HPLC-ECD 法同時測定海洛因急性中毒大鼠不同腦區(qū) 中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量＊

陳園園，李鋒，魏佳韻，李香豫，王丹， 燕瑾，王優(yōu)美，3，徐鵬，3**，狄斌**

（1.中國藥科大學(xué)，南京 210009； 2.國家禁毒委員會辦公室中國藥科大學(xué)禁毒關(guān)鍵 技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 3.毒品監(jiān)測管控與禁毒關(guān)鍵技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 公安部禁毒情報技術(shù)中心，北京 100193）

海洛因是濫用較早并且較為廣泛的毒品之一。據(jù)《2019 年全球毒品報告》稱，海洛因是南亞2016 年在10～75 歲人口中濫用最普遍的阿片類物質(zhì)。在美國，2016 年吸食海洛因的人口為90 萬，約占12 歲以上總?cè)丝诘?.3%[1]。每年因吸食海洛因而致死人數(shù)不容忽視，據(jù)美國疾病控制中心統(tǒng)計，在美國從2013 年以來每年因吸食海洛因致死的人數(shù)呈現(xiàn)增長的趨勢，并且在2017 年的致死人數(shù)達(dá)到了15 482[2]。因此加強(qiáng)對海洛因毒性的研究存在其必要性并且也可為對中毒患者的解救方法提供可能的新的研究方向。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的信息傳遞物質(zhì)，主要包括多巴胺（DA）、5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素等。盡管單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在藥物成癮過程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[3-4]，但值得注意的是，這類物質(zhì)在毒品中毒過程中的影響近年來已引起相關(guān)學(xué)者的關(guān)注。有研究表明長期吸食毒品會對腦內(nèi)不同腦區(qū)產(chǎn)生神經(jīng)損傷[5-6]，并且有多項(xiàng)研究表明在長期給予海洛因后，大鼠特定腦區(qū)的DA 含量在升高后會逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，其原因可能主要與神經(jīng)損傷有關(guān)[7-8]。有文獻(xiàn)稱阿片類物質(zhì)比興奮劑毒性更強(qiáng)，阿片類物質(zhì)如海洛因其毒性主要與腦內(nèi)DA 及其代謝物濃度有關(guān)[9]。而2016 年3 月，美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）發(fā)布了《藥品安全通訊》，內(nèi)容涉及多種阿片類鎮(zhèn)痛藥物與5-HT 毒性的關(guān)系[10]。

目前我國還沒有開展海洛因急性中毒與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)之間關(guān)系的研究。本文通過建立并應(yīng)用HPLC-ECD方法，首次對海洛因急性中毒大鼠伏隔核和紋狀體兩個腦區(qū)中的DA 和5-HT 含量同時進(jìn)行了定量分析研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

HPLC-ECD，Antec Scientific 公司（檢測器型號為DECADE Elite，自動進(jìn)樣器型號為AS 110，泵型號為AZURA P 6.1L）；3K15 型高速冷凍離心機(jī)（Sigma 公 司）；XS105DU 型電子分析天平（METTER-TOLEDO公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Merck 公司）。DA、5-HT標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma 公司）；磷酸氫二鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉（分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；辛烷磺酸鈉（色譜純，北京百威靈科技有限公 司）；高氯酸（分析純，天津市鑫源化工有限公司）；乙腈（色譜純，Merck 公司）；海洛因由公安部禁毒情報技術(shù)中心提供，純度為85%。

1.2 色譜條件

色譜柱：QUATTRO，C18反相色譜柱（2.1 mm× 150 mm, 3 μm）；流動相：磷酸二氫鈉-檸檬酸-辛烷磺酸鈉緩沖體系（90 mmol/L 二水合磷酸二氫鈉， 50 mmol/L 一水合檸檬酸，1.7 mmol/L 一水合辛烷磺酸鈉，0.05 mmol/L 二水合乙二胺四乙酸二鈉）∶乙腈（94 ∶6, V/V），使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜負(fù)壓濾過，并超聲脫氣20 分鐘；流動相流速為0.3 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl，柱溫為35 ℃；電化學(xué)檢測器工作電極為玻璃碳電極，參比電極為銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極，工作電壓為0.8 V，靈敏度為10 nA。

1.3 組織裂解提取液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

組織裂解提取液為0.10 mmol/L 高氯酸、0.20 mmol/L二水合乙二胺四乙酸二鈉、0.01%（W/V）L-半胱氨酸的混合水溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制用組織裂解提取液配制濃度為0.5 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置于-20 ℃冰箱中保存。使用時用組織裂解提取液將標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋至所需要的線性最大濃度，再逐級稀釋至所需濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

雄性ICR 小鼠，18～22 g；雄性Sprague-Dawley 大 鼠，體重280～360 g。均購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.5 通過上下法計算海洛因小鼠皮下給藥的半數(shù)致死量（LD50）

