豬繁殖與呼吸綜合征病毒類NADC30毒株與JXA1-R疫苗株熒光定量PCR鑒別檢測方法的建立及應(yīng)用

周新宇，陳鑫鑫，喬松林，郭振華，李 睿，鄧瑞廣，張改平

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎及弱胎等繁殖障礙以及仔豬與育肥豬呼吸道疾病為主要特征的病毒性傳染病[1-2]，該病在全球范圍內(nèi)傳播，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約15 kb，含有10個(gè)開放閱讀框[3-4]。ORF1a和ORF1b分別編碼pp1a和pp1ab多聚蛋白，pp1a和pp1ab分別被酶切裂解為至少16種非結(jié)構(gòu)蛋白[5-6]。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2是不同毒株基因組差異最大的區(qū)域[7]。2006年，我國暴發(fā)了由高致病性PRRSV(High pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)引發(fā)的以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的PRRS疫情，HP-PRRSV在Nsp2蛋白序列中存在30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失[8-9]；2012年，我國報(bào)道了與PRRSV經(jīng)典毒株NADC30核苷酸相似性很高的毒株,命名為類NADC30毒株(NADC30-like strain)，其在Nsp2蛋白上存在131個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失[10-11]。自2013年以來，類NADC30毒株檢測率急劇上升，并且類NADC30毒株與其他田間毒株重組頻繁，迅速成為河南省乃至全國的優(yōu)勢流行毒株[12-14]。

PRRSV的檢測方法有很多種，包括病毒分離和鑒定、ELISA、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、血清中和試驗(yàn)(SN)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)等方法[15-16]。但在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中，大部分方法只能檢測而無法區(qū)分不同PRRSV毒株。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)和基因測序等分子生物學(xué)技術(shù)是目前鑒別檢測PRRSV最有效的方法[17]，根據(jù)Nsp2基因序列建立的熒光定量PCR檢測方法是目前用于區(qū)分PRRSV不同毒株的主要方法。鑒于此，基于不同毒株Nsp2基因序列缺失差異[18]，針對以HP-PRRSV毒株JXA1為親本得到的疫苗株JXA1-R和河南省滑縣采集樣品中新分離鑒定的類NADC30毒株HNhx基因序列[19]，以期建立能夠檢測區(qū)分疫苗株JXA1-R和類NADC30毒株HNhx的TaqMan熒光定量PCR方法和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，旨在為PRRSV的快速鑒別檢測提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 病毒及模板

PRRSV疫苗株JXA1-R購自普萊柯生物工程股份有限公司；類NADC30毒株HNhx(GenBank No.KX766379.1)由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)cDNA、塞尼卡病毒(SVA)cDNA、豬偽狂犬病毒(PRV)DNA、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)DNA和非洲豬瘟病毒(ASFV)的p72基因質(zhì)粒均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

TRIzol LS試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix、ExTaqDNA聚合酶、JM109感受態(tài)細(xì)胞、pMD 20-T載體和Premix ExTaq(Probe qPCR)試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Green Master購自Roche公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)合成

應(yīng)用MegAlign軟件對PRRSV JXA1-R株和HNhx株的Nsp2基因序列進(jìn)行分析，運(yùn)用NCBI中在線軟件Primer-BLAST分別設(shè)計(jì)引物，并根據(jù)探針設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)探針，用Oligo 7軟件評估探針。通過對修飾基團(tuán)分析，選擇FAM和CY-5作為探針5′端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)，針對熒光報(bào)告基團(tuán)選擇BHQ-1和BHQ-2作為3′端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)。本研究使用的引物和探針(表1)均由生工生物(上海)股份有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取和cDNA合成

用TRIzol LS分別提取待檢樣品、疫苗株JXA1-R和類NADC30毒株HNhx的總RNA，按照TRIzol LS說明書，分別用TRIzol LS裂解樣品，再用氯仿分離有機(jī)相和水相，異丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗滌，最后用RNase free dH2O溶解，測定RNA濃度。按照PrimerScript RT Master Mix 操作步驟，以20 μL的反轉(zhuǎn)體系為準(zhǔn)，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

根據(jù)疫苗株JXA1-R和類NADC30毒株HNhx的Nsp2序列，利用表1中克隆引物JXA1-R和HNhx分別進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，連接到pMD 20-T載體，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性重組克隆，進(jìn)行測序鑒定。構(gòu)建的重組質(zhì)粒測定濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。

