固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中11種禁限獸藥及代謝物

劉柏林, 謝繼安, 趙紫微, 王秀莉, 單曉梅

(安徽省疾病預(yù)防控制中心,安徽 合肥,230601)

氯霉素類、硝基咪唑類、林可酰胺類與大環(huán)內(nèi)酯類為常見(jiàn)的抗生素藥物,廣泛用于養(yǎng)殖過(guò)程中多種疾病的預(yù)防和細(xì)菌性感染類的治療。超量或超種類使用這些藥物后,會(huì)殘留于動(dòng)物性食品中,并通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)蓄積,危害人類健康[1],我國(guó)農(nóng)業(yè)部第250號(hào)公告規(guī)定食品動(dòng)物中禁止使用氯霉素、洛硝達(dá)唑等藥物,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019規(guī)定了食品動(dòng)物中甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺、林可霉素、紅霉素等藥物的最高殘留限量(MRLs)。但食品中檢出林可霉素、氯霉素、甲硝唑、紅霉素及代謝物等藥物殘留事件有報(bào)道[1-4]。獸藥殘留是目前食品安全所面臨的重大問(wèn)題之一。

針對(duì)食品中多種獸藥殘留的檢測(cè),目前報(bào)道的方法有液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(LC-QTOF/MS)[5,6]和液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法(LC-HRMS)[7-9]等,這些方法能夠提供待測(cè)物母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù),降低了近似質(zhì)量數(shù)的干擾,更好地避免了假陽(yáng)性的發(fā)生,是食品中多種獸藥殘留快速定性篩查的首選方法。不足的是,這些快速定性篩查方法的定量效果欠佳[10],且儀器設(shè)備昂貴。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)因分析效率高、靈敏度高等優(yōu)勢(shì),成為抗生素殘留分析的主流檢測(cè)方法[11]。盡管采用UPLC-MS/MS測(cè)定禽蛋、水產(chǎn)品、蜂蜜、牛奶及奶粉等食品中多種獸藥殘留有較多文獻(xiàn)報(bào)道[4,12-19],但樣品前處理方法各不相同,以QuEChERS法、OasisPRiME HLB固相萃取柱凈化等方法居多,這兩種前處理方法具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)勢(shì),能解決同一樣品中多種獸藥凈化處理。但吸附劑在吸附極性與非極性雜質(zhì)的同時(shí)也會(huì)吸附待測(cè)物,導(dǎo)致部分待測(cè)物回收率低,影響定量的準(zhǔn)確性。而且現(xiàn)已報(bào)道的檢測(cè)方法中,多是檢測(cè)藥物原型,涉及代謝物的檢測(cè)方法不多。而文獻(xiàn)[3]報(bào)道紅霉素在酸性條件下不穩(wěn)定,易降解成紅霉素A烯醇醚和脫水紅霉素A,這些降解產(chǎn)物被認(rèn)為是使人體產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)的主要原因[20],所以同時(shí)檢測(cè)紅霉素及其代謝物具有重要意義。另外,國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)常規(guī)項(xiàng)目包含林可霉素、紅霉素、甲硝唑、氯霉素類及代謝物等獸藥殘留,按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法及國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)方法[21],分為4次樣品前處理及上機(jī)測(cè)定,耗費(fèi)大量時(shí)間、人力、物力與財(cái)力。因此,迫切需要建立動(dòng)物源性食品中這4類獸藥殘留及代謝物的同時(shí)檢測(cè)方法。

針對(duì)上述存在的問(wèn)題,本文以雞蛋、液態(tài)奶、雞肉及淡水魚樣品為基質(zhì),優(yōu)化提取凈化條件,考察基質(zhì)效應(yīng)的影響,結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法,有效降低了基質(zhì)效應(yīng),建立了SPE-UPLC-MS/MS同時(shí)定量測(cè)定氯霉素類、硝基咪唑類、林可霉素、紅霉素共4類8種禁限獸藥與3種代謝物的殘留,實(shí)現(xiàn)了雞蛋、液態(tài)奶、雞肉及淡水魚中多類獸藥殘留及代謝物的同時(shí)測(cè)定,解決了常規(guī)監(jiān)測(cè)采用4種前處理及儀器分析方法的難題,為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)及隱患排查提供高效、便捷、準(zhǔn)確可靠的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTMUPLC超高壓液相色譜儀、ZEVO TQ MS質(zhì)譜儀、AcquityTMUPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國(guó)Waters公司);VORTEX Multi Reax高速旋渦混勻器(德國(guó)Heidolph公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);Legend Mach 1.6R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