在AOT425 StatPgm 軟件的指示下進(jìn)行逐只給藥，根據(jù)每只小鼠的陽性（死）或者陰性（活）情況決定下一只小鼠的給藥劑量，最終通過對結(jié)果的計算得到小鼠皮下給藥海洛因的LD50及95%置信區(qū)間。

1.6 海洛因中毒大鼠不同腦區(qū)腦勻漿的制備

將小鼠皮下給藥所得的海洛因LD50數(shù)據(jù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物給藥換算表換算成大鼠皮下給藥海洛因的，設(shè)置生理鹽水對照組、1/2 大鼠LD50劑量海洛因組和大鼠LD50劑量海洛因組，每組6 只大鼠，皮下給藥1 小時后處死，大鼠處死后迅速斷頭，剝?nèi)∪X，擦去表面血跡后放置于-20 ℃冰箱冷凍，30 分鐘后取出，然后參照大鼠腦立體定位圖譜，冰臺上迅速分離紋狀體、伏隔核腦組織，分別精確稱重，每0.01 g 腦組織（濕重）加入1 ml 組織裂解提取液，冰浴下勻漿，高速冷凍離心機(jī)15 000 r/min 4 ℃離心20 分鐘，取上清液用 0.20 μm 濾膜過濾后進(jìn)行HPLC-ECD 檢測分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

通過AOT425 StatPgm 軟件計算得到小鼠皮下給藥海洛因的LD50以及95%置信區(qū)間。通過GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間通過單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行比較，P＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 專屬性

DA、5-HT 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖、腦勻漿樣品色譜圖分別見圖1-A 和圖1-B， 保留時間分別為7.358 和17.175 分鐘。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A）及大鼠腦組織勻漿樣本（B）色譜圖

2.2 線性范圍

由于腦組織樣本中本身含有所測物質(zhì)，故無空白樣本。本實(shí)驗(yàn)用組織裂解提取液將DA、5-HT 標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度，DA：0.5, 2, 8, 32, 64, 128 ng/ml；5-HT：0.5, 1, 2, 4, 8, 16 ng/ml。采用外標(biāo)法定量，以樣品峰面積（A）對濃度（C）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，以上物質(zhì)在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為：

DA：Y=0.582 63X-0.011 8 r2=0.999

5-HT：Y=0.643 79X-0.113 99 r2=0.999

2.3 檢測限和定量限

按3 倍信噪比計算最低檢測限；按10 倍信噪比計算最低定量限。DA 和5-HT 的最低檢測限均為0.2 ng/ml；最低定量限均為0.5 ng/ml。

2.4 精密度

配制低、中、高3 種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，同一天內(nèi)每個濃度連續(xù)進(jìn)樣5 次，計算峰面積的RSD，測得日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，計算峰面積的RSD，測得日間精密度[12]。日內(nèi)、日間精密度均小于5%，表明本方法精密度良好。結(jié)果見表1。

表1 DA、5-HT 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液日內(nèi)、 日間精密度（n=5）

2.5 準(zhǔn)確度

按0.01 g 腦組織（濕重）加入1.0 ml 組織裂解提取液的比例分別將10 只大鼠的伏隔核和紋狀體組織混合勻漿，作為回收率試驗(yàn)用樣品，然后不同組織勻漿液分別取出三份按照樣品處理方法操作后進(jìn)樣分析，求出兩種勻漿液中DA 和5-HT 的平均含量作為空白值，然后取同量上述勻漿液分別加入低、中、高3 種濃度的對照品溶液，每個濃度平分6 份，按照樣品處理方法操作后進(jìn)樣分析，將加入對照品溶液后測得的濃度減去空白值，與對照品比較計算伏隔核和紋狀體中DA 和5-HT 的回收率[13]。不同腦區(qū)DA 和5-HT 回收率均在80%～120%以內(nèi)，回收率良好。結(jié)果見表2。

2.6 穩(wěn)定性

樣品處理方法與加樣回收率實(shí)驗(yàn)相同，將處理好的樣品于4 ℃存放，于0、1、2 和4 天進(jìn)樣分析，得穩(wěn)定性結(jié)果。結(jié)果表明，處理好的樣品4 天內(nèi)于4 ℃存放，各組分含量無明顯降低，穩(wěn)定性良好。結(jié)果見 表3。

表表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 腦組織勻漿提取液4 天內(nèi)穩(wěn)定性結(jié)果（n=4）

2.7 小鼠及大鼠皮下給藥LD50 結(jié)果

由AOT425 StatPgm 軟件計算可得，通過皮下注射給藥方式的小鼠海洛因LD50為281 mg/kg，95%置信區(qū)間為231～300 mg/kg。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物給藥換算表換算得到大鼠皮下給藥海洛因LD50為197 mg/kg，取值為200 mg/kg，并取大鼠皮下給藥海洛因LD50劑量的1/2，即為100 mg/kg，根據(jù)此結(jié)果設(shè)置生理鹽水對照組、1/2 大鼠LD50劑量海洛因組和大鼠LD50劑量海洛 因組。

