寄生黑腹果蠅的日本開(kāi)臂反顎繭蜂生物學(xué)特性及其寄生對(duì)寄主發(fā)育及免疫反應(yīng)的影響

張 顯,周思聰,陳佳妮,龐 蘭,張啟超,王 瑩,時(shí) 敏,陳學(xué)新,黃健華

(浙江大學(xué)昆蟲(chóng)科學(xué)研究所,農(nóng)業(yè)部作物病蟲(chóng)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310058)

化學(xué)農(nóng)藥在降低農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)危害、保障農(nóng)產(chǎn)品高產(chǎn)和推動(dòng)社會(huì)發(fā)展等方面發(fā)揮了極其重要的作用。但近些年來(lái)，由于農(nóng)藥不合理使用帶來(lái)的許多弊端，比如環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留及害蟲(chóng)抗藥性等問(wèn)題，引起了全社會(huì)的廣泛性關(guān)注(Lietal.,2018)。生物防治是指利用天敵昆蟲(chóng)及病原微生物等自然資源去控制害蟲(chóng)發(fā)生的一種環(huán)境友好、生態(tài)安全的防控技術(shù)。它能有效避免農(nóng)藥濫用帶來(lái)的一系列問(wèn)題，符合我國(guó)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的戰(zhàn)略需求(古德祥等,2000;張俊杰等,2015;黨英僑等,2018)。寄生蜂是一類重要的寄生性天敵昆蟲(chóng)，其數(shù)量眾多，約占整個(gè)昆蟲(chóng)種類的10%～20%(Whitfield,2003)。通過(guò)大規(guī)模飼養(yǎng)和人工釋放寄生蜂，可以有效地控制和降低害蟲(chóng)種群數(shù)量，達(dá)到對(duì)害蟲(chóng)防治的目的。我國(guó)已經(jīng)有許多應(yīng)用寄生蜂進(jìn)行害蟲(chóng)防治的成功案例，比如：應(yīng)用赤眼蜂對(duì)玉米螟、二化螟Chilosuppressalis、甘蔗螟蟲(chóng)等害蟲(chóng)進(jìn)行防治(張海燕等,2019)；應(yīng)用麗蚜小蜂Encarsiaformosa減少溫室害蟲(chóng)白粉虱的危害等等(李洪安等,2007)。

在自然界中，有一些果蠅屬Drosophila昆蟲(chóng)，比如斑翅果蠅D.suzukii，是危害極大的漿果類水果害蟲(chóng)。與其他果蠅種類不同，斑翅果蠅雌蟲(chóng)具有鋸齒狀產(chǎn)卵器，所以它能夠?qū)⒙旬a(chǎn)在即將成熟的果皮下，孵化后的斑翅果蠅幼蟲(chóng)通過(guò)取食果肉為生(Atallahetal.,2014)。斑翅果蠅原產(chǎn)于東南亞，近年來(lái)傳入美洲和歐洲等許多國(guó)家和地區(qū)，對(duì)當(dāng)?shù)氐乃a(chǎn)業(yè)造成了巨大的危害(Leeetal.,2011;Cinietal.,2014)。在我國(guó)四川、云南、浙江等省份都發(fā)生過(guò)斑翅果蠅危害櫻桃、藍(lán)莓、葡萄等水果，嚴(yán)重影響了水果產(chǎn)量并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(張成林等,2011;張開(kāi)春等,2014)。為此，國(guó)內(nèi)外生物防治領(lǐng)域相關(guān)研究人員一直致力于尋找能夠有效降低斑翅果蠅害蟲(chóng)種群的寄生蜂，希望通過(guò)大量繁殖和釋放技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)斑翅果蠅危害的持續(xù)控制。

