昆蟲共生微生物及其功能研究進展

王渭霞,朱廷恒,賴鳳香,*

(1.中國水稻研究所,杭州 310006;2.浙江工業(yè)大學生物工程學院微生物研究所,杭州 310014)

人類基因組計劃的完成確定了人類約有2.5萬個基因。隨著人類微生物組計劃的實施，終于讓我們認識到原來人類將440萬的基因“外包”給了寄生在人體的微生物組。不難想象昆蟲作為數(shù)量最多、分布最廣的一類動物，也有大量共生的微生物，這些微生物可通過營養(yǎng)共生、調(diào)節(jié)宿主生理和發(fā)育、保護宿主免受病原體和有害物質(zhì)的侵害或參與互作交流等途徑，在昆蟲的進化和物種多樣性的形成中發(fā)揮不可替代的作用(Douglas,2015)?？梢哉f是共生微生物的多樣性驅動了宿主昆蟲表型更加豐富和多樣化，昆蟲的表型變異是宿主基因組、共生微生物基因組、宿主基因型與共生微生物基因型互作的共同結果(Feldhaar,2011;McFall-Ngaietal.,2013)。昆蟲與微生物的共生關系是自然界最典型的生物共生體系(holobiont)之一，二者形成共生體單位共進化(Thao and Baumann,2004)。

昆蟲共生微生物主要包括胞內(nèi)共生菌和胞外共生菌(楊義婷等,2014)。胞內(nèi)共生菌通常分布在特殊的含菌細胞(bacteriocytes)內(nèi)，采用垂直傳播方式(從母代傳給子代)，與宿主的協(xié)同進化明顯，是宿主生存不可或缺的；胞外共生菌指生活在昆蟲細胞外的微生物，主要以附著于腸壁細胞和游離在腸腔的腸道菌群(gut microbiota)為主；依據(jù)共生微生物與宿主的關聯(lián)程度又可分為互相依賴共存的原生內(nèi)共生菌(primary endosymbiont)或專性內(nèi)共生菌(obligate endosymbiont)和缺失不會影響宿主生存的次生內(nèi)共生菌(secondary endosymbiont)或兼性內(nèi)共生菌(facultative endosymbiont)。次生共生菌感染昆蟲的時間相對較晚，可分布在細胞內(nèi)(如含菌細菌、脂肪體細胞內(nèi))也可分布在細胞外(如腸道內(nèi)壁、血淋巴中)，既可垂直傳播也可水平傳播，與宿主協(xié)同進化的程度較低，不為宿主生存所必需(Douglas,2015)。

1 昆蟲共生微生物的多樣性及研究手段

1.1 昆蟲共生微生物多樣性

昆蟲體內(nèi)共生微生物的總量能夠占到昆蟲生物量的1%～10%，比如成年黑腹果蠅Drosophiamelanogaster和沙漠蝗Schistocercagregaria僅腸道內(nèi)就約有105～106個細菌。但是，受限于昆蟲體型較小和壽命較短等原因，對其共生微生物的研究還相對有限。果蠅中可檢測到的微生物種類不超過30種(Chandleretal.,2011)。通過基因組測序的方法發(fā)現(xiàn)，植食性昆蟲中蝕食枯木或腐朽木的昆蟲體內(nèi)微生物多樣性最高，每個個體約130個操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。OTU是假定的分類單元，將測定序列相似性大于98%的序列定義為一個OTU，用以反映樣品中微生物的多樣性。而大多數(shù)草食性昆蟲的共生微生物約30～40 OTU/個體，其中以吸食花粉為生的蜜蜂的共生微生物則不超過6 OTU/個體(Colmanetal.,2012)。梵步甲Harpaluspensylvanicus和斑步甲Anisodactylussanctaecrucis的共生微生物分別有6個和3個OTU(Lundgrenetal.,2007)，而在煙粉虱Bemisiatabaci中這一數(shù)據(jù)可高達3 513個(Harishetal.,2019)。我們在褐飛虱Nilapavatalugens中的研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)微生物至少有18個OTU(Wangetal.,2015)。

昆蟲共生微生物除了細菌以外還包括真菌、酵母菌、原生生物、古菌和病毒等(White and Lichtwardt,2004;Gurungetal.,2019)。其中細菌主要分布在變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)以及衣原體門(Chlamydiae)(Colmanetal.,2012;楊義婷等,2014)。如在草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda和褐飛虱中變形菌門和厚壁菌門是最主要的兩類共生微生物，而擬桿菌門和放線菌門(Acfinobacteria)的比例較低(Zhangetal.,2019a;Gichuhietal.,2020)。真菌主要分布在子囊菌門(Ascomycota)，另外有擔子菌門(Basidiomycetes)和接合菌門(Zygomycetes)。由于宿主昆蟲的體內(nèi)環(huán)境的特殊性，共生真菌通常為單細胞酵母形態(tài)，故通常使用“類酵母共生菌(yeast-like symbiont,YLS)”來描述這些分類學上不屬于酵母亞門的共生真菌。目前已在8個目大約143種昆蟲物種的不同組織中發(fā)現(xiàn)YLS(Vega and Dowd,2005)。另外在中華角蝗Acridacinerea腸道內(nèi)也分離到18株分屬于子囊菌門和擔子菌門6個科8個屬的共生真菌(陳君芝等,2014)。通常來說，共生真菌都存在于消化腸道，少部分存在于細胞的間隙和細胞內(nèi)部，如實蠅科幼蟲腸的外突囊、天牛幼蟲中腸內(nèi)的含菌體以及含菌細胞。

昆蟲體內(nèi)的病毒并不總是扮演病原物的角色，它們與宿主也可以是共生或共棲關系。關于共生病毒的報道雖然不多，卻包含了雙鏈DNA(dsDNA)病毒、單鏈DNA(ssDNA)病毒、ss(+) RNA病毒和ss(-) RNA病毒等多種類型。以褐飛虱為例，除了可傳播的水稻病毒以外，還發(fā)現(xiàn)了幾種RNA病毒：呼腸孤病毒(Nilaparvatalugensreovirus,NLRV)、Himetobi P病毒(Hemetobi P virus,HiPV)、共生X病毒(Nilaparvatalugenscommensal X virus,NLCXV)(Nakashimaetal.,2006)和蜜露病毒(Nilaparvatalugenshoneydew virus,NLHV) NLHV-1,NLHV-2和NLHV-3(Murakamietal.,2013,2014)。目前對昆蟲體內(nèi)的共生病毒功能研究相對較少。

