氧糖剝奪/復(fù)氧所致細(xì)胞焦亡在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用*

肖宗懿， 王小燕， 易 寒， 宋 娟， 安雨軒， 王壽勇

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院麻醉科，國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400014）

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是體外循環(huán)所致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的基本病理生理改變之一，它繼發(fā)于缺血再灌注和高炎性因子背景之下［1］。細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，它區(qū)別于其它程序性細(xì)胞死亡方式的最顯著特點(diǎn)是伴隨強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)［2］。研究表明，缺血再灌注是誘發(fā)多種細(xì)胞發(fā)生焦亡的有效外界刺激因素［3-6］，但體外循環(huán)相關(guān)性肺損傷中是否涉及微血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡機(jī)制，目前尚不清楚。本研究擬以人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human pulmo?nary microvascular endothelial cells，HPMVECs）為研究對(duì)象，通過(guò)建立氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose de?privation/reoxygenation，OGD/R）細(xì)胞模型，來(lái)模擬體外循環(huán)中HPMVECs的缺血再灌注過(guò)程，觀察OGD/R是否誘發(fā)細(xì)胞焦亡，為進(jìn)一步理解體外循環(huán)所致急性肺損傷發(fā)生機(jī)制提供新的理論參考。

材料和方法

1 細(xì)胞株和主要試劑

原代HPMVECs 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。ECM 完全培養(yǎng)基購(gòu)自Sciencell；無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自邁晨科技有限公司；ELISA 試劑盒購(gòu)自欣博盛公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購(gòu)自南京建成；MTT試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；Trizol 購(gòu)自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自MedChemExpress；兔抗人caspase-1多克隆抗體、兔抗人核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleo?tide-binding oligomerization domain-like receptor pro?tein 3，NLRP3）多克隆抗體、兔抗人含caspase 募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment do?main，ASC）多克隆抗體和鼠源GAPDH 抗體均購(gòu)自Proteintech；山羊抗兔Ⅱ抗和兔抗鼠Ⅱ抗購(gòu)自成都正能生物；caspase-1抑制劑VX-765購(gòu)自APExBIO。

2 主要方法

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選HPMVECs 適宜OGD/R 的條件內(nèi)皮細(xì)胞用ECM 完全培養(yǎng)基（含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子）在37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)，每1～2 d 換液，細(xì)胞密度達(dá)90%以上時(shí)進(jìn)行傳代。取3～4 代細(xì)胞進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞接種于96孔板上（每孔25 000～30 000個(gè)），并分為對(duì)照（control）組和OGD/R 各組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。control 組全程平行對(duì)照培養(yǎng)，僅與各OGD/R 組平行時(shí)點(diǎn)實(shí)施更換完全培養(yǎng)基操作；OGD/R 組分別采用DMEM 無(wú)糖培養(yǎng)基于94%N2、1%O2、5%CO2條件下培養(yǎng)2、4 和8 h，然后采用與對(duì)照組相同條件復(fù)糖復(fù)氧繼續(xù)培養(yǎng)12 h。處理結(jié)束后采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示OGD 處理8 h 細(xì)胞活力顯著降低，且細(xì)胞形態(tài)改變類似細(xì)胞焦亡，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用OGD 8 h、恢復(fù)12 h為本研究實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取3～4 代細(xì)胞分為control 組、OGD/R 組和VX-765（caspase-1 抑制劑）組。OGD/R 組按照預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選條件培養(yǎng)；control 組不實(shí)施OGD/R 處理，僅在平行時(shí)點(diǎn)更換新鮮培養(yǎng)液；VX-765 組在OGD/R 之前4 h 給予VX-765（50 μmol/L）處理，其余培養(yǎng)條件同OGD/R組。

2.3 RT-qPCR 法 檢 測(cè)caspase-1、NLRP3 和ASC 的mRNA 水平 用Trizol 法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，使用SYBR Green 進(jìn)行RT-qPCR，目標(biāo)基因引物見(jiàn)表1。逆轉(zhuǎn)錄的條件設(shè)定為：25℃5 min，42℃30 min，85℃2 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件設(shè)定為：95℃3 min；95℃10 s，60℃30 s，共39個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

表1 RT-qPCR引物合成序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.4 Western blot法檢測(cè)caspase-1、NLRP3和ASC的蛋白水平 細(xì)胞處理結(jié)束后，PBS 清洗并用胰酶消化，收集細(xì)胞沉淀，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度后將蛋白煮沸12 min 變性。以20 μg蛋白上樣至10%的聚丙烯酰胺凝膠，通過(guò)SDSPAGE將蛋白混合樣分離。再250 mA轉(zhuǎn)膜2 h，用5%脫脂牛奶封閉90 min，TBST清洗3次，每次5 min。加入特異性Ⅰ抗，4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST清洗4次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育2 h，TBST清洗4 次，每次10 min。以GAPDH 為內(nèi)參照，ECL 曝光顯影，結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