表1 引物及探針序列Tab.1 Sequences of primers and probes

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍系列倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品103～109拷貝/μL，分別取2 μL作為熒光定量PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。對于探針法，經(jīng)優(yōu)化確定20 μL最佳反應(yīng)體系：Premix ExTaq(2×)10 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.2 μL，引物0.6 μL，探針0.1 μL，模板2 μL，RNase free dH2O補(bǔ)至20 μL;反應(yīng)條件：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。對于SYBR Green Ⅰ方法，經(jīng)優(yōu)化20 μL反應(yīng)體系：SYBR Green Master(2×)10 μL，引物1 μL，模板2 μL，RNase free dH2O補(bǔ)至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。使用ABI 7500 Fast Real-time PCR System進(jìn)行熒光定量PCR檢測，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍倍比稀釋，以每個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品為熒光定量PCR模板，同時(shí)設(shè)僅加水的陰性對照組，以確定建立方法可檢測到的最低拷貝數(shù)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

選取JXA1-R株和HNhx株不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3組批內(nèi)和批間重復(fù)，并計(jì)算批內(nèi)和批間的標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，以評估建立方法的穩(wěn)定性。

1.9 特異性試驗(yàn)

以PEDV、SVA、PRV、PCV2、ASFV的基因組為模板，以JXA1-R株和HNhx株的cDNA為陽性對照，同時(shí)設(shè)僅加水的陰性對照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，以檢測建立方法的特異性。

1.10 樣品檢測

所檢血清樣品來源于以下處理：將PRRSV陰性仔豬12頭隨機(jī)分為A、B、C 3組，A組接種疫苗株JXA1-R，B組接種PBS，C組不做處理；仔豬7日齡時(shí)，A組和B組均接種類NADC30毒株HNhx，C組不做處理。攻毒后15 d，采集血清樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

利用克隆引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增分別獲得Nsp2區(qū)JXA1-R株307 bp和HNhx株266 bp片段(圖1)，將目的基因片段連接到pMD 20-T載體上，作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對照。重組質(zhì)粒經(jīng)過測序鑒定，并測定其DNA含量：JXA1-R株為2 244.32 ng/μL，HNhx株為2 421.23 ng/μL，計(jì)算拷貝數(shù)后作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋使用。

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將2.1中針對JXA1-R株和HNhx株的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋后作為模板，根據(jù)反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR，生成擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2和圖3)，對應(yīng)的擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)出顯著的S形，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均達(dá)到0.990以上。

2.3 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)

將針對JXA1-R株和HNhx株的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，使標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為101～1010拷貝/μL，進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖4所示。JXA1-R株和HNhx株的檢出下限分別為104拷貝/μL 和103拷貝/μL，對應(yīng)的循環(huán)數(shù)分別約為33.67個(gè)和35.59個(gè)。根據(jù)陰性對照及3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定判定標(biāo)準(zhǔn)：對JXA1-R株，當(dāng)循環(huán)數(shù)≤33時(shí)，可以判定為陽性，當(dāng)循環(huán)數(shù)≥34時(shí)，判定為陰性，當(dāng)33<循環(huán)數(shù)<34時(shí)，判定為可疑；對HNhx株，當(dāng)循環(huán)數(shù)≤35時(shí)，可以判定為陽性，當(dāng)循環(huán)數(shù)≥36時(shí)，判定為陰性，當(dāng)35<循環(huán)數(shù)<36時(shí)，判定為可疑。

將針對JXA1-R株和HNhx株的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，使標(biāo)準(zhǔn)品含量依次為101～108拷貝/μL，進(jìn)行SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖5所示。JXA1-R株和HNhx株的檢出下限均為102拷貝/μL，對應(yīng)的循環(huán)數(shù)分別約為36.34個(gè)和36.94個(gè)，此時(shí)陰性對照對應(yīng)的循環(huán)數(shù)分別約為35.92個(gè)和36.02個(gè)。根據(jù)陰性對照及3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，最終確定判斷標(biāo)準(zhǔn)：對于JXA1-R株和HNhx株，當(dāng)循環(huán)數(shù)≤35時(shí)，可以判定為陽性，當(dāng)循環(huán)數(shù)≥36時(shí)，判定為陰性，當(dāng)35<循環(huán)數(shù)<36時(shí)，判定為可疑。

