癲癇伴發(fā)抑郁大鼠杏仁核突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)

曹真真， 閆桂柳， 朱含笑， 李漾超， 李 云

癲癇(epilepsy)是一種大腦神經(jīng)元突發(fā)異常放電，發(fā)作具有重復(fù)性、發(fā)作性、短暫性、刻板性特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。抑郁(depression) 是以情緒低落為主要表現(xiàn)的社會(huì)功能障礙性疾病。癲癇伴發(fā)抑郁(epilepsy-associated depression,EAD)是癲癇患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。Fiest等發(fā)現(xiàn)癲癇患者中，抑郁患病率高達(dá)23.1%，而終身抑郁癥患病率達(dá)4.1%～32.5%[1]。近年來(lái)，EAD的發(fā)病率仍在持續(xù)升高，抑郁對(duì)于患者的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于癲癇本身，不僅影響患者的生存質(zhì)量，而且加重家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至導(dǎo)致患者自殺?，F(xiàn)已有研究認(rèn)為，癲癇與抑郁發(fā)病機(jī)制存在潛在共同點(diǎn)，但具體機(jī)制并不明確。

近年來(lái)研究突觸可塑性及其相關(guān)蛋白與神經(jīng)精神障礙性疾病的相關(guān)性的報(bào)道越來(lái)越多，多種突觸相關(guān)蛋白能夠協(xié)同維持突觸的功能及調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而影響神經(jīng)精神疾病的發(fā)病[2]。神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(Growth-associated protein-43，GAP-43)是一種神經(jīng)組織上的特異性磷蛋白。突觸素(Synaptophysin，SYN)是作為突觸發(fā)生和突觸重塑的重要標(biāo)記的一種鈣結(jié)合糖蛋白[3]。突觸后致密蛋白(Postsynaptic density95，PSD95)是突觸后致密物質(zhì)的主要蛋白質(zhì)成分之一，也是包含高濃度谷氨酸受體、信號(hào)蛋白、細(xì)胞骨架元素的一種有機(jī)結(jié)構(gòu)[4]。既往有研究發(fā)現(xiàn)，突觸相關(guān)蛋白GAP-43、SYN、PSD95在癲癇發(fā)病過(guò)程中表達(dá)水平明顯下降，這提示GAP-43、SYN、PSD95在癲癇的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrphic factor,BDNF)及其受體TrKB在癲癇伴抑郁發(fā)病中具有重要作用，已知BDNF可促進(jìn)損傷神經(jīng)元的再生，并參與突觸重塑和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的功能，在癲癇伴抑郁的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[5,6]。但突觸相關(guān)蛋白對(duì)于癲癇伴抑郁的影響相關(guān)文獻(xiàn)仍較少?；谏鲜鍪聦?shí)，本課題擬進(jìn)一步探討EAD大鼠杏仁核突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，以闡述突觸相關(guān)蛋白與EAD發(fā)病的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 選用健康清潔級(jí)成年SD大鼠，體質(zhì)量(250±50)g，由大理大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物質(zhì)量合格證: SYXK(滇) 2018.0002]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)動(dòng)物的處置符合大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)關(guān)于使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中使用的免疫組織化學(xué)染色試劑包括試劑一(3%內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶阻斷劑)、試劑二(反應(yīng)增強(qiáng)劑)、試劑三(增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，一抗為(GAP-43、SYN、PSD95)和羊血清，其中一抗與磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)按1∶100配制，GAP-43、SYN、PSD9購(gòu)自Millipore公司，PV900試劑盒(北京中杉)，羊血清購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠模型及分組 本實(shí)驗(yàn)于 2019年1月-2020 年12月在大理大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心完成。采用Open-field法進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，篩選評(píng)分大致相似的大鼠，隨機(jī)將成年SD大鼠分為4組，正常組、抑郁組、共病組、癲癇組。正常組:大鼠正常條件飼養(yǎng);抑郁組:采用慢性不可預(yù)見(jiàn)的中等應(yīng)激刺激動(dòng)物(chronic unpredictable mild stress,CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法建立大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型[7];癲癇組和共病組:參考文獻(xiàn)[8]建立成熟的氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型，建模過(guò)程為:予大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)，20 h～24 h后腹腔注射匹羅卡品(10 mg/kg)，30 min后未達(dá)到癲癇發(fā)作的大鼠，再次給予匹羅卡品(10 ml /kg)，至極量為60 mg/kg，直至大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上的癲癇大發(fā)作。大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上的發(fā)作并持續(xù) 60 min 定為模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)給予腹腔注射地西泮(4 mg/kg)控制發(fā)作，以防止大鼠抽搐過(guò)度致死。癲癇模型造模后14 d，對(duì)大鼠進(jìn)行篩選，將符合抑郁指標(biāo)的大鼠作為共病組，每籠1只飼養(yǎng)。造模成功后，各組大鼠常規(guī)腹腔注射青霉素預(yù)防感染。實(shí)驗(yàn)大鼠均成功造模和存活。