氯霉素、甲砜霉素,純度均大于97%,購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、林可霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺、氯霉素-D5、氟苯尼考-D3、甲砜霉素-D3、林可霉素-D3、地美硝唑-D3、洛硝達(dá)唑-D3純度均大于95%,購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;脫氧紅霉素A、紅霉素A烯醇醚、紅霉素A、紅霉素A-D6、甲硝唑-D4、氟苯尼考胺-D3純度均大于95%,購(gòu)自加拿大TRC公司;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯(色譜純,德國(guó)Merck公司);乙酸銨(色譜純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司);無(wú)水磷酸氫二鈉(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18填料(均為50 μm,美國(guó)Agilent公司);Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL,美國(guó)Waters公司)。

1.2 溶液的配制

分別稱取11種標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)適量,用甲醇溶解,并定容至刻度,配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,避光保存于-20 ℃冰箱。

用適量10%甲醇水溶液稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,混勻,分別配制成100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液與混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

準(zhǔn)確移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液10、50、100、200、500、1 000與5 000 μL,移至10 mL容量瓶中,加入500 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液,用10%甲醇水溶液定容至刻度,配制成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0與50.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

樣品采集于本省不同地區(qū)的超市與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),雞肉與魚類樣品取肌肉部位,經(jīng)高速組織搗碎機(jī)均勻絞碎,用四分法縮分出適量,雞蛋樣品去殼混合均勻。所有樣品均分成2份,一份用于檢測(cè),另一份用于復(fù)檢,加封作標(biāo)記,于-20 ℃保存。

稱取2.00 g(精確至0.01 g)試樣,置于50 mL聚丙烯具塞離心管中,加入50 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液(100 ng/mL)后,靜置30 min,先加入5 mL pH 9.0磷酸鹽緩沖溶液,渦旋振蕩5 min后,再加入5 mL乙腈,混勻后,以10 000 r/min冷凍離心10 min,取上清液于另一個(gè)離心管中,加入10 mL乙酸乙酯,渦旋30 s,靜置分層后,以10 000 r/min冷凍離心10 min,取上層液體于15 mL聚丙烯離心管中,于40 ℃以下水浴中氮?dú)獯抵两?殘留物用0.3 mL甲醇溶解后,加入5.7 mL磷酸鹽緩沖液,混勻,待凈化。

Oasis HLB固相萃取預(yù)先依次用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL pH 9.0的磷酸鹽緩沖溶液淋洗活化,將上述待凈化液轉(zhuǎn)移至活化后的Oasis HLB固相萃取柱上,棄去流出液,加入5 mL純水淋洗后抽干,隨后用6 mL甲醇分2次洗脫,控制流速1～2 mL/min。洗脫液于40 ℃以下水浴氮?dú)獯蹈?用1.0 mL 10%甲醇水(先加入100 μL甲醇溶解殘?jiān)?再加入900 μL超純水)溶液定容,混勻,以10 000 r/min冷凍離心5 min,取上清液,上機(jī)測(cè)定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:10 ℃;流速:0.4 mL/min;流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B:甲醇。梯度洗脫程序:0～3.0 min,90%A～60%A;3.0～3.5 min,60%A～15%A;3.5～4.0 min,15%A～10%A;4.0～4.5 min,10%A～90%A;4.5～6.0 min,90%A。進(jìn)樣量:10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;毛細(xì)管電壓:2.50 kV(負(fù)離子)和4.0 kV(正離子);離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:1 000 L/h;碰撞氣流量:0.13 mL/min;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。待測(cè)物的母離子、子離子及對(duì)應(yīng)的碰撞能量、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 11種待測(cè)物及9種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 11 analytes and 9 isotope internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 定容溶劑的選擇

