蒺藜皂苷通過調(diào)控lncRNA AGAP2-AS1／miR-646 表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

劉經(jīng)州，楊紅群，宋春俠

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000；2.承德市婦幼保健院，河北承德 067000）

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，傳統(tǒng)的手術(shù)、化療等方法治療結(jié)腸癌存在一定的局限性，而中醫(yī)藥治療結(jié)腸癌有其獨(dú)特優(yōu)勢［1］。因此，研發(fā)新的中醫(yī)藥對(duì)治療結(jié)腸癌及提高其療效具有重要意義。蒺藜Tribulus terrestris L.是蒺藜科植物蒺藜屬植物，傳統(tǒng)中藥之一，蒺藜皂苷是從蒺藜中提取出的主要活性成分之一，其具有抗癌、治療心血管疾病的作用［2］。研究報(bào)道蒺藜皂苷能通過影響細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖［3］。蒺藜總螺甾皂苷能抑制人卵巢透明細(xì)胞癌荷瘤裸鼠腫瘤作用［4］。蒺藜的皂苷提取物可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞導(dǎo)凋亡［5］。但蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌增殖、凋亡的影響及其機(jī)制還尚不清楚。研究報(bào)道lncRNA AGAP2-AS1 在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖［6］。沉默AGAP2-AS1 可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和侵襲，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡［7］。miR-646 在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)，高表達(dá)miR-646 可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌增殖、凋亡的影響及其機(jī)制是否與lncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116（上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，批號(hào)C00135507）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Sigma 公司，貨號(hào)EY-4648）；蒺藜皂苷（純度≥98%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)E-3190）；四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）試劑盒（德國IBL公司，貨號(hào)JKSJ—1812）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素／碘化丙錠（Annexin V-Fluorescein isothiocyanate／propidium iodide，Annexin V-FITC／PI）凋亡檢測試劑盒（日本同仁研究所，貨號(hào)AD10-2）；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，貨號(hào)YPA101-01）；一步法熒光定量PCR 試劑盒（美國GENMED 公司，貨號(hào)GMS12113）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)KFS303-ZPR）。

1.2 細(xì)胞處理與分組 結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116 用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞HCT116，分別用20、40、80 mg／L 的蒺藜皂苷處理作為蒺藜皂苷低、中、高劑量組，不做任何處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。

取生長狀態(tài)良好且密度達(dá)到80% 左右的HCT116 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將10 μg 的AGAP2-AS1 過表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒（pcDNA）、AGAP2-AS1 過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-AGAP2-AS1）、AGAP2-AS1 抑制表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒（si-NC）、AGAP2-AS1 抑制表達(dá)質(zhì)粒（si-AGAP2-AS1）、miR-646 模擬物對(duì)照質(zhì)粒（miR-NC）、miR-646 模擬物（miR-646）分別加入100 μL 不含血清的培養(yǎng)液；將50 μg 脂質(zhì)體也用不含血清的培養(yǎng)液稀釋至100 μL；將上述2 種溶液輕輕混合在一起，室溫靜置10 min，將上述混合物小心加入到培養(yǎng)皿中，分散均勻，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別記為pcDNA 組、pcDNA-AGAP2-AS1 組、si-NC 組、si-AGAP2-AS1組、miR-NC 組、miR-646 組。

將pcDNA、pcDNA-AGAP2-AS1 按上述方法轉(zhuǎn)染至細(xì)胞HCT116 中再用80 mg／L 的蒺藜皂苷處理，記為蒺藜皂苷+pcDNA 組、蒺藜皂苷+pcDNAAGAP2-AS1 組。