1.2.2 大鼠造模成功的標(biāo)準(zhǔn) 癲癇模型建立后，采用Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)級(jí)癲癇行為:0 級(jí):無(wú)任何反應(yīng);Ⅰ級(jí): 面部抽搐，包括眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼等;Ⅱ級(jí):Ⅰ級(jí)行為表現(xiàn)加節(jié)律性點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí):Ⅱ級(jí)行為表現(xiàn)加前肢肌陣攣，但無(wú)后肢直立位;Ⅳ級(jí):Ⅲ級(jí)行為表現(xiàn)加后肢直立位;Ⅴ級(jí): 全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，并失去肢體控制。大鼠出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上的發(fā)作時(shí)間大于60 min，并持續(xù)發(fā)作，毛發(fā)失去光澤，體質(zhì)量減輕，活動(dòng)減少，蜷縮少動(dòng)，快感缺失，自發(fā)活動(dòng)和探究性活動(dòng)減少則可認(rèn)為EAD造模成功。動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)：(1)體重的測(cè)量：監(jiān)測(cè)癲癇大鼠在癲癇發(fā)作后第1天、第8天、第15天、第29天及各對(duì)照組大鼠同一時(shí)間點(diǎn)體重變化情況;(2)蔗糖水試驗(yàn)： 癲癇大鼠在造模后第1天、第8天、第15天、第29天及各對(duì)照組大鼠，每隔1 w進(jìn)行禁水24 h，測(cè)定禁水24 h后的第1小時(shí)內(nèi)動(dòng)物飲用1%蔗糖溶液的量(蔗糖溶液的飲用量反映了大鼠對(duì)獎(jiǎng)賞的快感反應(yīng))；(3)曠野試驗(yàn)：擬用敞箱長(zhǎng)寬均為 100 cm、高為 50 cm，內(nèi)空的立柱體，壁周為黑色，地面用黑線劃分為面積相等的25塊。以動(dòng)物穿越地面方塊數(shù)(四爪跨入)作為水平活動(dòng)得分(反映大鼠的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)性水平)，以直立次數(shù)(兩前肢離地1 cm以上)為垂直活動(dòng)得分(反映大鼠興趣減少程度)。行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示: 應(yīng)激后各組大鼠不同時(shí)間比較體質(zhì)量減輕、蔗糖溶液消耗量減少、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)距離及垂直運(yùn)動(dòng)距離縮短(P<0.05)；在CUMS 后第29天與1 d、8 d、15 d比較，抑郁組、共病組大鼠以上各指標(biāo)降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1)，則進(jìn)一步說(shuō)明EAD模型建立成功。