1.2 昆蟲共生微生物研究手段

為解析共生微生物對宿主昆蟲的功能，主要采用的方法有：(1)可培養(yǎng)共生微生物的功能直接檢測和回補驗證；(2)借用抗生素處理消除共生微生物后宿主表型的分析。包括用除菌后宿主昆蟲或其唾腺分泌物、產(chǎn)卵液、蜜露等處理相應寄主植物，測定寄主防御反應等；(3)對共生微生物群落基因組測序，通過生物信息學分析共生微生物群組的多樣性和功能。傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)技術是了解昆蟲共生微生物種類及多樣性、生理功能、生態(tài)作用和對宿主影響的必要手段。但是，自然界中99%的微生物不能培養(yǎng)(Amannetal.,1995)。分子生物學技術如宏基因組測序可以避開微生物分離培養(yǎng)的過程，能夠準確、快速、高通量地解讀微生物群體的多樣性與豐度，給昆蟲共生微生物的研究帶來了新的方法和思路，極大地提高了發(fā)現(xiàn)新共生微生物的能力和功能解析的力度，在測定昆蟲微生物的群落結構、研究昆蟲與菌群間的互作關系、發(fā)掘新的以及具有特定功能的微生物方面呈現(xiàn)巨大的優(yōu)勢，例如發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生抗生素或候選毒素等具有防御功能的微生物。為從微觀角度研究共生菌與宿主昆蟲營養(yǎng)功能互補、宿主種群形成擴散、協(xié)同進化等共生機制帶來了新機遇(Shietal.,2010)。依賴于現(xiàn)代分子生物學技術的分析雖然可以通過基因組信息預測更多潛在共生菌的可能功能，但在活體中是否有活性并發(fā)揮作用則尚待進一步證明。

2 昆蟲共生微生物的功能與機制研究

昆蟲體內(nèi)共生的微生物作為宿主生物學性狀的重要調(diào)節(jié)因子可參與宿主營養(yǎng)代謝、促進生長發(fā)育、增強繁殖力、影響種群演替等諸多生物學過程。近年來發(fā)現(xiàn)共生微生物在宿主抵御病原體感染、寄生蟲寄生和捕食等逆境脅迫以及調(diào)控寄主植物免疫反應中也具有重要作用。

2.1 提供宿主生長發(fā)育所需物質(zhì)促進生長發(fā)育、拓展生態(tài)位

通常認為，共生微生物可通過擴大宿主消化能力，提供一些必需的營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、脂肪酸、維生素或其他代謝物)，幫助宿主在不均衡營養(yǎng)條件下生存，使得各種昆蟲占據(jù)或支配原本不可能獲得的生態(tài)位，這些功能在刺吸式害蟲胞內(nèi)原生共生菌與宿主協(xié)同進化中顯得非常重要(Baumann,2005;Guenduez and Douglas,2009;Skidmore and Hansen,2017)。這些共生菌基因組大幅度縮減，核苷酸組成發(fā)生偏倚，高編碼密度和缺乏可移動DNA，基因組保留了大量必需氨基酸合成的基因，而相應的參與非必需氨基酸合成途徑的基因幾乎全部缺失。胞外共生菌包括腸道微生物同樣可通過給宿主提供必需氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)來提高宿主的生存和繁殖能力(Ben-Yosefetal.,2010)。表1列出了可通過給宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)來提高適合度的共生微生物。除此之外，在黑腹果蠅Drosophilamelanogaste和擬果蠅D.simulans中發(fā)現(xiàn)Wolbachia能響應鐵離子濃度的變化，在鐵營養(yǎng)脅迫狀態(tài)下，幫助宿主提高產(chǎn)卵力(Brownlieetal.,2009;Kremeretal.,2009)。植物乳桿菌Lactobacillusplantarum和醋酸桿菌Acetobacterorientalis則分別通過調(diào)節(jié)果蠅的TOR信號通路和胰島素信號通路來促進宿主的生長發(fā)育(Storellietal.,2011;李玉娟,2017)。灰飛虱Laodelphaxstriatellus體內(nèi)的Wolbachia則被證明可通過誘導營養(yǎng)細胞的細胞凋亡來提高雌蟲的產(chǎn)卵量(Guoetal.,2018)。

表1 為宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)的昆蟲共生微生物Table 1 Symbiotic microorganisms in insects that provide nutrients to the host

很多植物材料不僅難以消化、營養(yǎng)不均衡，而且還會包含有植食性昆蟲必須耐受和需要解毒的毒性物質(zhì)或次生代謝物。植食性昆蟲尤其是咀嚼式口器的害蟲其腸道菌可能在消化和解毒這些來源的食物上發(fā)揮了重要作用(Hammer and Bowers,2015)。如危害豆科作物的蝽象Megacoptapunctatissima其體內(nèi)腸道細菌Ishikawaellacapsulata帶有編碼可以使植物次生代謝物草酸脫羧的酶(Nikohetal.,2011)。單食性橄欖果蠅Bactroceraoleae的幼蟲具有以橄欖中果皮為食的獨特能力，能夠代謝未成熟青橄欖中高水平的酚類化合物和非水解蛋白質(zhì)?；蚪M功能解析發(fā)現(xiàn)其共生微生物CandidatusErwinia dacicola的基因組中具有編碼解毒和幫助宿主解除綠橄欖中根皮苷(phlorizin)毒性的消化酶基因，推測共生微生物在幫助宿主取食綠橄欖中具有重要作用(Pavlidietal.,2017)。