1.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖抑制率 各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h 時(shí)，每孔分別加入20 μL 的MTT 溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h 后棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩反應(yīng)10 min 使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm 處檢測吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率＝1-OD 值實(shí)驗(yàn)組／OD值空白對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS 漂洗2 次，與500 μL 的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μL Annexin V-FITC，再加入5 μL PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 Western blot 法檢測蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后提取總蛋白，定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入一抗（1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育90 min，TBST 洗滌，用ECL 發(fā)光液顯影，成像后用Quantity One 軟件檢測蛋白條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)＝目的條帶灰度值／GAPDH 條帶灰度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.6 RT-qPCR 檢測lncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 的表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95 ℃3 min，95 ℃20 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。lncRNA AGAP2-AS1 和 miR-646 分別以GAPDH和U6 為內(nèi)參，lncRNA AGAP2-AS1 正向引物序列5′-TACCTTGACCTTGCTGCTCTC-3′，反向引物 序 列5′-TGTCCCTTAATGACCCCATCC-3′；GAPDH 正向引物序列5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物序列 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-646 正向引物序列5′-ACACTCCAGCTGGGAAGCAGCTGCCTC-3′，反向引物序列5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGG CCTCAGA-3′；U6 正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測lncRNA AGAP2-AS1對(duì)miR-646 的靶向調(diào)控 構(gòu)建含miR-646 結(jié)合位點(diǎn)的野生型和突變型基因靶點(diǎn)lncRNA AGAP2-AS1 的熒光素酶表達(dá)載體 WT-AGAP2-AS1 和 MUTAGAP2-AS1，將其分別與miR-NC 和miR-646 共轉(zhuǎn)染至HCT116 細(xì)胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，2 組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對(duì)照組比較，蒺藜皂苷低、中、高劑量組HCT116 細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及p21、Bax表達(dá)升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），并呈濃度依賴性，見圖1、表1。

圖1 蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells

表1 蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

表1 蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.1 Effects of T.terrestris saponins on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與蒺藜皂苷低劑量組比較，＃P＜0.05；與蒺藜皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。

2.2 蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AGAP2-AS1 和miR-646 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，蒺藜皂苷低、中、高劑量組HCT116 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AGAP2-AS1 表達(dá)降低（P ＜0.05），miR-646 表達(dá)升高，并呈濃度依賴性（P ＜0.05），見表2。

表2 蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AGAP2-AS1、miR-646 表達(dá)的影響（，n＝9）Tab.2 Effects of T.terrestris saponins on lncRNA AGAP2-AS1 and miR-646 expression in colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

表2 蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AGAP2-AS1、miR-646 表達(dá)的影響（，n＝9）Tab.2 Effects of T.terrestris saponins on lncRNA AGAP2-AS1 and miR-646 expression in colon cancer HCT116 cells（，n＝9）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與蒺藜皂苷低劑量組比較，＃P＜0.05；與蒺藜皂苷中劑量組比較，△P＜0.05。

2.3 lncRNA AGAP2-AS1 靶向調(diào)控miR-646 表達(dá) LncBase Predicted v.2 預(yù)測顯示，AGAP2-AS1與miR-646 存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與miR-NC 組比較，miR-646 組中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-AGAP2-AS1 的細(xì)胞熒光素酶活性降低（P ＜0.05），而轉(zhuǎn)染MUT-AGAP2-AS1 的細(xì)胞熒光素酶活性無顯著差異，見表3。與pcDNA 組比較，pcDNA-AGAP2-AS1 組miR-646 表達(dá)降低（P ＜0.05）；與si-NC 組比較，si-AGAP2-AS1 組miR-646 表達(dá)升高（P＜0.05），見表4。

圖2 AGAP2-AS1 的序列中含有與miR-646 互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.2 AGAP2-AS1 sequence containing a nucleotide sequence complementary to miR-646

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果（，n＝9）Tab.3 Results of double luciferase reporter assays（，n＝9）

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果（，n＝9）Tab.3 Results of double luciferase reporter assays（，n＝9）

注：與miR-NC 組比較，?P＜0.05。

表4 lncRNA AGAP2-AS1 調(diào)控miR-646 表達(dá)（，n＝9）Tab.4 Expression of miR-646 regulated by lncRNA AGAP2-AS1（，n＝9）