目前，果蠅屬寄生蜂的研究主要集中寄生果蠅幼蟲(chóng)的繭蜂科(Braconidae)寄生蜂和環(huán)腹癭蜂科 (Figitidae)寄生蜂，以及寄生果蠅蛹期的錘角細(xì)蜂科(Diapriidae)寄生蜂和金小蜂科(Pteromalidae)寄生蜂(Cartonetal.,1986)。有研究表明，錘角細(xì)蜂科的毛錘角細(xì)蜂Trichopriadrosophilae對(duì)斑翅果蠅有很高的寄生效率(Chabertetal.,2012)。而絕大多數(shù)幼蟲(chóng)寄生蜂，像環(huán)腹癭蜂科(Figitidae)Leptopilina屬的異小環(huán)腹癭蜂L.heterotoma和布拉迪小環(huán)腹癭蜂L.boulardi都不能成功寄生斑翅果蠅。本課題組于2018年在浙江省臺(tái)州地區(qū)(28°50′N,120°34′E)誘捕到一種繭蜂科開(kāi)臂反顎繭蜂屬Asobara的果蠅幼蟲(chóng)寄生蜂日本開(kāi)臂反顎繭蜂Asobarajaponica，發(fā)現(xiàn)其能成功寄生斑翅果蠅(Zhangetal.,2020)。更為重要的是，該寄生蜂種群的生殖方式為產(chǎn)雌孤雌生殖，即后代均為雌性。這些特性均顯示日本開(kāi)臂反顎繭蜂是一種潛在的、可用于生物防治斑翅果蠅的優(yōu)勢(shì)寄生蜂。

日本開(kāi)臂反顎繭蜂是典型的單寄生蜂，其能寄生多種果蠅屬的昆蟲(chóng)，這有助于我們選擇一種適合的替代寄主進(jìn)行工廠化大規(guī)模擴(kuò)繁，并用以生物防治(Ideoetal.,2008)。黑腹果蠅D.melanogaster是一種模式昆蟲(chóng)，它具有繁殖速度快、容易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。因此，黑腹果蠅可能是日本開(kāi)臂反顎繭蜂進(jìn)行大規(guī)模繁殖的最佳替代寄主。本研究針對(duì)日本開(kāi)臂反顎繭蜂-黑腹果蠅這一體系，來(lái)研究寄生蜂在寄主體內(nèi)的形態(tài)特征、發(fā)育歷期及寄生效率等生物學(xué)特征；研究寄生蜂寄生對(duì)寄主生長(zhǎng)發(fā)育及免疫信號(hào)通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期能夠提升日本開(kāi)臂反顎繭蜂大量繁殖的能力，從而保證寄生蜂生防產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

黑腹果蠅品系W1118從美國(guó)印第安納大學(xué)Bloomington果蠅中心購(gòu)買，用5.5 cm×5.5 cm的果蠅瓶飼養(yǎng)。果蠅食物為常規(guī)的玉米粉配方，每6 L果蠅食物含：玉米粉318 g,干酵母120 g，瓊脂粉57 g，蛋白胨60 g，紅糖90 g，葡萄糖180 g，酵母提取物60 g。日本開(kāi)臂反顎繭蜂于2018年6月在浙江省臺(tái)州地區(qū)用葡萄和香蕉等水果誘集，并一直飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室。日本開(kāi)臂反顎繭蜂為孤雌生殖品種，所有后代均為雌性。寄生蜂雌蜂飼養(yǎng)在蘋果汁食物中，食物配方為：每1 L含27 g瓊脂，33 g紅糖，330 mL蘋果汁，20 mL 10%尼泊金甲酯。所有昆蟲(chóng)均在人工氣候箱中進(jìn)行飼養(yǎng)，黑腹果蠅飼養(yǎng)條件為溫度25±1℃，相對(duì)濕度50%±1%，光周期16L∶8D；寄生蜂飼養(yǎng)條件為溫度25±1℃，相對(duì)濕度50%±1%，光周期16L∶8D。

1.2 日本開(kāi)臂反顎繭蜂發(fā)育歷期及形態(tài)特征觀測(cè)