在許多植食性昆蟲中，一個物種的不同種群可能會專食不同的植物，從而可能導致生物型或亞種的形成，次生共生菌在昆蟲拓展取食不同植物資源方面具有一定的作用。蚜蟲次生共生菌Regiellainsecticola可影響宿主的寄主范圍并能在種間水平傳播。在三葉草上不能繁殖的野豌豆蚜Megouracrassicauda如果感染了豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的R.insecticola，則會提高其在三葉草上的存活力(Tsuchidaetal.,2011)。以苜蓿Medicagosativa為主食的黑豆蚜Aphiscraccivora如果感染了殺雄菌屬Arsenophonusspp.亞種，就可以提高其在刺槐Robiniapseudoacacia上的存活力(Wagneretal.,2015)。斑點巨蝽Megacoptacribraria在豆類作物上卵孵化率極低，很少以大豆為食物。當將其腸道共生菌與其近緣的豆科作物害蟲蝽象的進行交換后，其在豆科作物上的產(chǎn)卵量激增，而本以大豆為食的蝽象產(chǎn)卵量卻出現(xiàn)大幅度下降(Hosokawaetal.,2007)。玉米根螢葉甲Diabroticavirgifera在不斷地適應玉米與大豆田的輪作中會通過改變腸道微生物來適應在大豆上生存，能夠取食大豆的種群體內(nèi)共生菌克雷伯菌屬Klebsiellasp.和寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonassp.的占比由原來的4%上升至8%?？股氐奶幚頃@著降低玉米根螢葉甲在大豆上的存活率，推測由共生菌提供的半胱氨酸蛋白酶可能是玉米根螢葉甲適應大豆的原因之一(Chuetal.,2013)。煙粉虱因其寄主范圍和入侵性的不同而分為不同的生物型，這些生物型不僅可通過線粒體DNA鑒定，同時也具有生物型特異的共生微生物，表明共生微生物也會影響宿主的地理分布、取食行為和致害能力(Gueguenetal.,2010)。綜上所述，共生微生物不僅可通過合成必需氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)來滿足宿主營養(yǎng)需求，同時也可通過合成植物次生代謝物的代謝酶等拓展其取食范圍和生態(tài)位。

2.2 共生微生物為宿主提供防御保護功能

生物在生長發(fā)育過程中都必將面對各種威脅，害蟲也不例外。害蟲除了自身的防御能力外，也與其共生微生物組隊來保護其免受寄生、捕食、病原微生物感染或殺蟲劑等威脅。共生微生物可通過產(chǎn)生保護性代謝物的方式直接保護宿主抵御各種生物和非生物的脅迫，同時也可通過調(diào)控植物防御反應間接地保護宿主。

2.2.1共生微生物產(chǎn)生保護性代謝物抵御寄生、捕食和病原菌感染等生物脅迫，直接保護宿主：共生微生物可通過產(chǎn)生有直接有害作用的代謝物，抵御病原菌、寄生蜂等的入侵，保護宿主免于被感染、寄生或捕食，這是互惠共生菌參與保護宿主最常用的方式。其中蚜蟲體內(nèi)的次生共生菌Hamiltonelladefensa和R.insecticola基因組中發(fā)現(xiàn)有合成類毒素和致病因子的基因，可通過產(chǎn)生毒素的方式抵御寄生蜂的幼蟲(Degnanetal.,2009;Hansenetal.,2012)。柑橘木虱體內(nèi)的共生菌CandidatusProfftella可以合成結構與隱翅蟲毒素高度一致的毒素diaphorin，保護宿主免受捕食。合成該毒素的基因約占共生菌基因組的15%(Nakabachietal.,2013)。研究還發(fā)現(xiàn)H.defensa不同菌株對豌豆蚜的保護能力有不同，其中R.insecticola5.15可以降低寄生率提高宿主存活率，而菌株R.insecticolaLSR1并沒有表現(xiàn)出保護能力(Hansenetal.,2012)。對寄生蜂的抵御功能H.defensa并不具有廣譜性，抵御豆柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebusfabarum和科列馬阿布拉蚜繭蜂Aphidiuscolemani的寄生的功能更強(Cayetano and Vorburger,2015)。而在棉蚜Aphisgossypii中H.defensa和Arsenophonussp.的減少雖然導致宿主壽命和自然增長率的降低，畸形死亡率的增加，但并不影響寄生率(Ayoubietal.,2020)。由此可見，同一種類的共生菌在不同宿主體內(nèi)的功能不完全一致?；认x體內(nèi)腸道菌群的多樣性和一種病原菌沙雷氏菌Serratiamarcescens的成功定殖呈負相關，腸道菌種類豐富度越高其抵抗病原菌入侵的功能越強(Dillonetal.,2005)。共生微生物在保護宿主抵御生物和非生物脅迫中的功能研究總結詳見表2。