用10%～50%(v/v)乙腈水溶液、10%～50%(v/v)甲醇水溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,考察溶劑對(duì)待測(cè)物響應(yīng)值與色譜峰形的影響。結(jié)果表明,隨著甲醇或乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加,氟苯尼考胺響應(yīng)和峰形逐漸變差,出現(xiàn)峰伸舌與拖尾現(xiàn)象,當(dāng)體積分?jǐn)?shù)超過(guò)40%時(shí),所有待測(cè)物均有響應(yīng)不穩(wěn)定且峰形展寬的現(xiàn)象?？紤]當(dāng)甲醇或乙腈體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí),各待測(cè)物的響應(yīng)高,色譜峰形尖銳、對(duì)稱。以10%甲醇為溶劑時(shí),紅霉素A烯醇醚與脫氧紅霉素A達(dá)到基線分離,且11種待測(cè)物的響應(yīng)值及峰形也較用10%乙腈水溶液時(shí)好。因此最終選擇10%(v/v)甲醇水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)及樣品的定容溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。分別選擇甲醇與乙腈為有機(jī)相,同時(shí)在水相中分別加入甲酸、氨水和乙酸銨,考察待測(cè)物的分離效果、色譜峰形、峰高及響應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以純水或純水中加入乙酸銨為水相時(shí),有機(jī)相無(wú)論是乙腈還是甲醇,林可霉素的峰形均較差,響應(yīng)較低,需要在水相中加入酸、堿調(diào)節(jié)pH值來(lái)改善峰形。以乙腈作為有機(jī)相、水相中加入氨水時(shí),紅霉素A、紅霉素A烯醇醚與脫氧紅霉素A的峰形較差,有伸舌與拖尾現(xiàn)象,且響應(yīng)低,同時(shí)發(fā)現(xiàn),氨水-乙腈作為流動(dòng)相雖能夠增加負(fù)離子模式掃描模式下氯霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度,但是也容易使氟苯尼考的內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生同位素峰效應(yīng),使內(nèi)標(biāo)的平均回收率增強(qiáng)4.5倍,當(dāng)采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí),往往會(huì)造成高濃度的實(shí)際樣品結(jié)果偏低。而以甲醇作為有機(jī)相,并在水相中加入氨水時(shí),除脫水紅霉素峰形較用乙腈時(shí)有所改善外,紅霉素A與紅霉素A烯醇醚的峰形依然存在伸舌與拖尾現(xiàn)象,且林可霉素、氯霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考與甲硝唑等藥物的峰形較用乙腈時(shí)差,影響準(zhǔn)確定量。雖有文獻(xiàn)[4]報(bào)道,堿性流動(dòng)相條件下甲硝唑和林可霉素的響應(yīng)值分別是酸性流動(dòng)相條件下的7.5和5.4倍,但考慮同時(shí)分析紅霉素A及其代謝物,水相中加入氨水不適合。因此,選擇水相中加入甲酸,對(duì)于在負(fù)離子模式下掃描的氯霉素、氟甲砜霉素、氟苯尼考等物質(zhì)來(lái)說(shuō),甲酸提供的H+抑制了這些化合物的解離,影響離子化效率,但能夠促進(jìn)[M+H]+峰形成的同時(shí)抑制目標(biāo)化合物[M+Na]+峰的形成[18],對(duì)于正離子模式來(lái)說(shuō),能夠提高離子化效率,提高靈敏度,故選擇0.1%甲酸水溶液作為水相。以甲醇為有機(jī)相時(shí),各待測(cè)物的峰形均較乙腈時(shí)好,響應(yīng)也更高,且紅霉素A烯醇醚與脫氧紅霉素A完全能夠達(dá)到基線分離。因此最終確定0.1%甲酸水溶液與甲醇作為流動(dòng)相。優(yōu)化后的11種禁限獸藥物及代謝物的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖 1 11種禁限獸藥及代謝物的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current (TIC)chromatograms of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites 1.florfenicol amine;2.metronidazole;3.ronidazole;4.dimetridazole;5.thiamphenicol;6.lincomycin;7.florfenicol;8.chloramphenicol;9.erythromycin A;10.erythromycin A enol ether;11.anhydro erythromycin A.

圖 2 磷酸鹽緩沖液的pH值對(duì)11種禁限獸藥及代謝物提取效率的影響Fig.2 Effect of different phosphate buffer pH values on the extraction efficiencies of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1提取液及pH值的優(yōu)化

以陰性的雞蛋樣品為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,加入11種禁限獸藥及代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其在樣品中含量為10.0 ng,經(jīng)4%氯化鈉水溶液分散、加入乙腈沉淀蛋白質(zhì)后,用乙酸乙酯提取,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),紅霉素A及代謝物和林可霉素的提取效率低,加標(biāo)回收率小于4%,待測(cè)物的化學(xué)性質(zhì)不同,不同的提取液影響了提取效果。