挑取200頭黑腹果蠅2齡幼蟲(chóng)放于含果蠅食物的果蠅瓶中，用羽化后4 d的日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生，使用寄生蜂數(shù)與供試寄主幼蟲(chóng)數(shù)比為1∶20，寄生3 h后取出寄生蜂，將寄主放于25±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察。寄生后每隔12 h取被寄生的黑腹果蠅進(jìn)行解剖，觀察日本開(kāi)臂反顎繭蜂在寄主體內(nèi)的發(fā)育階段，并用KEYENCE VHX-2000C成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步判斷寄生蜂幼蟲(chóng)期與蛹期分別為產(chǎn)卵后2-6 d 和7-16 d。為了進(jìn)一步精確計(jì)算日本開(kāi)臂反顎繭蜂各發(fā)育階段所需的時(shí)間，我們分別在寄生蜂產(chǎn)卵后1.5,2和2.5 d解剖30頭寄主，用以統(tǒng)計(jì)蜂卵孵化數(shù)；分別在產(chǎn)卵后6,7 和8 d解剖30頭寄主，用以統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)化蛹數(shù)；分別在產(chǎn)卵后15,16和17 d解剖30頭寄主，用以統(tǒng)計(jì)蛹羽化數(shù)。卵期所需天數(shù)(d)=(1.5 d×卵孵化數(shù)+2 d×卵孵化數(shù)+2.5 d×卵孵化數(shù))/卵孵化總數(shù)；幼蟲(chóng)期所需天數(shù)(d)=[(6 d×幼蟲(chóng)化蛹數(shù)+7 d×幼蟲(chóng)化蛹數(shù)+8 d×幼蟲(chóng)化蛹數(shù))/總化蛹數(shù)]-卵期發(fā)育天數(shù)；蛹期所需時(shí)間(d)=[(15 d×蛹羽化數(shù)+16 d×蛹羽化數(shù)+17 d×蛹羽化數(shù))/總羽化數(shù)]-幼蟲(chóng)期發(fā)育天數(shù)-卵期發(fā)育天數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 日本開(kāi)臂反顎繭蜂的寄生率及出蜂率測(cè)定

采用的實(shí)驗(yàn)方法同1.2節(jié)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，每次重復(fù)均統(tǒng)計(jì)每瓶?jī)?nèi)寄主果蠅化蛹數(shù)、寄主幼蟲(chóng)死亡數(shù)、寄主羽化數(shù)、寄生蜂羽化數(shù)以及寄主蛹死亡數(shù)，以此計(jì)算寄生率、出蜂率、寄主幼蟲(chóng)死亡率和寄主蛹死亡率。寄生率=[1-寄主羽化數(shù)/供試寄主幼蟲(chóng)數(shù)]×100%；出蜂率=(寄生蜂羽化數(shù)/供試寄主幼蟲(chóng)數(shù))×100%；寄主幼蟲(chóng)死亡率=(寄主幼蟲(chóng)死亡數(shù)/供試寄主幼蟲(chóng)數(shù))×100%；寄主蛹死亡率=(寄主蛹死亡數(shù)/寄主化蛹數(shù))×100%。

1.4 日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生前后寄主黑腹果蠅發(fā)育歷期測(cè)定

取50頭交配后的雌性黑腹果蠅放于果蠅瓶中產(chǎn)卵3 h左右,每次能產(chǎn)約200粒卵，待果蠅幼蟲(chóng)發(fā)育至2齡幼蟲(chóng)時(shí)，立即用羽化后4 d的日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生，使用寄生蜂數(shù)與供試寄主幼蟲(chóng)數(shù)比為1∶20，寄生3 h后取出寄生蜂，將寄主放于25±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔12 h統(tǒng)計(jì)每瓶化蛹數(shù)，根據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)化蛹數(shù)占最終化蛹數(shù)的百分比作圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，處理組為日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生的黑腹果蠅，對(duì)照組為相近卵數(shù)且未被寄生的黑腹果蠅。