2.2.2提高宿主對殺蟲劑和溫度等非生物脅迫的抵抗能力：在藥理學中，人體腸道微生物組的個體差異被認為是藥物活性或毒性差異的重要來源(Nicholsonetal.,2005)。這種類似的相互作用同樣在植食性昆蟲存在。隨著殺蟲劑的廣泛使用，很多害蟲對不同的殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。這種殺蟲劑抗性有源于害蟲自身的代謝抗性和靶位點突變的靶標抗性，也有源于其體內(nèi)共生微生物的貢獻(段入心等,2019)。害蟲腸道微生物在對殺蟲劑的解毒過程中能夠被誘導合成解毒酶，并通過礦化作用或共代謝過程，將殺蟲劑分解代謝為一種或幾種可被昆蟲吸收利用的代謝物(Kikuchietal.,2012)。研究者通過對比抗藥性種群和敏感種群體內(nèi)微生物豐度，以及分離抗性種群中的微生物并對其基因組進行解析等手段來推測共生微生物在抗藥性中的重要性(Kontsedalovetal.,2008;Chengetal.,2017;Lietal.,2018;Pangetal.,2018;Xiaetal.,2018;Leietal.,2020)。通過對比褐飛虱抗藥性種群與敏感種群的腸道共生菌組成，發(fā)現(xiàn)敏感種群中變形菌門占99.86%，而抗性種群中厚壁菌門占46.06%，擬桿菌門占30.8%，變形菌門占比為15.49%，抗性種群的腸道菌群中富含解毒細菌，如腸球菌屬Enterococcus和伯克氏菌屬Burkholderia細菌，推測這些細菌與褐飛虱抗藥性產(chǎn)生相關(Malathietal.,2018)。利用 “卵塊離體培養(yǎng)法”培養(yǎng)出褐飛虱類酵母共生菌并對其進行抗吡蟲啉解脂酶活性實驗，發(fā)現(xiàn)褐飛虱體內(nèi)解脂假絲酵母Yarrowialipolytica的共生與吡蟲啉的抗藥性有關，抗性菌株的羧酸酯酶、多功能氧化酶活性的增強可能是褐飛虱對吡蟲啉產(chǎn)生抗藥性的代謝基礎(李娜等,2010,2011)。以多種殺蟲劑為唯一碳源的菌株的生長分析發(fā)現(xiàn)，從田間篩選獲得的草地貪夜蛾腸道中分離的微生物表現(xiàn)出對多種殺蟲劑很強的代謝潛力(Gomesetal.,2020)。這些腸道菌與害蟲抗藥性產(chǎn)生的分子機制尚需進一步的研究。

表2 昆蟲共生微生物在保護宿主抵御生物和非生物脅迫中的功能Table 2 Functions of symbiotic microorganisms in insects in protecting host against biotic and abiotic stresses

續(xù)表2 Table 2 continued

昆蟲共生微生物在提高宿主對逆境脅迫的適應性方面的研究主要集中在高溫脅迫。在高溫時期，蚜蟲內(nèi)原生共生菌Buchnera的感染率會下降，此時次生內(nèi)共生菌包括Rickettsia能改善熱脅迫下蚜蟲的適應能力(Montlloretal.,2002)。在高溫脅迫條件下，由于許多蛋白的構象容易出現(xiàn)錯誤并導致功能喪失，熱休克蛋白對蛋白質(zhì)的正確折疊以及錯誤折疊蛋白質(zhì)回收具有重要意義。而高溫脅迫下共生細菌中約占10%的分子伴侶熱休克蛋白Gro EL表現(xiàn)為持續(xù)表達。熱休克蛋白的高表達使得宿主昆蟲中的蛋白錯誤折疊的發(fā)生概率顯著降低，從而降低了在脅迫情況下基因有害突變的發(fā)生所帶來的負面影向，增強了蚜蟲對高溫的耐受力(Faresetal.,2004,2005)。煙粉虱在受到高溫脅迫時，在包含Rickettsia的群體中，細胞骨架基因等與應激反應相關的基因被誘導，從而顯著提高了宿主對40℃高溫的耐受性(Bruminetal.,2011)。共生微生物在宿主抵御低溫脅迫方面報道較少，最近在桔小實蠅中發(fā)現(xiàn)腸道微生物米氏克雷伯菌K.michiganensisBD17可通過調(diào)控宿主脯氨酸和精氨酸的代謝途徑來提高宿主在低溫脅迫下的存活力(Razaetal.,2020)。

2.2.3通過調(diào)控植物防御反應間接地保護宿主：植物為了防御昆蟲的取食和產(chǎn)卵進化出了多種防御機制，包括植物激素信號茉莉酸(jasmonic acid,JA)和水楊酸(salicylic acid,SA)通路在應對害蟲取食時的感知、響應和調(diào)節(jié)免疫防御反應的能力(Erbetal.,2012)。昆蟲在取食植物的過程中面臨著如何突破植物多種防御體系，以達到順利取食的目的。在此過程中，昆蟲體內(nèi)共生微生物就像幕后操作者一樣扮演著舉足輕重的作用，不僅可幫助宿主消化木質(zhì)素、纖維素等難以消化吸收的植物材料，也可通過唾液腺、蜜露等分泌物間接地調(diào)控寄主植物免疫防御反應，從而達到順利取食的目的(Schwartzberg and Tumlinson,2014;Zhuetal.,2014;Douglas,2015)。例如N-?；被崾抢ハx口腔分泌物(返流劑)的主要和廣泛的成分，在昆蟲消化過程中作為生物表面活性劑發(fā)揮作用。在取食過程中可作為激發(fā)子誘導植物防御。Spiteller等(2000)從甜菜夜蛾S.exigua、蕓苔天牛Mamestrabrassicae和黃地老虎Agrotissegetum的腸道中分離到可合成N-?；被岬墓采?。潛葉昆蟲可以在黃色衰老的葉子上由細胞分裂素誘導形成綠島，使昆蟲能夠在環(huán)境惡化的條件下創(chuàng)造一個營養(yǎng)增強的微環(huán)境并生活(Gironetal.,2007)。在斑幕潛葉蛾Phyllonorycterblancardella中發(fā)現(xiàn)Wolbachia可調(diào)控細胞分裂素的水平，以保證宿主的生長發(fā)育、提高宿主適應性。消除共生菌則會導致葉片無綠島形成，昆蟲死亡率上升(Kaiseretal.,2010;Bodyetal.,2013)。至于細胞分裂素的來源，推測是共生細菌直接合成或誘導昆蟲或植物合成。另外也有大量證明宿主共生微生物在調(diào)控植物防御反應的報道(表3)?？梢钥闯鐾凰拗鞯墓采毦诓煌募闹髦参镏袝|發(fā)不同的防御反應，同一宿主的不同共生菌會誘導寄主不同的免疫反應。