2.5 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 和IL-18 濃度及LDH 活性 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，4℃、1 000×g 離心20 min，吸取上清液，于-80℃冰箱備用。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀中讀取波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度（A），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中IL-1β 和IL-18 濃度。采用LDH 試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中LDH 活性：LDH 活性（U/L）=（測(cè)定孔A 值-對(duì)照孔A 值）/（標(biāo)準(zhǔn)孔A 值-空白孔A值）×標(biāo)準(zhǔn)孔濃度（0.2 μmol/L）×1 000。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較先采用單因素方差分析，然后采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HPMVECs適宜OGD/R的條件篩選

MTT 結(jié)果顯示，OGD 處理2、4 和8 h 再?gòu)?fù)氧12 h的HPMVECs 相對(duì)于control 組的細(xì)胞活力分別為（94.0±0.7）%、（79.1±4.6）%及（69.3%±3.5）%；與control組相比，OGD處理4 h細(xì)胞活力開(kāi)始降低，8 h時(shí)已出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。顯微鏡下觀察到control 組細(xì)胞多呈現(xiàn)出紡錘體形，細(xì)胞連接緊密，排列成鋪路石樣；而OGD 處理8 h 后細(xì)胞明顯變圓變腫脹，細(xì)胞排列疏松，漂浮細(xì)胞增多，形態(tài)學(xué)改變與細(xì)胞焦亡特點(diǎn)類似，見(jiàn)圖1B。

Figure 1. Selection of the suitable OGD/R condition for HPMVECs. A：the effect of OGD/R on cell viability；B：morphological changes of the cells were observed under inverted microscope（×200）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group.圖1 篩選HPMVECs適宜OGD/R的條件

2 OGD/R對(duì)HPMVECs中焦亡相關(guān)分子mRNA和蛋白表達(dá)的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與control 組相比，OGD/R組焦亡相關(guān)分子caspase-1、NLRP3 和ASC 的mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；采用VX-765 處理后，OGD/R 引起焦亡相關(guān)分子表達(dá)上調(diào)的作用被抑制（P＜0.05），其中VX-765 組caspase-1 的mRNA 表達(dá)水平還低于control組（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2. The effects of OGD/R on the mRNA expression levels of caspase-1，NLRP3 and ASC in HPMVECs. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OGD/R group.圖2 OGD/R 對(duì)HPMVECs 中caspase-1、NLRP3 和ASC mRNA表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，OGD/R處理后焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、NLRP3 和ASC 的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；使用VX-765 處理后，OGD/R 引起的焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)被抑制（P＜0.05），并且VX-765 組caspase-1 的蛋白表達(dá)水平還低于control組（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

3 OGD/R對(duì)上清液中IL-1β和IL-18水平的影響

ELISA 結(jié)果顯示，經(jīng)OGD/R 處理后細(xì)胞上清液中IL-1β 和IL-18 的含量均顯著增加（P＜0.05）；經(jīng)VX-765 處理后，VX-765 組細(xì)胞上清液中IL-1β 和IL-18 的含量較OGD/R 組降低（P＜0.05），但與control組水平相近，見(jiàn)圖4。

Figure 3. The effects of OGD/R on the protein expression levels of caspase-1，NLRP3 and ASC in HPMVECs. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OGD/R group.圖3 OGD/R 對(duì)HPMVECs 中caspase-1、NLRP3 和ASC 蛋白表達(dá)的影響

Figure 4. The effects of OGD/R on the levels of IL-1β and IL-18 in the supernatant. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs con?trol group；#P＜0.05 vs OGD/R group.圖4 OGD/R對(duì)上清液中IL-1β和IL-18表達(dá)的影響

4 OGD/R對(duì)LDH水平的影響

LDH 檢測(cè)結(jié)果顯示，與control 組比較，OGD/R組LDH 水平升高（P＜0.05）；VX-765 處理后，LDH 水平恢復(fù)至control組水平（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的HPMVECs 經(jīng)OGD/R處理后，活力降低，胞體腫脹變圓，排列疏松，漂浮細(xì)胞增多，并伴有上清液中IL-1β 和IL-18濃度升高，提示OGD/R 可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡；同時(shí)，OGD/R 后，HPMVECs 細(xì)胞 焦 亡相 關(guān) 分子caspase-1、NLRP3 和ASC的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且可被焦亡抑制劑VX-765所抑制。本研究還發(fā)現(xiàn)，OGD/R后培養(yǎng)上清中細(xì)胞損傷標(biāo)志物L(fēng)DH 水平升高，而VX-765處理能抑制此種改變。這些結(jié)果提示本研究條件下，OGD/R可通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞焦亡而導(dǎo)致HPMVECs損傷。