1.5 qRT-PCR方法檢測(cè)黑腹果蠅免疫通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平

本研究借鑒Schlenke等(2007)方法，在果蠅3個(gè)主要免疫通路，即Toll通路、Imd通路和PO通路，各選取5個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)。其中，Toll通路基因：SPE(FlyBase ID:FBgn0039102),Toll(FlyBase ID:FBgn0262473),Myd88 (FlyBase ID:FBgn0033402),Dif(FlyBase ID:FBgn0011274)和Drosomycin(FlyBase ID:FBgn0283461);Imd通路基因：PGRP-LE(FlyBase ID:FBgn0030695),PGRP-LC(FlyBase ID:FBgn0035976),imd(FlyBase ID:FBgn0013983),Relish(FlyBase ID:FBgn0014018)和Diptericin(FlyBase ID:FBgn0034407);PO通路基因：Spn27A(FlyBase ID:FBgn0028990),MP2 (FlyBase ID:FBgn0037515),yellow-f2 (FlyBase ID:FBgn0038105),DoxA2 (FlyBase ID:FBgn0261396)和PPO1 (FlyBase ID:FBgn0283437)。對(duì)被寄生后6與12 h的黑腹果蠅幼蟲(chóng)整蟲(chóng)進(jìn)行取樣，使用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取RNA，Vazyme HiScript Ⅱ Q RT SuperMix (Cat#Q223-01,Vazyme,南京)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第1鏈，最終使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix Kit(Cat#Q311-02,Vazyme,南京)在AriaMax實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Agilent Technologies,CA,USA)上進(jìn)行qRT-PCR分析。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR-Green Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，500 ng/μL的cDNA模板0.2 μL，滅菌水9 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性10 s,57℃退火20 s,72℃延伸20 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線：95℃變性15 s,60℃退火1 min,95℃變性15 s。rp49(Flybase ID:FBgn0002626)作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)豐度。qRT-PCR引物詳見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR的引物序列Table 1 Primers for qRT-PCR in this study

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在Data Processing System(DPS) Package Version 9.5(Tang and Zhang,2013)中進(jìn)行分析，使用的分析方法有非配對(duì)Student氏t檢驗(yàn)。設(shè)定0.01

2 結(jié)果

2.1 日本開(kāi)臂反顎繭蜂的發(fā)育歷期及形態(tài)特征

日本開(kāi)臂反顎繭蜂是一種幼蟲(chóng)-蛹寄生蜂，成熟的雌性寄生蜂將卵產(chǎn)在果蠅2齡幼蟲(chóng)體內(nèi)，其蜂卵在3齡寄主幼蟲(chóng)體內(nèi)孵化。待寄主發(fā)育至蛹期時(shí)，寄生蜂幼蜂通過(guò)大量取食蛹期寄主的組織并完成自身世代發(fā)育。日本開(kāi)臂反顎繭蜂的發(fā)育經(jīng)歷卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)4個(gè)階段。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在25±1℃的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件下，日本開(kāi)臂反顎繭蜂的卵期發(fā)育需要2.38±0.01 d，幼蟲(chóng)期需要5.36±0.07 d，蛹期需要8.30±0.04 d (圖1)。由于本實(shí)驗(yàn)所用的日本開(kāi)臂反顎繭蜂為孤雌生殖品種，因此上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為雌性日本開(kāi)臂反顎繭蜂生長(zhǎng)發(fā)育所需的時(shí)間。

圖1 日本開(kāi)臂反顎繭蜂各發(fā)育階段發(fā)育歷期Fig.1 Duration of various developmental stages of Asobara japonica圖中的數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。Data in the figure are mean±SE.