2.3 共生微生物對宿主行為和生殖的調(diào)控

共生菌在昆蟲體內(nèi)甚至可以合成氣味分子或影響宿主產(chǎn)生的氣味分子，這些氣味分子會被宿主用來合成信息素或種間激素從而影響昆蟲的交流和行為?；认x群體可能被一組聚集信息素觸發(fā)和維持，引起原本單獨行動的蝗蟲聚集形成一個遷徙群。沙漠蝗腸道共生菌成團泛菌Pantoeaagglomerans能夠利用沙漠蝗消化廢棄產(chǎn)物中的木質(zhì)素衍生物合成聚集信息素的前體愈創(chuàng)木酚，促進蝗蟲集群行動(Dillonetal.,2000)。與之相反，蝗蟲微孢子蟲可以抑制產(chǎn)生聚集信息素的后腸細菌的生長，從而阻止飛蝗的群集行為(Shietal.,2014)。協(xié)調(diào)的運動行為對動物的生存和繁殖至關重要，用抗生素處理去除果蠅體內(nèi)的短乳桿菌Lactobacillusbrevis后會導致果蠅過度活躍的運動行為。給無菌果蠅單一植入該菌后則運動能力恢復正常。原因是短乳桿菌通過表達木糖異構酶來調(diào)節(jié)果蠅的糖代謝降低海藻糖水平，從而降低神經(jīng)遞質(zhì)章魚胺的活性，進而降低果蠅運動能力(Schretteretal.,2018)。在調(diào)節(jié)昆蟲交配選擇中果蠅體內(nèi)的植物乳桿菌可能是誘導交配偏好的關鍵共生菌。用糖蜜和淀粉分別飼養(yǎng)果蠅，結果果蠅優(yōu)先與相同飲食飼養(yǎng)的同類交配。淀粉的飼養(yǎng)會增加植物乳桿菌屬細菌的豐度，給無菌果蠅單一植入該菌后交配偏好恢復。植物乳桿菌具體如何影響與交配行為有關的表皮碳氫化合物類激素發(fā)生改變的機制目前還不清楚(Sharonetal.,2010)。在桔小實蠅Bactroceradorsalis和瓜實蠅Bactroceracucurbitae中發(fā)現(xiàn)帶有共生菌的雌蠅表現(xiàn)出比那些經(jīng)抗生素處理消除細菌的雌蠅對雄性具有更高的吸引能力，其中產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca和弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundii能夠合成大量3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇和異氰酸丁酯等，這些物質(zhì)具有吸引雌蟲的作用(Damodarametal.,2016;Hadapadetal.,2016)。在蚜蟲中，感染H.defensa的蚜蟲比未感染的表現(xiàn)出較低的攻擊性和逃逸反應(Dionetal.,2011)。當蚜蟲被一種昆蟲病原真菌感染時，會在真菌產(chǎn)生孢子之前從寄主植物上落下，研究發(fā)現(xiàn)攜帶Spiroplasma的蚜蟲比未攜帶的蚜蟲從寄主植物上落下的數(shù)量更多，從而降低病原菌對附近蚜蟲的感染風險(ukasiketal.,2013b)。共生微生物對宿主生殖行為的調(diào)控研究較多，它們往往能夠經(jīng)卵實現(xiàn)垂直傳遞，可通過誘導細胞質(zhì)不相容、孤雌生殖或雄性死亡等機制來提高其在雌蟲中的感染比例，如Wolbachia,Cardinium,Arsenophonus,Spiroplasma和Rickettia等(Werrenetal.,2008;Engelstadter and Hurst,2009)。白背飛虱中Wolbachia與Cardinium相互作用誘導胞質(zhì)不相容(Zhangetal.,2012)，但在褐飛虱中Wolbachia并沒有誘導胞質(zhì)不相容的作用(Zhangetal.,2010)。而在果蠅中Wolbachia可能通過調(diào)節(jié)宿主嗅覺相關基因的表達，從而顯著提高果蠅的嗅覺反應能力(彭宇和王玉鳳,2009)。同樣具有生殖調(diào)控功能的Rickettsia，不僅可以使感染的煙粉虱產(chǎn)生雌性的比例更高，同時會使宿主產(chǎn)生更多的后代，成年后存活率更高，發(fā)育更快(Himleretal.,2011)。

表3 昆蟲共生微生物通過調(diào)控植物防御反應間接保護宿主Table 3 Indirect protection of host by symbiotic microorganisms in insects through regulating plant defense response

續(xù)表3 Table 3 continued

關于共生病毒對農(nóng)業(yè)害蟲生長發(fā)育的影響，研究比較少。Ryabov等(2009)在車前圓尾蚜Dysaphisplantaginea中的研究發(fā)現(xiàn)，當蟲口密度大，食物短缺時，其體內(nèi)共生有濃核病毒Dysaphisplantagineadensovirus (DplDNV)的蚜蟲雖然繁殖率下降，但可產(chǎn)生部分有翅蚜，保證了蚜群體的生存和擴散;而沒有共生病毒的蚜蟲群體則不能形成有翅蚜，難以遷飛。Xu等(2014)發(fā)現(xiàn)，攜帶有棉鈴蟲濃核病毒(Helicoverpaarmigeradensovirus-1,HaDNV-1)的棉鈴蟲個體發(fā)育更快，繁殖力強，同時還表現(xiàn)出對Bt毒素的抗性。

2.4 共生微生物對宿主的負面作用

并不是所有的共生微生物都對宿主生存產(chǎn)生積極的保護效應，大部分的昆蟲共生病毒表現(xiàn)為致病、致死等不利于宿主的表現(xiàn)行為。有些共生菌如果蠅體中的Spiroplasmapoulsonii反而會提高果蠅對某些病原細菌的敏感性(Herren and Lemaitre,2011)。在非洲粘蟲Spodopteraexempta中發(fā)現(xiàn)，Wolbachia能提高宿主對核型多角體病毒的敏感性(Grahametal.,2012)。共生微生物對宿主的作用受制于環(huán)境條件，共生微生物的存在對富含蛋白質(zhì)飲食的斑翅果蠅Drosophilasuzukii有害，而對缺乏蛋白質(zhì)飲食的果蠅有利(Bingetal.,2018)。感染H.defensa的黑豆蚜Aphisfabae對寄生蜂有很強的保護作用，但如果沒有這些天敵時，H.defensa的感染會導致宿主壽命縮短，繁殖率下降(Vorburgeretal.,2013)。在煙粉虱、柑橘木虱、小菜蛾和豌豆蚜等害蟲中都發(fā)現(xiàn)被共生菌如Rickettsia,Arsenophonus,Wolbachia和Serratia的感染反而會增加宿主對殺蟲劑的敏感性(Kontsedalovetal.,2008;Ghanim and Kontsedalov,2009;Tiwarietal.,2011;Skaljacetal.,2018;Xiaetal.,2018)。給褐飛虱人工轉染源于白背飛虱的Cardinium會降低其繁殖力和孵化率(Lietal.,2020)。