1.2.3 組織制備 各組大鼠分別于造模成功后第29天取材，采用活體灌注固定取腦法取腦組織。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)杏仁核突觸相關(guān)蛋白(SYN、PSD95、GAP43)，抗體濃度為1%:用3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔麻醉大鼠，首先用生理鹽水從左心室開(kāi)始灌洗，然后灌注4%多聚甲醛，斷頭取腦，并于冠狀面上切取大鼠大腦杏仁核0.5 cm，用冰凍石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚約8 μm。免疫組化二步法進(jìn)行檢測(cè)，最后采用光學(xué)顯微鏡拍照，在每只動(dòng)物杏仁核區(qū)選擇高倍視野(HPF，400×)，計(jì)數(shù)突觸相關(guān)蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 將上述切片自然干燥，放入60 ℃烤箱烤2.5 h后，自然降溫，再次放入65 ℃烤箱烤30 min，經(jīng)二甲苯脫臘、梯度乙醇水化、高壓修復(fù)后冷卻，使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)漂洗，使用內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶阻斷劑阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，再次使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)漂洗，使用羊血清封閉非特異性的抗原抗體反應(yīng)1 h后，加入一抗-4 ℃過(guò)夜，次日磷酸鹽緩沖(Phosphate buffer solution,PBS)充分漂洗后滴加反應(yīng)增強(qiáng)劑室溫孵育30 min，再次磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)充分漂洗后加入適量新鮮配置的DAB顯色，自來(lái)水沖洗后，使用蘇木素染色液復(fù)染，梯度酒精脫水后，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。每只大鼠選不連續(xù)的5張切片，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍片。每張切片400×拍照5個(gè)視野，雙盲計(jì)數(shù)杏仁核免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠杏仁核突觸相關(guān)蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫陽(yáng)性細(xì)胞定位表達(dá)情況 光學(xué)顯微鏡顯示，各組大鼠大腦杏仁核均有突觸相關(guān)蛋白GAP43、SYN、PSD95的表達(dá)，3種因子免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，定位在神經(jīng)元胞質(zhì)及突起根部。

2.2 各組大鼠杏仁核突觸相關(guān)蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)比 單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)果顯示，與各對(duì)照組相比，共病組GAP-43及PSD95免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少，正常對(duì)照組最多(P<0.05)；其余各組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。共病組和抑郁組與癲癇組及正常組相比，SYN免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均減少(P<0.05)；癲癇組較抑郁組增多，較正常組減少(P<0.05)(見(jiàn)表1、圖2)。

表1 各組大鼠大腦杏仁核GAP-43、SYN、PSD95免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

與正常組同時(shí)間比較▲P<0.05；與癲癇組同時(shí)間比較▽P<0.05

各組大鼠杏仁核陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)變化：A:正常組GAP43陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；B:抑郁組GAP43陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；C:癲癇組GAP43陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；D:共病組GAP43陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；E:正常組PSD95陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；F:抑郁組PSD95陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；G:癲癇組PSD95陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；H:共病組PSD95陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；I:正常組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；J:抑郁組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；K:癲癇組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；L:共病組SYN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)

3 討 論

杏仁核位于大腦邊緣系統(tǒng)，是參與情緒調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)，在識(shí)別、評(píng)估情緒刺激以及針對(duì)刺激產(chǎn)生的特定情緒中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9,10]。Richardson等[11]研究發(fā)現(xiàn)杏仁核體積的改變?cè)贓AD的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。本團(tuán)隊(duì)前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EAD模型大鼠杏仁核中有大量神經(jīng)元凋亡的現(xiàn)象[5]，由此可見(jiàn)杏仁核與EDA的發(fā)生密切相關(guān)。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，EAD的發(fā)生機(jī)制可能與神經(jīng)突觸可塑性的改變相關(guān)。GAP-43是存在于神經(jīng)細(xì)胞膜上的一種特異性磷酸蛋白，主要分布于大小腦、脊髓、背根節(jié)以及自主神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元內(nèi),并且只存在于已分化成型且開(kāi)始突觸生長(zhǎng)的神經(jīng)元中[12]。GAP-43對(duì)于突觸功能的維持、軸突生長(zhǎng)及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起著關(guān)鍵作用[13]，同時(shí)也是神經(jīng)元生長(zhǎng)和發(fā)育的內(nèi)在決定因子之一[14]。SYN是一種特異性鈣結(jié)合酸性蛋白[15]。主要表達(dá)于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)所有神經(jīng)末梢，同時(shí)在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞也可見(jiàn)部分表達(dá)[16]。最近研究表明，SYN不僅調(diào)節(jié)成熟神經(jīng)末梢的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，同時(shí)調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢的形成和生長(zhǎng)，SYN在囊泡融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放中起著關(guān)鍵作用[17]。張明磊等[3]研究中提到SYN通過(guò)酪氨酸激酶使突觸素磷酸化調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而影響突觸可塑性。PSD是一層均質(zhì)的存在于突觸后膜內(nèi)側(cè)胞質(zhì)面的物質(zhì)，對(duì)于突觸可塑性至關(guān)重要，而PSD95是興奮性突觸后致密物質(zhì)(PSD)中的含量豐富的重要蛋白之一。PSD95被認(rèn)為是興奮性突觸的突觸后特異性標(biāo)記物，同時(shí)能夠促進(jìn)谷氨酸受體的傳遞和參與抑郁癥的發(fā)病[18]。目前杏仁核中突觸相關(guān)蛋白GAP-43、SYN、PSD95是否在EAD中發(fā)揮重要作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

