)支持。因此，lncRNA 和miRNA 未來(lái)有望成為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的診治的特異性標(biāo)志物和新藥作用靶點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 參與腦缺血再灌注損傷病理機(jī)制的lncRNAs和miRNAsTable 1. The lncRNAs and miRNAs involved in the pathogene?sis of cerebral ischemia-reperfusion injury