經(jīng)過(guò)解剖成像，我們同時(shí)獲得了日本開(kāi)臂反顎繭蜂在寄主體內(nèi)不同發(fā)育階段的圖片(圖2)。日本開(kāi)臂反顎繭蜂卵呈香蕉形(圖2:A)，在早期發(fā)育的胚胎中可見(jiàn)明顯的兩層膜結(jié)構(gòu)，產(chǎn)卵后約2 d已可見(jiàn)幼蟲(chóng)形態(tài)，之后其突破內(nèi)膜發(fā)育為1齡幼蟲(chóng)。日本開(kāi)臂反顎繭蜂幼蟲(chóng)階段共分3個(gè)齡期，整個(gè)1齡幼蟲(chóng)階段均在外膜內(nèi)完成，發(fā)育初期的1齡幼蟲(chóng)可見(jiàn)輕微的體節(jié)分化，頭部顯著寬于體節(jié)，體色乳白色，腸道等結(jié)構(gòu)尚不清晰(圖2:B)；1齡末期體節(jié)部分明顯變寬，與頭部等寬，腸道明顯，約占整個(gè)蟲(chóng)體的二分之一，體色透明，且有少量脂肪顆粒積累。產(chǎn)卵后約4 d，1齡幼蟲(chóng)突破外膜，發(fā)育成2齡幼蟲(chóng)，能觀察到明顯的蛻皮(圖2:C)。隨著寄生蜂2齡幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)，其腸道逐漸變成不透明的淡黃色，約占身體的2/3，身體四周布滿脂肪顆粒，體軀寬于頭部(圖2:D)。產(chǎn)卵后5 d，日本開(kāi)臂反顎繭蜂體型較2齡幼蟲(chóng)明顯變大，發(fā)育成3齡幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)身體彎曲，呈黃色，腸道幾乎充滿整個(gè)身軀(圖2:E)。在這一過(guò)程中，我們沒(méi)有看到蛻皮，可能2齡幼蟲(chóng)蛻下的表皮被寄生蜂3齡幼蟲(chóng)快速消化并利用。隨后，日本開(kāi)臂反顎繭蜂幼蟲(chóng)進(jìn)入預(yù)蛹及蛹期(圖2:F-H)。

圖2 日本開(kāi)臂反顎繭蜂各發(fā)育階段的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Asobara japonica at different developmental stagesA:卵Egg;B:1齡幼蟲(chóng)初期Early stage of the 1st instar larva;C:2齡幼蟲(chóng)初期Early stage of the 2nd instar larva;D:2齡幼蟲(chóng)晚期 Late stage of the 2nd instar larva;E:3齡幼蟲(chóng)3rd instar larva;F:預(yù)蛹Prepupa;G:早期蛹Early stage of pupa;H:晚期蛹Late stage of pupa.箭頭示1齡幼蜂蛻下的表皮。The arrow indicates the cuticle exuviated by the 1st instar larva.

2.2 日本開(kāi)臂反顎繭蜂的寄生率及出蜂率

寄生蜂與寄主間存在著十分復(fù)雜的相互作用關(guān)系。一方面，寄生蜂會(huì)釋放一些寄生因子使其成功寄生；另一方面，寄主會(huì)產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答，如包囊和黑化反應(yīng)，最終會(huì)導(dǎo)致寄生蜂無(wú)法生長(zhǎng)發(fā)育。在寄主黑腹果蠅上的寄生率及出蜂率，是決定其是否適用于大規(guī)模擴(kuò)繁日本開(kāi)臂反顎繭蜂并用于生物防治應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此，我們對(duì)日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生黑腹果蠅的寄生率和出蜂率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。研究結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，日本開(kāi)臂反顎繭蜂的寄生率為94.9%±4.0%，出蜂率為64.3%±7.1%(表2)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生能夠?qū)е螺^高的寄主幼蟲(chóng)和蛹死亡率，分別為25.8%±3.7%和6.6%±1.1%，而未寄生的對(duì)照組寄主幼蟲(chóng)和蛹死亡率很低，分別只有4.1%±1.4%和0(表2)。

2.3 日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生對(duì)黑腹果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響

