莪術(shù)醇通過上調(diào)miR-214抑制TGF-β誘導(dǎo)的RL-95細胞生長及纖維化相關(guān)蛋白表達*

田瀅舟， 陳思達， 梁雪芳， 曹立幸， 具春花， 陳 頤

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，廣東廣州510120）

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的良性、雌激素依賴性婦科疾病，以子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)異位至卵巢或盆腔內(nèi)其它部位生長為特征。在雌激素作用下，異位內(nèi)膜發(fā)生周期性脫落、增生和纖維化，導(dǎo)致瘢痕化和組織功能改變，是不孕和疼痛的主要原因［1］。育齡女性子宮內(nèi)膜異位癥患病率高達10%，嚴重影響女性生活質(zhì)量和生命健康［2］。莪術(shù)醇（curcumol）是從姜科植物莪術(shù)揮發(fā)油中分離的雙環(huán)倍半萜類成分，具有顯著的抗腫瘤作用。研究表明，莪術(shù)醇可能通過抑制腹腔微環(huán)境中炎癥反應(yīng)而減輕實驗性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥［3］。此外，莪術(shù)醇通過靶向抑制肝星狀細胞活化、遷移和黏附而具有抗纖維化作用［4］。然而，莪術(shù)醇對子宮內(nèi)膜異位癥纖維化的影響尚不清楚。微小RNA（mi?croRNA，miRNA，miR）是一種短鏈非編碼RNA，通過抑制翻譯或降解靶mRNA 調(diào)控基因表達參與各種生物過程，是機體發(fā)育和細胞穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑，異常表達的miRNA 已被證實與包括子宮內(nèi)膜異位癥在內(nèi)的多種人類疾病有關(guān)［5-6］。研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥中纖維化標志物表達上調(diào)與miR-214 表達下調(diào)相關(guān)，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞來源的外泌體miR-214 可抑制子宮內(nèi)膜異位癥纖維化［7］。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是纖維化過程中的關(guān)鍵分子，本研究以TGF-β 誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌RL-95 細胞建立子宮內(nèi)膜異位癥細胞模型［8］，探討miR-214 在莪術(shù)醇抗子宮內(nèi)膜異位癥纖維化形成中的作用，以期為子宮內(nèi)膜異位癥纖維化的治療提供有效策略。

材料和方法

1 細胞和主要試劑

RL-95 細胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。TGF-β 購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；莪術(shù)醇（純度≥98%）購于上海紫一試劑廠；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA 檢測試劑盒購于北京天根生化科技研究所；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）和細胞周期檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗兔源α-平滑肌肌動蛋白（α-mooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體、抗鼠源I 型膠原（collagen type I，Col I）單克隆抗體、抗兔源磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體、羊抗兔IgG 和羊抗鼠IgG 購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和子宮內(nèi)膜異位癥細胞模型的構(gòu)建 RL-95 細胞采用含5 μg/L TGF-β、10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)液在5% CO2、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 實驗分組和細胞處理 實驗分為對照（control）組（不做處理）、TGF-β 組（用含5 μg/L TGF-β 的培養(yǎng)液孵育細胞24 h）、TGF-β+低劑量莪術(shù)醇組（用含5 μg/L TGF-β 和7.5 mg/L 莪術(shù)醇的培養(yǎng)液孵育細胞24 h）、TGF-β+中劑量莪術(shù)醇組（用含5 μg/L TGF-β和15 mg/L 莪術(shù)醇的培養(yǎng)液孵育細胞24 h）、TGF-β+高劑量莪術(shù)醇組（用含5 μg/L TGF-β 和30 mg/L 莪術(shù)醇的培養(yǎng)液孵育細胞24 h）、TGF-β+高劑量莪術(shù)醇+anti-miR-NC 組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 的細胞用含5 μg/L TGF-β 和30 mg/L 莪術(shù)醇的培養(yǎng)液孵育24 h）和TGFβ+高劑量莪術(shù)醇+anti-miR-214組（轉(zhuǎn)染anti-miR-214的細胞用含5 μg/L TGF-β 和30 mg/L 莪術(shù)醇的培養(yǎng)液孵育24 h）。細胞轉(zhuǎn)染嚴格遵照Lipfectamine 2000說明書進行。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力 將各組RL-95細胞接種于96 孔板，貼壁后每孔添加CCK-8 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀在450 nm處測量吸光度（A）值。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 收集各組細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌后，75%乙醇固定，用50 mg/L碘化丙啶溶液（含RNase）孵育細胞30 min，然后用流式細胞儀分析G0/G1、S和G2/M期細胞比例。