3 共生體的動態(tài)平衡

昆蟲體內(nèi)的不同共生微生物并不是孤立存在和發(fā)生作用的，而是相互間不同程度地存在協(xié)作依存、取代或抑制現(xiàn)象(黃旭等,2015)。不同成員之間的相互作用可以是通過對資源和空間的競爭直接發(fā)生，也可以是通過誘導宿主免疫反應間接發(fā)生。原生共生菌與次生共生菌之間在生物合成和代謝上往往表現(xiàn)出很強的互補性，共同為宿主提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)。在共存的細菌中，許多共有的基因還會逐漸丟失，導致基因組出現(xiàn)精簡或退化，最終使不同細菌的生物合成途徑處于極少重疊的狀態(tài)，從而形成協(xié)作或依存關系(Baumann,2005)。微生物組成和數(shù)量的微小變化對宿主表型都有重要影響，而宿主所處的環(huán)境變化也會影響到共生微生物之間和共生微生物與宿主之間的互作的關系。一些病原生物在特定條件下也可能與宿主和平共處，甚至帶來某些好處。宿主體內(nèi)共生微生物的動態(tài)變化主要受以下因素影響。

3.1 宿主與生存環(huán)境對共生微生物維持收益的權衡和調(diào)控

昆蟲的地理分布、取食寄主、天敵等環(huán)境條件對其體內(nèi)共生菌的種類、分布、功能等具有一定的調(diào)節(jié)作用。許多內(nèi)共生菌在特定的生態(tài)條件下對宿主帶來有益的影響，但也會產(chǎn)生相關的成本。為了最大限度地提高自身的適應度，宿主必須維持共生體的持久性，同時又要防止共生體對資源的浪費，這就需要根據(jù)特定的條件對共生菌種群進行嚴格的調(diào)控。宿主生理及其腸道內(nèi)環(huán)境，如pH值、氧水平和氧化還原條件也可能是導致微生物群落的變化的主要驅動力(Chenetal.,2020)。如黑豆蚜和豌豆蚜，隨著成蟲的老化，Buchnera和Arsenophonus的豐度降低，而H.defensa的密度隨之增加(Simonetetal.,2016)。推測宿主通過權衡腸道共生物的增益是否能彌補其對宿主所帶來的負擔，或宿主生理環(huán)境的變化等引起共生微生物實時調(diào)整豐度以便最大限度地滿足宿主需求。蚜蟲體內(nèi)的共生菌H.defensa,S.symbiotica,R.insecticola,Rickettsiaspp.,Spiroplasmaspp.和X型腸桿菌(X-type Enterobacteriaceae)等的存在對蚜蟲的生存和繁殖都有一定的負面影響，其在宿主體內(nèi)的維持取決于脅迫條件的存在與否(Oliveretal.,2008;Simonetal.,2011;Heyworth and Ferrari,2015)。當黑豆蚜不受寄生蜂威脅時，維持具有較強防御作用的H.defensa菌株比較弱的菌株成本要低(Cayetanoetal.,2015)。H.defensa可通過增強對寄生蜂的抵抗力和減少成本更高的防御行為來提高蚜蟲適應能力。但由于共生菌的存在降低了蚜蟲的自主防御行為，結果會導致被捕食性天敵二星瓢蟲Adaliabipunctata攻擊風險的增加(Polinetal.,2014)。共生細菌既有可能通過產(chǎn)生芳香族代謝物等物質(zhì)刺激共生真菌生長和繁殖，又有可能起相反的作用，即抑制共生真菌的生長，兩者互作的結果受到具體的細菌和真菌種類、宿主生物學特性、環(huán)境條件和植物中某些化學成分(如蒎烯)等因素的影響(Adamsetal.,2009)。

對于同一種害蟲，也因發(fā)育時期以及互作的作物、外界環(huán)境的不同，其共生微生物種類和功能也不同(Sorokanetal.,2017;Ojha and Zhang,2019;Tianetal.,2019)。如在豌豆蚜中具有抵御寄生功能的H.defensa，在麥蚜Sitobionavenae、馬鈴薯長管蚜Macrosiphumeuphorbiae和棉蚜中并沒有表現(xiàn)出抗寄生功能(ukasiketal.,2013a;Clarkeetal.,2017;Ayoubietal.,2020)。這種不同有可能是由于同一菌種的不同菌株造成，也有可能是寄生蜂的種類不同引起。被公認為具有生殖調(diào)控功能的Wolbichia，因不同宿主、株系以及分布位置，可以不同的方式保護宿主免受寄生、捕食以及其他病原微生物或病毒的侵害(Barretal.,2010;Lietal.,2018;Juetal.,2020;Leietal.,2020)。在實蠅中就曾發(fā)現(xiàn)Wolbachia存在5個不同株系(Jamnongluketal.,2002)。最近Odden等(2020)通過廣泛調(diào)查和有針對性地收集已知感染W(wǎng)olbachia的物種，也發(fā)現(xiàn)存在新的Wolbachia株系。其他共生菌是否同樣存在菌株的差異，同一種共生菌表現(xiàn)出不一的功能是否是由于菌株的不同引起，則有待進一步研究。