表4 lncRNA AGAP2-AS1 調(diào)控miR-646 表達(dá)（，n＝9）Tab.4 Expression of miR-646 regulated by lncRNA AGAP2-AS1（，n＝9）

注：與pcDNA 組比較，?P＜0.05；與si-NC 組比較，＃P＜0.05。

2.4 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC 組比較，si-AGAP2-AS1 組HCT116 細(xì)胞AGAP2-AS1 表達(dá)及CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及p21、Bax 表達(dá)升高（P＜0.05），見圖3、表5。

表5 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.5 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表5 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.5 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：與si-NC 組比較，?P＜0.05。

2.5 miR-646 過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC 組比較，miR-646 組HCT116 細(xì)胞中miR-646 表達(dá)、細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及p21、Bax 表達(dá)升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖4、表6。

圖3 抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effects of lncRNA AGAP2-AS1 expression inhibition on the proliferation and apoptosis of colon cancer HCT116 cells

圖4 miR-646 過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis

表6 miR-646 過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.6 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表6 miR-646 過表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（，n＝9）Tab.6 Effects of miR-646 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：與miR-NC 組比較，?P＜0.05。

2.6 lncRNA AGAP2-AS1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的作用 與蒺藜皂苷+pcDNA 組比較，蒺藜皂苷+pcDNA-AGAP2-AS1 組 HCT116 細(xì)胞中 AGAP2-AS1 表達(dá)及CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（P ＜0.05），miR-646 表達(dá)、細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及p21、Bax 表達(dá)降低（P＜0.05），見圖5、表7。

表7 lncRNA AGAP2-AS1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的作用（，n＝9）Tab.7 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

表7 lncRNA AGAP2-AS1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的作用（，n＝9）Tab.7 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis（，n＝9）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與蒺藜皂苷+pcDNA 組比較，＃P＜0.05。

3 討論

圖5 lncRNA AGAP2-AS1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Counteractive effect of T.terrestris saponins to lncRNA AGAP2-AS1 overexpression on colon cancer HCT116 cell proliferation and apoptosis

細(xì)胞增殖和凋亡失衡是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，而中藥天然活性成分逐漸成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物開發(fā)的新趨勢［9］。蒺藜皂苷是中藥蒺藜的主要活性成分之一，研究表明蒺藜皂苷提取物可影響乳腺癌細(xì)胞的凋亡和轉(zhuǎn)移［10］。蒺藜皂苷D 在體外和體內(nèi)可抑制人前列腺癌的生長和血管生成［11］。為研究蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌增殖、凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的蒺藜皂苷處理結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、B 細(xì)胞淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／leukemia-2，Bcl-2）蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor1A，p21）、Bcl-2 相關(guān)X（Bcl-2 associated X，Bax）表達(dá)升高，并呈濃度依賴性。表明蒺藜皂苷可劑量依賴的抑制結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道m(xù)iR-646 在胃癌組織中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［12］。過表達(dá)miR-646 可抑制肺癌A549 細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力［13］。以上研究結(jié)果表明miR-646 在多種腫瘤中可能起抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)過表達(dá)miR-646 后可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道lncRNA ZFAS1 可通過下調(diào)miR-646 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長，遷移和侵襲［14］。

研究報(bào)道AGAP2-AS1 可促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡［15］。AGAP2-AS1 上調(diào)還可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移［16］。沉默AGAP2-AS1 抑制食道癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制lncRNA AGAP2-AS1 表達(dá)，細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞凋亡率升高，CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，p21、Bax 表達(dá)升高。表明抑制lncRNA AGAP2-AS1表達(dá)可抑制結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，AGAP2-AS1 靶向調(diào)控miR-646。蒺藜皂苷處理后結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞中AGAP2-AS1 表達(dá)降低，miR-646 表達(dá)升高；且lncRNA AGAP2-AS1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了蒺藜皂苷對(duì)結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖和凋亡的作用。表明蒺藜皂苷可能通過下調(diào)抑制結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，蒺藜皂苷可通過調(diào)控lncRNA AGAP2-AS1／miR-646 表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。