據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道,紅霉素A在酸性條件下不穩(wěn)定,在中性及弱堿性條件下穩(wěn)定,故選擇pH 7.0的磷酸鹽緩沖液作為最佳提取液提取蜂蜜中紅霉素A及代謝物。張曉藝等[4]發(fā)現(xiàn)在pH 10.0的碳酸鹽緩沖液作為提取液的條件下,采用乙酸乙酯同時(shí)萃取蜂蜜中的氯霉素、甲硝唑和林可霉素，萃取效果較好。陳興連等[17]研究認(rèn)為堿性溶液作為提取液時(shí),不僅能很好的分散樣品,增加與有機(jī)溶劑接觸面積,充分提取藥物,同時(shí)堿溶液還能促進(jìn)藥物與結(jié)合蛋白質(zhì)解離,有利于提高提取效率。綜合上述學(xué)者的報(bào)道,本文選擇pH 6.0～11.0的磷酸鹽緩沖液作為萃取條件,考察不同pH值下,乙酸乙酯對(duì)11種待測(cè)物提取的效率,結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明,提取液的pH值對(duì)林可霉素提取效率的影響較明顯,隨著提取液pH值的增加,林可霉素的回收率逐漸增加,pH為9.0時(shí)回收率最高,當(dāng)pH大于9.0時(shí),林可霉素與地美硝唑的回收率降低。氯霉素類及代謝物、甲硝唑與洛硝達(dá)唑的提取效率受pH值影響不大,平均回收率為64.4%,紅霉素及代謝物在pH為8.0～11.0的響應(yīng)值最高,且比較穩(wěn)定。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 mol/L pH 9.0的磷酸氫二鈉溶液作為提取液。

圖 3 不同凈化方式對(duì)11種禁限獸藥及代謝物回收率的影響(n=3)Fig.3 Effect of different purification methods on the recoveries of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites (n=3)

2.3.2凈化方法的選擇

多獸藥殘留的同時(shí)測(cè)定,樣品前處理多采用QuEChERS法或吸附-洗脫模式的固相萃取法。QuEChERS法是通過(guò)吸附劑與樣品中的雜質(zhì)相互作用,以實(shí)現(xiàn)分析物的提取和凈化,Oasis PRiME HLB固相萃取柱是一款無(wú)須活化的固相萃取柱,通過(guò)柱中的填料吸附劑樣品中的雜質(zhì),以實(shí)現(xiàn)分析物的提取和凈化,Oasis HLB柱、MCS柱與BRP柱為活化-洗脫型的固相萃取柱,MCS為混合型陽(yáng)離子交換柱,BRP是含單分散的親水疏水表面平衡反相吸附劑的萃取柱,填料是經(jīng)過(guò)表面修飾改性的聚合物,引入了極性官能基團(tuán),可以用于分離極性和非極性物質(zhì)。而不同凈化方法的凈化效果取決于待測(cè)物的性質(zhì)與樣品基質(zhì)復(fù)雜程度。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析了不同凈化方法的凈化效果。結(jié)果如圖3所示,采用Oasis PRiME HLB柱凈化,氟苯尼考胺的回收率為21.4%,甲砜霉素、林可霉素及氯霉素的回收率均大于120%;采用QuEChERS法處理樣品時(shí),待測(cè)物的平均回收率為58.1%～129%,林可霉素、紅霉素A烯醇醚的回收率大于120%,而脫氧紅霉素A的回收率為58.1%;采用MCS柱凈化,3種氯霉素類的平均回收率為82.3%～93.3%,但甲硝唑、林可霉素、地美硝唑與氟苯尼考胺的回收率比較低,分別為57.5%、52.3%、43.1%與27.1%,用BRP柱凈化時(shí),林可霉素與地美硝唑的回收率較低,分別為39.7%與37.0%。而采用Oasis HLB柱凈化時(shí),各待測(cè)物的平均回收率為69.9%～97.2%。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇Oasis HLB柱為最佳凈化固相萃取柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指基質(zhì)中的共提取干擾物影響目標(biāo)化合物的離子化[6],從而影響目標(biāo)物響應(yīng)的現(xiàn)象?；|(zhì)效應(yīng)越強(qiáng),方法的準(zhǔn)確性越低[18]。本實(shí)驗(yàn)選擇雞蛋、雞肉、液態(tài)奶與淡水魚陰性樣品為基質(zhì),采用1.3節(jié)描述的方法處理樣品,獲得空白基質(zhì)提取液，分別制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)文獻(xiàn)[22,23]報(bào)道,采用ME=[基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1]×100%來(lái)計(jì)算11種禁限獸藥及代謝物的基質(zhì)效應(yīng),以評(píng)價(jià)不同基質(zhì)中共提取干擾物對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)的影響。

如圖4所示,紅霉素烯醇酯在4種樣品中均存在中等基質(zhì)效應(yīng),|ME|為20%～50%,脫氧紅霉素A在淡水魚、雞蛋與液態(tài)奶樣品中存在中等基質(zhì)效應(yīng),甲砜霉素在液態(tài)奶樣品中為中等基質(zhì)效應(yīng),其他待測(cè)物屬于弱基質(zhì)效應(yīng),|ME|為0～20%。因此,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配的同位素內(nèi)標(biāo)法加以校正。