GAP-43、SYN、PSD95與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)。Lang等[19]提到，抑郁癥的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說(shuō)認(rèn)為情緒和記憶相關(guān)的腦區(qū)神經(jīng)可塑性降低、神經(jīng)元萎縮和神經(jīng)發(fā)生異常能夠影響抑郁狀態(tài)的發(fā)生。同時(shí)大量證據(jù)表明，抑郁癥可以導(dǎo)致突觸的形式和功能發(fā)生了區(qū)域特異性變化，突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變[20]。綜上所述，GAP-43、SYN、PSD95均可影響突觸可塑性，從而影響抑郁癥的發(fā)病。LUO等人[21]的研究發(fā)現(xiàn)，慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激大鼠表現(xiàn)出抑郁行為與杏仁核PSD-95及SYN表達(dá)顯著減少相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與正常組對(duì)比，抑郁組及共病組杏仁核GAP-43、PSD95及SYN免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)均低于正常組，共病組與抑郁組SYN比較免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增加，而共病組與抑郁組GAP-43、PSD95比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在抑郁大鼠中杏仁核GAP-43、PSD95及SYN表達(dá)降低，則杏仁核GAP-43、SYN、PSD95降低可能提示EAD的發(fā)病。

在劉杰等[22]的研究中的實(shí)驗(yàn)造模成功后采用RT-PCR 檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)15 d 時(shí)發(fā)作組GAP-43 mRNA的表達(dá)明顯高于其他對(duì)照組，但癲癇狀態(tài)逐漸穩(wěn)定后，隨著苔蘚纖維出芽、突觸重塑停止，至30 d時(shí)GAP-43 mRNA的表達(dá)明顯下降。這表明GAP-43的表達(dá)下降與大鼠癲癇發(fā)作相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道[15]，SYN與神經(jīng)纖維出芽和突觸重塑的關(guān)系密切，從而參與癲癇的發(fā)病。張杰等[23]實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型中PSD95表達(dá)下調(diào)，提示PSD95在癲癇的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。綜上所述，突觸相關(guān)蛋白GAP-43、SYN、PSD95在癲癇的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，并影響其發(fā)病。本研究結(jié)果顯示，與正常組對(duì)比，癲癇組與共病組杏仁核GAP-43、PSD95及SYN免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)均減少，共病組與癲癇組對(duì)比SYN免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)升高，而共病組與癲癇組比較GAP-43、PSD95比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癲癇大鼠杏仁核中GAP-43、SYN、PSD95表達(dá)的降低提示可能與EAD的發(fā)病相關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探討突觸可塑性在EAD發(fā)病機(jī)制及闡明杏仁核在PSD發(fā)病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)研究需進(jìn)一步探討EAD大鼠杏仁核突觸相關(guān)蛋白GAP-43、SYN、PSD95蛋白的定量表達(dá)及模型大鼠行為學(xué)改變情況信號(hào)通路的表達(dá)情況。