一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定辛夷配方顆粒中4 種成分

智雪枝，張 博，田 蘭，劉惠軍，陳 睿

（上海市松江食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201600）

辛夷是木蘭科植物望春花Magnolia biondii Pamp.、玉蘭Magnolia denudate Desr.或武當(dāng)玉蘭Magnolia sprengeri Pamp.的干燥花蕾，具有散風(fēng)寒、通鼻竅之功效，用于風(fēng)寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵［1］，其主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、木脂素、生物堿［2-4］，其中木脂素具有抗炎免疫、降壓、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗菌、抗病毒、抗衰老、殺蟲(chóng)、抗真菌等作用［5-7］。由于單一有效成分或指標(biāo)成分的定量分析模式已不能滿足中藥現(xiàn)代化對(duì)于質(zhì)量控制的要求，故曹緯國(guó)等［8］建立HPLC 法測(cè)定辛夷中辛夷脂素、木蘭脂素的含量，趙鑫等［9］采用HPLC-MS法結(jié)合一測(cè)多評(píng)對(duì)辛夷提取物中4 種木脂素含量進(jìn)行測(cè)定，可較好地解決中藥對(duì)照品不易獲得，從而對(duì)多成分含量測(cè)定造成一定局限性的難題。

中藥配方顆粒具有藥性強(qiáng)、藥效好、免煎煮、服用方便等優(yōu)勢(shì)，臨床應(yīng)用廣泛［10］。本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定辛夷配方顆粒中松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素的含量，以期為該制劑質(zhì)量的有效控制及后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；Waters Acquity Arc 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA225D 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 試劑與藥物 松脂素二甲醚（18032722，純度99.0%）、表木蘭脂素A（18120328，純度98.14%）對(duì)照品均購(gòu)于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；木蘭脂素（110882-201607，純度98.4%）、辛夷脂素（111561-200201，純度100%）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。辛夷配方顆粒（廠家 A，批號(hào) 1612001W、1701001W、1807001W；廠家B，批號(hào)18 091131；廠家C，批號(hào)7 120412；廠家D，批號(hào)A1802324）。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（含0.1%磷酸，B），梯度洗脫（0～20 min，10%～70% A；20～30 min，70%～90%A；30～32 min，90%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm（辛夷脂素）、278 nm（松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A）；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素對(duì)照品適量，用50%甲醇制備成貯備液（四者質(zhì)量濃度分別為0.506 880、0.588 432、0.487 756、0.053 950 mg／mL），用于線性關(guān)系考察。另分別精密稱取4 種對(duì)照品7.48、10.08、10.06、10.79 mg，置于20、20、20、200 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，各吸取1.0 mL 至25 mL 量瓶中，50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，用于加樣回收率試驗(yàn)。

2.2.2 線性溶液 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液適量，50%甲醇依次稀釋至200、100、50、20、10、20／3、5 倍，即得，編號(hào)1～7。

2.2.3 供試品溶液 取顆粒適量，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置于25 mL 量瓶中，加50% 甲醇約20 mL，超聲處理30 min，放冷，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按處方比例制備缺辛夷的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，色譜圖基線平穩(wěn)，各成分色譜峰與其他雜質(zhì)峰均能得到有效分離，分離度大于1.5，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下線性溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下線性溶液1、4、7，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素峰面積RSD 分別為0.3%、0.4%、0.7%、0.8%（線性溶液1），0.3%、0.3%、0.5%、0.6%（線性溶液4），0.2%、0.2%、0.5%、0.3%（線性溶液7），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批顆粒6 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素含量RSD 分別為1.2%、1.1%、1.3%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素含量RSD 分別為0.3%、0.4%、0.6%、0.5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的顆粒0.5 g，置于25 mL 量瓶中，平行9 份，每3份為1 組，按50%、100%、150%水平精密加入對(duì)照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 相對(duì)校正因子測(cè)定 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下線性溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以木蘭脂素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他3 種成分的相對(duì)校正因子fk／s，公式為fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

表3 各成分相對(duì)校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.10 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)比較了Waters Acquity Arc、Agilent 1260 色譜儀，以及Kromasil（4.6 mm× 250 mm，5 μm）、Merck RP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表4，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜3%）。

表4 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.11 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1260 色譜儀、Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱考察柱溫25、30、35、40、45、50 ℃對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表5，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜3%）。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.12 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響 本實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1260 色譜儀、Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱考察體積流量0.7、0.8、0.9 mL／min 對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表6，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜3%）。

表6 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.6 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.13 色譜峰定位 以木蘭脂素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算在“2.10”項(xiàng)儀器、色譜柱下其他3 種成分的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表7，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜3%）。

表7 各成分相對(duì)保留時(shí)間Tab.7 Relative retention time of various constituents

2.14 樣品含有量測(cè)定 取6 批顆粒，每批3 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表8。由此可知，2 種方法所得結(jié)果接近，相對(duì)平均偏差（RAD）＜2.25%。

表8 各成分含量測(cè)定結(jié)果（μg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents（μg／g）

3 討論

3.1 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水［8-9］、乙腈-水［11］、甲醇-水（含0.1% 甲酸）［12］、甲醇-水（0.1%磷酸）、乙腈-水（0.1%磷酸），發(fā)現(xiàn)加入酸后各成分峰形明顯改善。從各成分與相鄰峰的分離情況及其峰形、出峰時(shí)間等方面綜合分析，最終選擇乙腈-水（0.1% 磷酸）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 本實(shí)驗(yàn)在200～400 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收光譜掃描，發(fā)現(xiàn)松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A 在278 nm 處有較大吸收，而辛夷脂素在232 nm 處有較大吸收。由于辛夷脂素含量較低，并且在此波長(zhǎng)處無(wú)干擾，故選擇232、278 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取條件篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取方法（超聲、索氏）、提取時(shí)間（30、45、60 min）、提取溶劑（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇、50%乙醇、75%乙醇）對(duì)各成分提取率的影響，發(fā)現(xiàn)2 種提取方法影響不大，而且在提取過(guò)程中對(duì)加熱均較穩(wěn)定；超聲30 min 與超聲45、60 min 的效果相當(dāng)；50%甲醇、50%乙醇提取效果最佳，其次是75%甲醇、75%乙醇、甲醇、乙醇，但50%乙醇提取出的色譜峰數(shù)量較少，不能真實(shí)反映辛夷配方顆粒成分。最終，選擇50%甲醇超聲提取30 min 作為提取條件。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定辛夷配方顆粒中松脂素二甲醚、木蘭脂素、表木蘭脂素A、辛夷脂素的含量，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果與外標(biāo)法無(wú)明顯差異，而且該方法在對(duì)照品缺少的情況下可實(shí)現(xiàn)該成分定量測(cè)定，從而對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。