2.4 熒光定量PCR方法的穩(wěn)定性分析

將針對JXA1-R株和HNhx株的3份拷貝數(shù)不同的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3組批內(nèi)和批間重復(fù)，根據(jù)循環(huán)數(shù)進(jìn)行分析，其變異系數(shù)均小于1.5%(表2)，表明建立的Taq Man熒光定量PCR和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測方法均具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 熒光定量PCR方法的特異性檢測

利用建立的熒光定量PCR方法對PEDV和SVA的cDNA、PRV和PCV2的DNA、ASFV的質(zhì)粒進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6和圖7所示。陽性對照出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其他樣品檢測結(jié)果均為陰性，表明建立的方法具有良好的特異性。

表2 熒光定量PCR檢測3份不同拷貝數(shù)樣品的批內(nèi)和批間檢測結(jié)果Tab.2 Intra-assay and inter-assay reproducibility of fluorescent quantitative PCR

2.6 血清樣品檢測

利用建立的熒光定量PCR對動(dòng)物試驗(yàn)各組采集的血清樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表3。由表3可知，A組JXA1-R、HNhx檢測均為陽性，B組HNhx檢測陽性?？梢?，建立的熒光定量PCR方法可有效檢測疫苗株JXA1-R和類NADC30毒株HNhx。

TaqMan熒光定量PCR探針法可同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行JXA1-R株和HNhx株的檢測(圖8)，若待檢樣品中同時(shí)含有JXA1-R株和HNhx株，F(xiàn)AM和CY5兩種探針都呈現(xiàn)出擴(kuò)增曲線；若待檢樣品中只含有HNhx，只有CY5探針具有擴(kuò)增曲線。而SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR需要分別檢測待檢樣品中JXA1-R株和HNhx株。

表3 熒光定量PCR對樣品的檢測結(jié)果Tab.3 Detection of samples by fluorescent quantitative PCR

3 結(jié)論與討論

PRRSV自1987年在美國發(fā)現(xiàn)以來，每年給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV具有高度變異的特征，其進(jìn)化速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他RNA病毒[20]。2014—2019年，中國類NADC30毒株檢出率已高達(dá)60%左右[13]。類NADC30毒株與我國本土流行毒株極易發(fā)生基因重組[14,21]，其在流行毒株中所占比例急劇上升成為優(yōu)勢毒株[22-23]。熒光定量PCR由于其簡單、穩(wěn)定、快速以及準(zhǔn)確的特點(diǎn)[24]，現(xiàn)已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室檢測PRRSV的主要方法之一。常用的熒光定量PCR方法主要是TaqMan探針法和SYBR Green Ⅰ熒光染料法。本試驗(yàn)通過對JXA1-R疫苗株和類NADC30毒株HNhxNsp2基因序列進(jìn)行比對，找出各自缺失區(qū)域，分別設(shè)計(jì)特異性引物和探針，成功建立TaqMan熒光定量PCR方法和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，可以對PRRSV疫苗株JXA1-R和類NADC30毒株HNhx進(jìn)行鑒別檢測，且與其他豬病病毒無交叉反應(yīng)。使用此方法對人工感染仔豬臨床樣品進(jìn)行檢測，可以有效地檢測血清樣本。

此外，本試驗(yàn)對建立的TaqMan熒光定量PCR和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR 2種方法進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，2種熒光定量PCR方法都可以對PRRSV JXA1-R疫苗株和類NADC30毒株HNhx進(jìn)行鑒別檢測。TaqMan熒光定量PCR方法中熒光探針的加入使特異性增強(qiáng)，可以同時(shí)鑒別檢測JXA1-R疫苗株和類NADC30毒株HNhx，節(jié)省了時(shí)間。但可能由于特異性引物和探針均需針對Nsp2各基因序列缺失區(qū)域設(shè)計(jì)，探針的保守性及設(shè)計(jì)要求使得針對基因的設(shè)計(jì)范圍非常有限，其敏感性有所降低；而SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法只需考慮特異性引物的保守性及設(shè)計(jì)要求，針對基因的設(shè)計(jì)范圍相對較廣，進(jìn)行優(yōu)化后所建立的方法敏感度較高。

綜上，本研究成功建立了能夠有效區(qū)分PRRSV JXA1-R疫苗株和類NADC30毒株HNhx的2種熒光定量PCR方法，為PRRSV的鑒別檢測提供一定的技術(shù)參考。