2.5 RT-qPCR 檢測miR-214 的表達 使用Trizol 試劑從各組細胞中提取總RNA，用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA，用miRNA 檢測試劑盒進行實時熒光定量PCR。miR-214 相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。miR-214 的上游引物序列為5'-TATACATCAAACAGCAGGCACA-3'，下游引物序列為5'-CATTCGATCTTCTCCACAGTCTC-3'；內(nèi)參照U6的上游引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATAC?TAAAAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTTCAC?GAATTTGCGTGTCAT-3'。

2.6 Western blot 法檢測纖維化相關(guān)蛋白的表達細胞收獲后用冷凍RIPA 裂解緩沖液裂解，試劑盒檢測蛋白濃度。取30 μg 蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，然后4℃下孵育Ⅰ抗（抗α-SMA 抗體、抗Col I 抗體和抗GAPDH 抗體）過夜，隨后室溫下進一步孵育Ⅱ抗2 h。滴加增強型化學(xué)發(fā)光檢測試劑暗室顯色曝光，Quantity One 軟件分析目的蛋白相對表達水平（目的蛋白帶灰度與GAPDH 蛋白帶灰度的比值）。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗獨立重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用獨立樣本t檢驗比較兩組間差異；采用單因素方差分析比較多組間差異，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 莪術(shù)醇對TGF-β 誘導(dǎo)的RL-95 細胞活力和細胞周期的影響

與control 組比較，TGF-β 組G0/G1期細胞比例顯著降低，細胞活力和S 期細胞比例顯著升高（P＜0.05）；與TGF-β組比較，TGF-β+莪術(shù)醇（15 mg/L）組和TGF-β+莪術(shù)醇（30 mg/L）組G0/G1期細胞比例顯著升高，細胞活力和S 期細胞比例顯著降低（P＜0.05）；TGF-β+莪術(shù)醇（7.5 mg/L）、TGF-β+莪術(shù)醇（15 mg/L）和TGF-β+莪術(shù)醇（30 mg/L）三組間G0/G1期細胞比例、S期細胞比例和細胞活力的差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 莪術(shù)醇對TGF-β誘導(dǎo)RL-95細胞活力和細胞周期的影響Table 1. The effects of curcumol on the viability and cell cycle of RL-95 cells induced by TGF-β（Mean±SD. n=3）

2 莪術(shù)醇對TGF-β 誘導(dǎo)的RL-95 細胞中纖維化相關(guān)蛋白及miR-214表達的影響

與control 組比較，TGF-β 組RL-95 細胞miR-214表達顯著降低，而α-SMA 和Col I 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與TGF-β 組比較，TGF-β+莪術(shù)醇（15 mg/L）組和TGF-β+莪術(shù)醇（30 mg/L）組RL-95 細胞miR-214 表達顯著升高，α-SMA 和Col I 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；TGF-β+莪術(shù)醇（7.5 mg/L）和TGF-β+莪術(shù)醇（15 mg/L）和TGF-β+莪術(shù)醇（30 mg/L）三組間miR-214 表達及α-SMA 和Col I 蛋白表達的差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1。

3 敲減miR-214 表達可逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇對TGF-β 誘導(dǎo)的RL-95細胞活力和細胞周期分布的影響

與TGF-β+莪術(shù)醇（30 mg/L）+anti-miR-NC 組比較，TGF-β+莪術(shù)醇（30 mg/L）+anti-miR-214 組RL-95細胞miR-214 表達量和G0/G1期細胞比例顯著降低，細胞活力和S 期細胞比例顯著升高（P＜0.05），見表3。

4 敲減miR-214 表達可逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇對TGF-β 誘導(dǎo)RL-95纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

與TGF-β+莪術(shù)醇（30 mg/L）+anti-miR-NC 組比較，TGF-β+莪術(shù)醇（30 mg/L）+anti-miR-214 組RL-95細胞α-SMA 和Col I 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖2。

表2 莪術(shù)醇對TGF-β誘導(dǎo)的RL-95細胞中纖維化相關(guān)蛋白及miR-214表達的影響Table 2. Effect of curcumol on TGF-β-induced expression of fibrosis-related proteins and miR-214 in RL-95 cells（Mean±SD. n=3）

Figure 1. The effect of curcumol on TGF-β-induced fibrosis-related protein expression in RL-95 cells.圖1 莪術(shù)醇對TGF-β誘導(dǎo)的RL-95細胞中纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

表3 敲減miR-214表達可逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇對TGF-β誘導(dǎo)的RL-95細胞活力和細胞周期分布的影響Table 3. Knock-down of miR-214 expression reversed the effect of curcumol on the viability and cell cycle distribution of RL-95 cells induced by TGF-β（Mean±SD. n=3）