Figure 5. The effect of OGD/R on the LDH level. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OGD/R group.圖5 OGD/R對(duì)LDH水平的影響

細(xì)胞焦亡是一種caspase 依賴性的細(xì)胞程序性死亡，主要通過(guò)連接蛋白ASC 的pyrin 和CARD 結(jié)構(gòu)域招募NLRP3 等炎性蛋白和caspase-1 前體，形成炎癥小體并引起下游caspase-1 活化，后者通過(guò)催化GSDMD 蛋白及IL-1β 和IL-18 前體裂解，分別引起胞膜完整性破壞，以及IL-1β 和IL-18的活化和釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)［7-9］。本研究中，OGD/R處理后，細(xì)胞焦亡關(guān)鍵分子caspase-1、NLRP3 和ASC 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中焦亡標(biāo)志性蛋白IL-1β 和IL-18 水平升高，這表明OGD/R 后，細(xì)胞焦亡關(guān)鍵信號(hào)通路被激活。caspase-1 是焦亡最主要的信號(hào)分子之一，VX-765 是其選擇性抑制劑，可抑制其表達(dá)和活性［10］。本研究中，預(yù)先采用VX-765處理后，上述焦亡信號(hào)通路關(guān)鍵分子的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)下調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中焦亡標(biāo)志性蛋白IL-1β 和IL-18 水平基本恢復(fù)至對(duì)照組水平，表明VX-765可抑制OGD/R所致的細(xì)胞焦亡。

檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH可反映細(xì)胞損傷程度及細(xì)胞膜完整性［11］。細(xì)胞焦亡的形態(tài)特征改變包括細(xì)胞腫脹、變形，細(xì)胞膜完整性破壞，胞漿內(nèi)物質(zhì)漏出［12］。本研究中OGD/R 后上清液中LDH 水平升高反映細(xì)胞膜完整性被破壞，結(jié)合上清中焦亡標(biāo)志性蛋白IL-1β 和IL-18 水平升高，以及VX-765 可以逆轉(zhuǎn)上述改變，可以進(jìn)一步證明OGD/R 通過(guò)細(xì)胞焦亡途徑引起細(xì)胞損傷的事實(shí)。本研究還發(fā)現(xiàn)，使用VX-765 后，細(xì)胞caspase-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，這表明VX-765 可抑制caspase-1 的基礎(chǔ)表達(dá)，其意義有待進(jìn)一步探討。

細(xì)胞焦亡的發(fā)生依賴于caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典途徑以及caspase-4、caspase-5和caspase-11介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑［13］。本研究證實(shí)OGD/R 可激活HPMVECs 經(jīng)典焦亡途徑，本研究條件下是否同時(shí)激活caspase-4、caspase-5 和caspase-11 依賴的非經(jīng)典途徑尚有待進(jìn)一步研究。

本研究利用OGD/R模擬臨床上體外循環(huán)過(guò)程中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注過(guò)程。肺缺血再灌注是體外循環(huán)中最突出的病理刺激，HPMVECs結(jié)構(gòu)和功能損壞是其最重要的病理生理特點(diǎn)，且發(fā)生于高炎癥因子水平背景之下，這與細(xì)胞焦亡發(fā)生條件存在一致性［14］。因此，本研究結(jié)果可能提示體外循環(huán)過(guò)程中因肺缺血再灌注引發(fā)的急性肺損傷可能有肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡機(jī)制參與。但是本研究條件下體外培養(yǎng)細(xì)胞的OGD/R條件和環(huán)境與臨床實(shí)際情況可能存在諸多不一致，臨床條件下尚包括全身炎癥反應(yīng)綜合征、低溫與復(fù)溫、腸道內(nèi)毒素轉(zhuǎn)位、手術(shù)創(chuàng)傷、酸堿平衡與電解質(zhì)變化、凝血與纖溶系統(tǒng)改變等［15］。因此，細(xì)胞焦亡機(jī)制是否參與臨床條件下體外循環(huán)相關(guān)性急性肺損傷仍需通過(guò)臨床相關(guān)研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，OGD/R可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的HPMVECs發(fā)生焦亡，抑制細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑可緩解OGD/R 對(duì)HPMVECs 的損傷，這提示臨床上體外循環(huán)相關(guān)性急性肺損傷可能有肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡機(jī)制參與，但尚有待進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。