我們對(duì)日本開(kāi)臂反顎繭蜂調(diào)控寄主生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行了初步的研究。通過(guò)每隔12 h統(tǒng)計(jì)寄主成功化蛹數(shù)，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的化蛹率，并采用Student氏t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。研究結(jié)果表明，日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生后黑腹果蠅化蛹時(shí)間發(fā)生了顯著延遲。在產(chǎn)卵后5,5.5和6 d，被寄生組化蛹率相較未被寄生對(duì)照顯著降低(P<0.05)，其中在50%化蛹率這一節(jié)點(diǎn)上，寄生后的寄主化蛹時(shí)間延長(zhǎng)了約0.5 d(圖3)。結(jié)果顯示，日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生能夠延緩黑腹果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育，和已報(bào)道的其他果蠅寄生蜂有相似的作用機(jī)制。

圖3 日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生后黑腹果蠅化蛹時(shí)間的變化Fig.3 Changes of pupation time of Drosophila melanogaster after being parasitized by Asobara japonica圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)表示同一寄生時(shí)間點(diǎn)被寄生組和未被寄生對(duì)照之間差異顯著(P<0.05,Student氏t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE.The asterisks above bars indicate significant difference between the parasitized group and the unparasitized control at the same time point post parasitization (P<0.05,Student’s t-test).

2.4 日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生對(duì)黑腹果蠅Toll,Imd和PO免疫通路關(guān)鍵基因的影響

為了弄清楚日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生是否影響了寄主的免疫通路，我們選擇果蠅3個(gè)主要免疫通路，即Toll通路、Imd通路和PO通路，各通路分別選取5個(gè)重要基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，寄生6和12 h后，Toll通路中的基因SPE,Toll,Myd88和Dif表達(dá)量與未被寄生對(duì)照組比無(wú)顯著變化(P>0.05)(圖4:A-D)，但該通路一個(gè)末端效應(yīng)抗菌肽基因Drosomycin表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，其寄生后6 h相較未被寄生對(duì)照上調(diào)53倍，寄生后12 h相較未寄生對(duì)照上調(diào)38倍(圖4:E)；寄生6和12 h后，Imd通路中的基因PGRP-LE,PGRP-LC,imd和Relish表達(dá)量與未被寄生對(duì)照組比無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖4:F-I)，但一個(gè)末端效應(yīng)抗菌肽基因Diptericin表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，其中寄生后6 h相較未被寄生對(duì)照上調(diào)36倍，寄生后12 h相較未被寄生對(duì)照上調(diào)12倍(圖4:J)。Toll通路和Imd通路的一些上游基因的表達(dá)水平?jīng)]有受到日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生的影響，但是其下游的兩個(gè)抗菌肽基因Drosomycin和Diptericin卻顯著上調(diào)。

在寄生6和12 h后，PO通路基因Spn27A,MP2,yellow-f2和DoxA2表達(dá)量與未被寄生對(duì)照組比無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖4:K-N)，但原酚氧化酶基因PPO1表達(dá)量發(fā)生顯著下調(diào)(P<0.05)，其中寄生后6 h相較未寄生對(duì)照下調(diào)38%，寄生后12 h相較未被寄生對(duì)照下調(diào)50%(圖4:O)。結(jié)果顯示寄生蜂能夠快速且有效抑制寄主的黑化反應(yīng)，從而保證日本開(kāi)臂反顎繭蜂具有很高的寄生效率。

圖4 日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生6和12 h后黑腹果蠅幼蟲(chóng)Toll,Imd和PO通路重要基因相對(duì)表達(dá)量變化Fig.4 Changes in relative expression levels of important genes of Toll,Imd and PO pathways in Drosophila melanogaster larvae after being parasitized by Asobara japonica for 6 and 12 hA-E:分別為Toll通路中的SPE,Toll,Myd88,Dif和Drosomycin基因 SPE,Toll,Myd88,Dif and Drosomycin,respectively,involved in Toll pathway;F-J:分別為Imd通路中的PGRP-LE,PGRP-LC,imd,Relish 和Diptericin基因PGRP-LE,PGRP-LC,imd,Relish and Diptericin,respectively,involved in Imd pathway；K-O:分別為PO通路的Spn27A,MP2,yellow-f2,DoxA2和PPO1基因Spn27A,MP2,yellow-f2,DoxA2 and PPO1,respectively,involved in PO pathway.圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)表示同一寄生時(shí)間點(diǎn)被寄生組和未被寄生對(duì)照之間差異顯著(Student氏t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE.The asterisks above bars indicate significant difference between the parasitized group and the unparasitized control at the same time point post parasitization (Student’s t-test).*0.01