圖 4 不同基質(zhì)樣品中11種禁限獸藥及代謝物的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolitesindifferent samples

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

以陰性淡水魚為基質(zhì)樣品,按照1.3節(jié)描述提取和凈化,氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶獲得基質(zhì)溶液,用該基質(zhì)溶液配制成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入同位素內(nèi)標(biāo)溶液,使其質(zhì)量濃度為5.0 μg/L,上機(jī)分析,內(nèi)標(biāo)法定量。以待測(cè)物與相對(duì)應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)(y),相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x,μg/L),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,11種待測(cè)物在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)>0.99(見(jiàn)表2)。

2.5.2檢出限及定量限

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417-2017《化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的相關(guān)要求,分別添加不同低濃度的11種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液到陰性樣品中,對(duì)11種待測(cè)物進(jìn)行測(cè)定,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度定義檢出限(LOD)與定量限(LOQ)。結(jié)果表明,該方法的LOD為0.050～0.50 μg/kg,LOQ為0.20～1.5 μg/kg(見(jiàn)表2)。

表2 11種禁限獸藥及代謝物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (R2),LODs,and LOQs for the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites

2.5.3加標(biāo)回收率及精密度

根據(jù)GB/T 27404-2008要求,對(duì)于食品中的禁用物質(zhì),分別添加約1、2、和10倍方法定量限水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液于實(shí)際樣品中,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn);已制定MRL的,應(yīng)該在方法定量限、MRL選一合適點(diǎn),未制定MRL的,在方法定量限、常見(jiàn)限量指標(biāo)選一合適點(diǎn)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019中規(guī)定,雞肉、雞蛋、牛奶與魚肉中紅霉素A的MRL值分別為100、50、40與200 μg/kg;雞肉、雞蛋、牛奶與魚肉中林可霉素的MRL分別為200、50、150與100 μg/kg;雞肉、牛奶與魚肉中甲砜霉素的MRL均為50 μg/kg;雞肉、魚肉中氟苯尼考與氟苯尼考胺之和的MRL分別為100 μg/kg和1 000 μg/kg;我國(guó)農(nóng)業(yè)部第250號(hào)公告規(guī)定食品動(dòng)物中禁止使用氯霉素與洛硝達(dá)唑。根據(jù)上述加標(biāo)規(guī)則,本實(shí)驗(yàn)選用空白本底的雞蛋、魚肉、雞肉和液態(tài)奶為樣品,添加11種待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)水平如表3所示,加入同位素內(nèi)標(biāo)混合液,上機(jī)測(cè)定,每個(gè)添加水平重復(fù)6次。結(jié)果表明,11種待測(cè)物的平均加標(biāo)回收率為65.3%～108%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%～21%。

表3 11種禁限獸藥及代謝物在實(shí)際樣品中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 11 prohibited and restricted veterinary drugs and their metabolites in real samples (n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用該方法對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買的80份雞蛋、80份雞肉、40份液態(tài)奶與32份淡水魚進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)分別采用國(guó)標(biāo)方法GB 29684-2013測(cè)定紅霉素,GB/T 20762-2006測(cè)定林可霉素,GB/T 20744-2006測(cè)定硝基咪唑類,GB/T 20756-2006測(cè)定氯霉素類與SN/T 1865-2016測(cè)定氟苯尼考胺,考察本方法的可靠性。

結(jié)果表明,其中1份雞蛋樣品同時(shí)檢出甲硝唑、氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺,檢出值分別為12.1/12.5 μg/kg(前者為本方法測(cè)定值/后者為標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定值,下同)、7.52/7.06 μg/kg與12.3/12.4 μg/kg;1份雞蛋中檢出氟苯尼考,檢出值為3.23/3.03 μg/kg;1份雞蛋與1份雞肉中分別檢出甲硝唑,檢出值為0.125/0.100 μg/kg與0.144/0.129 μg/kg。將該分析方法與標(biāo)準(zhǔn)方法所獲取的陽(yáng)性樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果顯示,兩套分析方法無(wú)顯著性差異(t=0.283,P=0.788)。可見(jiàn)本方法準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中11種禁限獸藥及代謝物的方法,結(jié)合同位素稀釋技術(shù),有效降低了實(shí)際樣品的基質(zhì)效應(yīng)。該方法穩(wěn)定性好,準(zhǔn)確度高,適用于食品中多種痕量獸藥殘留及代謝物的同時(shí)檢測(cè)。與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比,本方法能夠?qū)崿F(xiàn)不同類別的獸藥殘留及代謝物同時(shí)前處理與分析,縮短了檢測(cè)周期,節(jié)約了檢測(cè)成本,為例行監(jiān)測(cè)提供支持。