3.2 宿主體內(nèi)共生微生物之間的協(xié)同互補

昆蟲體內(nèi)的共生菌及其功能并非一成不變，從新共生菌入侵到穩(wěn)定，共生菌之間的互作關系以及對宿主的影響是不斷變化的。蚜蟲的自然種群中幾乎每個個體都攜帶有Buchnera，次生共生菌的感染率也可高達80%，證明在長期的進化中宿主體內(nèi)的共生微生物之間已經(jīng)達成了某種平衡(Montlloretal.,2002)。當給僅感染有原生共生菌的豌豆蚜注射次生共生菌后，與原生共生菌之間的競爭起初會導致蚜蟲體重下降，子代數(shù)減少。但通過反復不斷地注射或者多代之后，這種負面的影響會逐漸消失。此時如果消除原生共生菌，次生共生菌甚至會占據(jù)原生共生菌的含菌體，替代原生共生菌幫助蚜蟲獲得必要的營養(yǎng)，提高其存活率和繁殖力(Kogaetal.,2003)。在玻璃翅葉蟬中共生菌Baumanniacicadellinicola與Sulciamuelleri之間也存在明顯的代謝互補，其中前者提供維生素和輔因子，而后者提供必需氨基酸(Wuetal.,2006)。豌豆蚜體內(nèi)的次生共生菌H.defensa可以提高蚜蟲對內(nèi)寄生蜂的抗性，這種抗性基因(編碼毒蛋白同源產(chǎn)物)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)位于共生菌所攜帶的溶原性噬菌體上，而缺乏噬菌體的H.defensa只能起到微弱的保護作用，表明蚜蟲-細菌-噬菌體三者之間復雜的互作關系保障了蚜蟲免受寄生危害(Degnan and Moran,2008;Oliveretal.,2009)。植食性昆蟲都能作為植物病毒的媒介，植物病毒與介體昆蟲之間的關系非常復雜，可通過直接或間接的作用促進介體昆蟲的生長、存活和生殖能力(何曉嬋等,2014)。在介體昆蟲細胞內(nèi)，共生菌和病毒友好相處、共享地盤，甚至可充當病毒傳播的幫兇，參與植物病毒的傳播(Bouvaineetal.,2011)。

除了在功能上表現(xiàn)互補外，有些共生微生物在位置上也表現(xiàn)出和平共處。不同共生微生物種類共同存在于宿主的同一組織或細胞(如含菌細胞)中，有的甚至“寄生”在另外一種細菌中，一起垂直傳播。如在煙粉虱、溫室粉虱和豌豆蚜中，次生細菌Hamiltonella分別和Wolbachia,Arsenophonussp.和Rickettsiella一起存在于含菌細胞中(Skaljacetal.,2010;Tsuchidaetal.,2014)。柑橘粉蚧Planococcuscitri中，γ變形菌Moranellaendobia位于一種β變形菌Tremblayaprinceps之內(nèi)(von Dohlenetal.,2001)。在大青葉蟬Cicadellaviridis中，Sodalis-like菌位于另外一種共生細菌Sulciamuelleri之內(nèi)(Michaliketal.,2014)。

4 利用共生微生物防控害蟲

近年來，利用共生菌控制害蟲的策略受到廣泛關注。很多基于共生菌的害蟲控制理論被提出，其中部分已成功付諸實踐(王四寶和曲爽,2017)。例如，在田間條件下將果蠅共生的產(chǎn)酸克雷伯菌作為誘餌與殺蟲劑聯(lián)合應用可顯著減少果蠅的侵染(Soodetal.,2010)。在褐飛虱防控實踐中將抗生素與殺蟲劑配伍噴施，能顯著減少褐飛虱體內(nèi)共生菌的數(shù)量，從而極大地提高了殺蟲劑控制褐飛虱效果(Shentuetal.,2016)。

通過大量飼養(yǎng)和釋放雄性不育昆蟲降低害蟲種群的數(shù)量的昆蟲不育技術也是近年來使用最為有效和對環(huán)境友好的害蟲綜合防治技術之一。其中通過輻射導致的不育雄蟲的低成本、高效率的大規(guī)模飼養(yǎng)技術就有可能依賴于對其共生微生物的認識。通過在飼料里添加昆蟲腸道益生菌，如克雷伯氏菌K.pneumonia、腸桿菌Enterobacterspp.和弗氏檸檬酸桿菌C.freundii可以改善地中海實蠅的生活力、發(fā)育速度甚至交配競爭力等(Ben Amietal.,2010;Gavrieletal.,2011;Hamdenetal.,2013;Sacchettietal.,2014)。其中腸桿菌Enterobactersp.AA26已被證明是一種有效的啤酒酵母的替代品，在幼蟲飼料中加入滅活的細菌細胞，不僅滿足了實蠅幼蟲日糧所需的營養(yǎng)需求，還保持甚至提高了不育蠅的重要生物學“品質(zhì)”性狀(Augustinosetal.,2015;Kyritsisetal.,2019)。在飼料中添加產(chǎn)酸克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌同樣也可以提高桔小實蠅和斑翅果蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)水平，增加糖類和氨基酸代謝水平，促進其發(fā)育(Caietal.,2018;高歡歡等,2020)。

5 小結與展望

將昆蟲及其體內(nèi)共生微生物作為進化選擇的一個整體對待的共生體概念的提出，使得對昆蟲行為、生長發(fā)育、環(huán)境適應能力等方面的認識不再局限于僅以昆蟲作為研究對象，而是將共生微生物之間以及共生微生物與宿主之間多層次、多維度互作的微生態(tài)系統(tǒng)給以充分的考慮，這樣的研究可以系統(tǒng)、全面、科學地揭示昆蟲行為(Feldhaar,2011;Wernegreen,2012)。共生微生物與宿主的共存是共生體成功進化的重要因素，宿主的表型是由宿主與其體內(nèi)共生微生物共同決定的(Rosenbergetal.,2010)。在共生關系建立、維持和多樣化的過程中共生伙伴雙方都經(jīng)歷了遺傳、生化和生理的變化，這種變化無疑對它們的生命周期和生物學有著深遠的影響(Gupta and Nair,2020)。由于微生物群落與宿主相比傳代時間短、基因更加靈活多變，能夠對劇烈的環(huán)境變化作出迅速的反應，從而保障了共生體的生存。在不斷變化的環(huán)境條件下，共生微生物群落無疑是宿主獲得新性狀的最重要的進化儲備。共生體可塑性越高，進化的空間越大，適應性也越強，不容易滅絕。因此，在今后研究害蟲時，應拓展對共生微生物的功能及其機制的研究，加深對宿主害蟲的生態(tài)適應性、致害性以及抗藥性變異等方面科學認識。此外，在當今害蟲的可持續(xù)治理要求下，生態(tài)平衡和生物多樣性的維持需要考慮到微生物的因素。比如在轉基因作物環(huán)境安全評價體系中，通常將非靶標昆蟲的死亡率、體重、發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量等表觀性狀作為評價指標。但這些表觀性狀在靈敏度方面存在欠缺，不能很好地反映外源蛋白潛在的生物學影響。Zhang等(2019b)首次將龜紋瓢蟲Propyleajaponica的共生菌引入轉基因環(huán)境安全評價體系中，篩選出用于環(huán)境安全評價的共生菌指示種，建立了相應的技術體系，開辟了環(huán)境安全評價新方法。