3 討論

日本開(kāi)臂反顎繭蜂是果蠅的幼蟲(chóng)-蛹期寄生蜂。通過(guò)解剖與成像，我們對(duì)日本開(kāi)臂反顎繭蜂羽化前的6個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段(卵期、1齡幼蟲(chóng)期、2齡幼蟲(chóng)期、3齡幼蟲(chóng)期、預(yù)蛹期和蛹期)進(jìn)行了詳細(xì)觀察。在實(shí)驗(yàn)室條件下，日本開(kāi)臂反顎繭蜂從卵發(fā)育到成蟲(chóng)需要16 d左右，其中卵期2.38±0.01 d，幼蟲(chóng)期5.36±0.07 d，蛹期8.30±0.04 d(圖1)。我們還發(fā)現(xiàn)日本開(kāi)臂反顎繭蜂對(duì)黑腹果蠅寄生效率很高，平均寄生率為94.9%±4.0%，平均出蜂率為64.3%±7.1%(表2)。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)寄生會(huì)引起黑腹果蠅在幼蟲(chóng)期和蛹期分別產(chǎn)生25.8%和6.6%的死亡率(表2)，推測(cè)其可能與日本開(kāi)臂反顎繭蜂具有較強(qiáng)的毒液作用有關(guān)。有研究表明日本開(kāi)臂反顎繭蜂的毒液能導(dǎo)致寄主暫時(shí)麻痹癱軟，從而利于寄生蜂的產(chǎn)卵(Furihata and Kimura,2009)。另外，Mitsui等(2007)發(fā)現(xiàn)，在日本北部境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的日本開(kāi)臂反顎繭蜂種群的生殖方式為產(chǎn)雌孤雌生殖，而在南部境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的日本開(kāi)臂反顎繭蜂種群為有性生殖。因此，本實(shí)驗(yàn)室在浙江臺(tái)州地區(qū)采集的日本開(kāi)臂反顎繭蜂和日本北部境內(nèi)的種群較為相似，可能都是由于胞內(nèi)共生菌Wolbachia所導(dǎo)致的孤雌生殖(Kremer,2009)。

日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生黑腹果蠅后，果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育速度明顯減緩，50%寄主化蛹時(shí)，寄主幼蟲(chóng)化蛹時(shí)間延長(zhǎng)了約0.5 d，占整個(gè)幼蟲(chóng)發(fā)育期的10%(圖3)。寄生蜂寄生引起寄主生長(zhǎng)發(fā)育延緩這一現(xiàn)象在其他寄生體系中普遍存在，推測(cè)其可能滿足寄生蜂自身生長(zhǎng)發(fā)育所需要(周思聰?shù)?2018)。寄生蜂在寄生時(shí)通常會(huì)將一些寄生因子連同蜂卵一起注射至寄主體內(nèi)，這些寄生因子包括毒液、多分DNA病毒、類病毒顆粒、畸形細(xì)胞、卵巢蛋白和幼蜂分泌物等(葉恭銀等,2019)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)菜蛾盤絨繭蜂Cotesiavestalis會(huì)釋放一些源于多分DNA病毒和畸形細(xì)胞的microRNAs至寄主小菜蛾P(guān)lutellaxylostella體內(nèi)，從而下調(diào)蛻皮激素受體的表達(dá)水平，最終延緩寄主的生長(zhǎng)發(fā)育(Wangetal.,2018)。有意思的是，日本開(kāi)臂反顎繭蜂目前只發(fā)現(xiàn)有毒液這一種寄生因子，其毒液蛋白如何調(diào)控寄主的生長(zhǎng)發(fā)育還需后續(xù)進(jìn)一步的研究和探索。