2.8 大鼠皮下給藥海洛因1 小時后不同腦區(qū)中DA和5-HT 含量變化

大鼠通過皮下注射給藥方給予不同劑量海洛因 1 小時后，伏隔核和紋狀體中的DA 和5-HT 含量產(chǎn)生了不同程度的變化。與生理鹽水組相比，大鼠伏隔核和紋狀體中DA 含量無論是給予大鼠海洛因LD50劑量，還是1/2 大鼠海洛因LD50劑量，在1 小時后都沒有顯著性差異，而5-HT 含量在給予兩個劑量海洛因 1 小時后，在伏隔核[F(2, 18)=31.59, P＜0.000 1]和紋狀體[F(2, 18) =17.65, P＜0.000 1]兩個腦區(qū)均發(fā)生了顯著性升高(P＜0.01, P＜0.001)，且呈劑量依賴性變化。結(jié)果見 表5。

表5 大鼠皮下給藥海洛因1 小時后不同腦區(qū)單胺類神經(jīng) 遞質(zhì)含量變化（n=6～9，±s）

表5 大鼠皮下給藥海洛因1 小時后不同腦區(qū)單胺類神經(jīng) 遞質(zhì)含量變化（n=6～9，±s）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與生理鹽水對比。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量/（ng/0.01 g）腦區(qū) 給藥劑量/（mg/kg）DA 5-HT生理鹽水 59.95±3.96 2.68±0.36 100 58.79±7.04 10.12±1.36**200 61.63±5.30 17.73±2.38***生理鹽水 70.28±7.21 1.53±0.24 100 111.60±16.82 12.08±2.50**200 94.20±16.99 18.34±3.45***伏隔核紋狀體

3 討論

海洛因的毒性通常與其作用機(jī)制有關(guān)。邱平明 等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)長期給予海洛因建立成癮模型的大鼠紋狀體中DA 含量沒有升高反而發(fā)生下降，其原因可能與長期給藥致使紋狀體發(fā)生功能損壞有關(guān)。同時有研究表明DA 對DA 能神經(jīng)元有毒性作用，其機(jī)制可能是由其自身氧化產(chǎn)生的自由基引起[16]，還有文獻(xiàn)稱阿片類物質(zhì)毒性與腦內(nèi)DA 及其代謝物濃度有關(guān)，它會促使DA 濃度升高后翻轉(zhuǎn)下降，引起細(xì)胞氧化損傷甚至死亡，其原因是DA 的代謝會產(chǎn)生過氧化氫（H2O2）并通過一系列反應(yīng)產(chǎn)生活性氧自由基，對細(xì)胞產(chǎn)生損害，DA 同時還會抑制線粒體的呼吸作用[9]。因此在長期給予海洛因后可能會使DA 含量一直處于較高水平而導(dǎo)致DA 能神經(jīng)較為密集的腦區(qū)產(chǎn)生一定程度的 損傷。

單次吸食海洛因過量致死的原因常常是呼吸抑 制[14]，其急性毒性與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的機(jī)制研究則較少。有研究表明海洛因可以較強(qiáng)地激動DA 能神經(jīng)，而5-HT能神經(jīng)只有大劑量作用下才會被激動[15]。5-HT 濃度過高常常會導(dǎo)致5-HT 毒性的產(chǎn)生，阿片類鎮(zhèn)痛藥物多因其能抑制5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體再攝取與5-HT 毒性相關(guān)[17]。

值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)：在海洛因單次急性給藥實(shí)驗(yàn)中，給藥1 小時后給藥組兩個腦區(qū)中的DA 含量與生理鹽水組相比較，均沒有顯著性差異，而5-HT 含量則有顯著性升高，且與給藥劑量呈正相關(guān)，其含量是生理鹽水組的4～20 倍，極可能產(chǎn)生了5-HT 毒性。因此在急性中毒劑量海洛因的作用下，海洛因毒性是否與此時產(chǎn)生的高濃度5-HT 毒性有關(guān)值得引起關(guān)注。

海洛因的中毒致死可能與DA 和5-HT 含量變化存在某些關(guān)聯(lián)，但是由于缺乏與海洛因相關(guān)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)毒性致死的文獻(xiàn)，且由于本實(shí)驗(yàn)只設(shè)定了給藥1 小時后這一個時間點(diǎn)以及未能進(jìn)行更有針對性的機(jī)制研究，該類神經(jīng)遞質(zhì)在阿片類物質(zhì)急性中毒中的具體毒性機(jī)制還有待于后續(xù)進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本文采用高效液相色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測器建立了準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定的同時測定大鼠不同腦區(qū)中DA和5-HT的實(shí)驗(yàn)方法，并對海洛因中毒大鼠伏隔核和紋狀體腦區(qū)中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化進(jìn)行了測定。首次發(fā)現(xiàn)海洛因急性中毒可劑量賴性的顯著升高大鼠伏隔核和紋狀體腦區(qū)內(nèi)的5-HT 水平，其急性毒性作用的主要靶點(diǎn)可能與大鼠腦內(nèi)的5-HT 系統(tǒng)有關(guān)。