5.1 共生體形成和維持的分子機制

盡管共生微生物在塑造宿主生物方面起著至關重要的作用，但對共生組合的形成、維持和共進化的理解是有限的，而且很大程度上是由于對共生微生物的了解以及種群水平上細菌共生體與生態(tài)特性相關性研究相對較少(Stubbendiecketal.,2019)。比如，次生共生菌在保護宿主抵御寄生等方面具有積極的作用，但攜帶次生共生菌情況下宿主的適應度反而會降低(Russell and Moran,2006)。宿主與共生體之間通過直接的相互作用和交換復雜的化學信號來建立和維持它們的共生關系。那么這些復雜的化學信號是什么以及微生物與宿主組成的共生體在不同環(huán)境條件下的可塑性是如何建立和維持的？蚜蟲體內(nèi)防御性共生菌H.defensa既可以通過對寄生蜂的抗寄生保護宿主，又可能因為更高的捕食敏感性受到捕食威脅。這種次生共生菌在宿主種群中能夠得以維持可能取決于：(1)提供給宿主的利益和共生的相關成本之間的平衡；(2)蚜蟲種群內(nèi)共生菌的傳播速率；(3)生態(tài)環(huán)境，比如捕食和寄生壓力之間的相互作用(Polinetal.,2014)。這些解釋需要更進一步通過對更多的害蟲微生物共生體進行研究，從理論上明確共生關系建立和維持的分子機制。

5.2 大尺度上多角關系揭示不夠深刻，研究方法“零敲碎打”、不夠系統(tǒng)

昆蟲與其體內(nèi)的共生菌顯然是一個密不可分的生物群落，它們之間相互作用，共同應對各種環(huán)境的影響。在多角關系的研究中目前主要集中在共生微生物與宿主之間，尚缺乏深入的宿主內(nèi)部微生物之間的互作和動態(tài)平衡、宿主微生物與寄主植物之間、宿主微生物與入侵微生物、甚至宿主微生物與寄主植物微生物之間的互作研究(Sorokanetal.,2017)。最近已有研究者通過比較煙粉虱及其寄生蜂之間共生菌多樣性時發(fā)現(xiàn)，害蟲與其天敵如寄生蜂之間就存在共生菌互相的傳播和影響(Karutetal.,2020)。在害蟲取食植物的過程中，共生菌積極參與了致害過程，同時也需要注意的是植物本身和害蟲的天敵也有與其新陳代謝密切相關的微生物群，它們也參與到與害蟲的防御斗爭中。雙邊相互作用的研究掩蓋了復雜生態(tài)環(huán)境中生物間不斷相互作用的集體作用，這種作用不僅影響宿主的反應，而且也影響著微生物相互之間的反應。

共生細菌與病原物之間的關系同樣受到多種因子的影響，如昆蟲的種類和遺傳背景(基因型)、昆蟲生育期、共生細菌的種類及其與宿主的進化關系、體內(nèi)其他共生細菌的存在狀況和環(huán)境溫度等，但是這些因子具體是如何起作用的，都有待進一步研究。由此不難想象，害蟲與共生微生物之間的復雜性和多樣性，生長在不同生態(tài)區(qū)域的不同害蟲其共生微生物種類不同，其功能也不盡相同。對于同一害蟲種類也因發(fā)育時期以及面對的不同作物、不同外界環(huán)境其共生物種類功能同樣也會不同。

因此，要建立共生體的生態(tài)觀，從生態(tài)學的角度出發(fā)，研究共生關系的形成、維持和進化。需要開展不同微生物之間、微生物與宿主之間以及與環(huán)境非生物因子多維度的互作研究。需要明確共生微生物是如何突破宿主的免疫防線，與其建立密切的共生關系。微觀上需要了解宿主與共生微生物之間相互作用的受體和信號分子，大尺度上需要明確在特定生態(tài)條件下的共生體的動態(tài)平衡。但是，目前的對害蟲共生菌以及共生體的研究中，研究方法“零敲碎打”，對特定研究對象體系缺乏長期性、系統(tǒng)性。今后，通過建立不同害蟲種類的共生體研究模型和體系，改進微生物分離培養(yǎng)方法并結合宏基因組測序，綜合分析宿主害蟲生物學性狀、致害性等關鍵性功能發(fā)揮中共生微生物核心種群的形成以及演變規(guī)律，有望加深對植物害蟲共生體的認識。

5.3 定向調(diào)控共生體，開發(fā)新型防治策略

共生體具有可塑性，共生微生物種群處于動態(tài)變化中，很多時候我們很難簡單地把共生菌判斷為兼性共生菌還是專性共生菌，因為它們之間存在著轉化關系，在長期的進化過程和環(huán)境適應過程中兼性共生微生物可以轉化為專性共生菌，病原微生物可以轉化為共生微生物等。通過探究共生體網(wǎng)絡的建立和維持的內(nèi)在規(guī)律以及外在生態(tài)條件等關鍵因子，找到定向調(diào)控共生微生物群落的措施，有助于開發(fā)新型的植物害蟲可持續(xù)綠色防控策略。