寄生蜂往往采取不同的策略去克服寄主的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而成功寄生。其寄生策略主要包括免疫抑制型和免疫逃避型(Labrosseetal.,2003)。所謂免疫抑制型，即寄生蜂通過(guò)寄生因子抑制寄主的免疫反應(yīng)；而免疫逃避型，是指寄生蜂通過(guò)粘附或降低寄主識(shí)別等機(jī)制逃避寄主的免疫反應(yīng)。果蠅寄生蜂L.boulardi寄生后引起寄主的大量蛋白裂解酶基因、Toll和JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)基因以及黑化級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)基因的顯著上調(diào)，其免疫抑制機(jī)制不明顯。它通過(guò)將卵粘附到寄主組織避免寄主的包囊反應(yīng)，是一種典型的免疫逃避型策略。同一屬的L.heterotoma寄生會(huì)引起果蠅寄主血細(xì)胞的裂解、造血器官淋巴腺消失和免疫相關(guān)基因的表達(dá)顯著降低，免疫抑制作用明顯，是一種典型的免疫抑制型策略 (Schlenkeetal.,2007)。研究還發(fā)現(xiàn)，L.heterotoma和L.boulardi毒液蛋白組分也存在明顯差異，這可能與其采用的不同寄生策略有關(guān)(Colinetetal.,2013)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黑腹果蠅被日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生后，與體液免疫相關(guān)的Toll和Imd通路的大部分基因表達(dá)沒(méi)有變化，而抗菌肽基因Drosomycin和Diptericin表達(dá)量均顯著上調(diào)，表明寄生可能導(dǎo)致Toll通路和Imd通路上游基因的編碼蛋白磷酸化，使其編碼蛋白活性發(fā)生改變(Lemaitre and Hoffmann,2007;Tang,2009)，而非直接轉(zhuǎn)錄水平的影響。有意思的是，寄生蜂寄生不僅能提高寄主的抗菌能力，而且還能主動(dòng)分泌一些抗菌肽協(xié)助寄主抵御病原微生物的感染，從而保證寄生成功(Gaoetal.,2016)。另外，寄生后，與黑化相關(guān)的原酚氧化酶基因PPO1表達(dá)量顯著下調(diào)(圖4)。這個(gè)結(jié)果和日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生后寄主果蠅無(wú)黑化反應(yīng)的現(xiàn)象相一致，說(shuō)明日本開(kāi)臂反顎繭蜂通過(guò)下調(diào)寄主酚氧化酶(PO)活性，進(jìn)而抑制寄主體液免疫能力。Furihata等(2013)發(fā)現(xiàn)，向果蠅體內(nèi)注射日本開(kāi)臂反顎繭蜂的毒液，能引起抗菌肽基因表達(dá)量顯著上調(diào)，這和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。這些結(jié)果表明，寄生蜂一方面通過(guò)下調(diào)寄主PPO1的表達(dá)，去抑制寄主黑化免疫反應(yīng)；另一方面通過(guò)上調(diào)寄主抗菌肽，去增強(qiáng)寄主抵抗微生物感染的能力。正是由于這一反一正兩種截然不同的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，才能保證寄生蜂后代在寄主體內(nèi)正常發(fā)育。

本研究發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅是日本開(kāi)臂反顎繭蜂一種合適的規(guī)?；B(yǎng)殖替代寄主。日本開(kāi)臂反顎繭蜂寄生黑腹果蠅后，通過(guò)延緩寄主的生長(zhǎng)發(fā)育、抑制寄主的體液免疫以及提升寄主的抗菌能力，從而保障了很高的寄生效率。研究結(jié)果為大量繁殖與釋放日本開(kāi)臂反顎繭蜂，用以防治斑翅果蠅的危害，提供了必要的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。