Figure 2. Knock-down of miR-214 reversed the effect of curcumol on TGF-β-induced fibrosis-related protein expression in RL-95 cells. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs TGF-β+curcumol（30 mg/L）+anti-miR-NC group.圖2 敲減miR-214可逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇對TGF-β誘導(dǎo)的RL-95細胞纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

討 論

子宮內(nèi)膜異位癥雖為良性疾病，但其生長特性與惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為類似，因此具有抗腫瘤作用的中藥單體可能對子宮內(nèi)膜異位癥具有防治作用。莪術(shù)醇是莪術(shù)揮發(fā)油的主要單體成分，通過促凋亡、抗增殖和免疫增強等機制而具有廣泛的抗腫瘤作用。研究顯示，莪術(shù)醇可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞活性氧產(chǎn)生，阻斷蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/糖原 合酶 激 酶3β（glycogen synthase ki?nase 3β，GSK3β）/細胞周期素D1（cyclin D1）途徑誘導(dǎo)G0/G1周期阻滯［9］。莪術(shù)醇通過調(diào)節(jié)E-鈣黏著蛋白和N-鈣黏著蛋白表達減弱而誘導(dǎo)TGF-β1 介導(dǎo)的鼻咽癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［10］。莪術(shù)醇還顯著降低子宮腺肌癥異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的增殖和遷移能力，誘導(dǎo)細胞凋亡［11］。此外，莪術(shù)醇還誘導(dǎo)肝星狀細胞凋亡，抑制血管生成，逆轉(zhuǎn)早期和晚期肝纖維化［12-13］。然而，莪術(shù)醇在子宮內(nèi)膜異位癥纖維化中的作用并不清楚。本研究以TGF-β 誘導(dǎo)RL-95 細胞模擬子宮內(nèi)膜異位癥纖維化，發(fā)現(xiàn)細胞活力、S 期細胞比例以及纖維化標志蛋白α-SMA 和Col I 表達顯著增加，G0/G1細胞比例顯著升高，而莪術(shù)醇以劑量依賴方式降低細胞活力和S 期細胞比例，升高G0/G1期細胞比例，抑制α-SMA 和Col I 蛋白表達。與本研究類似，Sun 等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇可抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的人肺成纖維細胞增殖，降低α-SMA 表達水平，降低細胞中的Col I 沉積。以上研究表明，莪術(shù)醇可抑制TGF-β 誘導(dǎo)的RL-95 細胞生長及纖維化蛋白表達，具有潛在的對抗子宮內(nèi)膜異位癥纖維化作用。

miRNA 通過調(diào)控細胞生長、遷移、凋亡和耐藥，在人類健康和疾病中發(fā)揮重要作用［15-16］。還有研究報道，莪術(shù)醇可通過誘導(dǎo)miR-152-3p 表達而抑制惡性黑色素瘤B16 細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［17］。miR-214 是一種纖維化相關(guān)miRNA，在缺氧誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷模型中miR-214 表達降低，過表達miR-214 可抑制細胞凋亡和纖維化，改善急性腎損傷［18］。miR-214 是心臟成纖維細胞增殖、活化以及心臟纖維化的重要調(diào)節(jié)劑［19］。沉默長鏈非編碼RNA KCNQ1 重疊轉(zhuǎn)錄物1（KCNQ1 overlap?ping transcript 1，KCNQ1OT1）可通過上調(diào)miR-214減輕糖尿病心肌病的纖維化和焦磷酸化，改善C57BL/6 小鼠心臟功能［20］。此外，miR-214 可靶向結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF/CCN2），從而對子宮內(nèi)膜異位癥纖維化具有抑制作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇干預(yù)后miR-214表達以劑量依賴方式增加，提示莪術(shù)醇的抗子宮內(nèi)膜異位癥纖維化作用可能與miR-214 水平升高有關(guān)。進一步的敲減實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-214 抑制劑下調(diào)miR-214 表達可降低高劑量莪術(shù)醇對TGF-β1 誘導(dǎo)的RL-95 細胞活力、細胞周期分布以及α-SMA 和Col I 蛋白表達的影響。以上結(jié)果表明，莪術(shù)醇至少部分通過上調(diào)miR-214 表達而抑制TGF-β誘導(dǎo)的RL-95 細胞生長和纖維化。然而，miR-214下游靶基因眾多，探索其下游靶基因是下一步研究的重點。

綜上所述，本研究證實莪術(shù)醇可通過上調(diào)miR-214 抑制TGF-β 誘導(dǎo)的RL-95 細胞生長和纖維化相關(guān)蛋白表達，進而對子宮內(nèi)膜異位癥纖維化具有潛在的治療作用。