初花期淹水脅迫對大豆葉片AsA-GSH循環(huán)的損傷及烯效唑的緩解效應(yīng)

王詩雅，鄭殿峰，項洪濤，馮乃杰，劉雅，劉美玲，靳丹，牟保民

初花期淹水脅迫對大豆葉片AsA-GSH循環(huán)的損傷及烯效唑的緩解效應(yīng)

1廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東湛江 524088；2黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江大慶 163319；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，哈爾濱 150086

大豆；淹水脅迫；AsA-GSH循環(huán)；葉片；烯效唑

0 引言

【研究意義】大豆（）是世界上最重要的豆科作物之一[1]，在黑龍江種植較為廣泛[2]。黑龍江省屬典型的雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)種植地區(qū)，是氣候變化敏感區(qū)和生態(tài)脆弱區(qū)，異常降雨頻率增加，農(nóng)田澇漬災(zāi)害多發(fā)，特別是7—8月正值大豆生殖生長期，對大豆生長發(fā)育構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3-4]。初花期（R1）是大豆的水分敏感期，也是最易受澇災(zāi)損傷的時期，研究R1期大豆?jié)碁?zāi)損傷機制并尋求解決方案，是一個重要的現(xiàn)實和科學(xué)問題，意義重大。澇漬脅迫會使作物處于缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致作物體內(nèi)活性氧的快速積累及膜脂過氧化程度加劇，抑制作物的株高、莖粗和生物量積累[5]。植物生長調(diào)節(jié)劑是一類人工合成并與植物激素相類似的活性物質(zhì)，可直接調(diào)控作物本身，使作物生長發(fā)育得到定向控制，在增強作物的抗逆能力方面效果顯著[6-8]。因此，研究淹水脅迫下噴施調(diào)節(jié)劑，對提高大豆的耐澇性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】正常情況下，植物體內(nèi)ROS水平在抗氧化酶的調(diào)節(jié)下維持在恒定水平，但在嚴(yán)重的逆境脅迫下，ROS的產(chǎn)生和清除機制將失去平衡，導(dǎo)致植物細(xì)胞受損[9-10]。抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)是植物體內(nèi)存在的一個重要抗氧化保護系統(tǒng)，AsA和GSH是2種重要的抗氧化劑，參與循環(huán)中的反應(yīng)，并與循環(huán)中的關(guān)鍵酶（APX、GR、MDHAR、DHAR）共同作用，可有效地清除逆境脅迫所產(chǎn)生的活性氧（ROS）和過氧化氫（H2O2）[11-12]。AsA-GSH循環(huán)作為重要的抗氧化代謝途徑之一，在許多逆境脅迫下，如鎘脅迫[13]、干旱脅迫[14]、鹽脅迫[15]等中得到驗證。但隨脅迫時間的延長，作物體內(nèi)的ROS清除劑能力下降，導(dǎo)致ROS代謝失調(diào)，ROS的過量積累導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化，致使細(xì)胞完整性喪失，影響葉片的正常生長[16]。目前，植物生長調(diào)節(jié)劑的理論研究及其在生產(chǎn)上的應(yīng)用越來越多，已成為作物優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效栽培中的一項重要技術(shù)措施[17]。在逆境脅迫下，噴施植物生長調(diào)節(jié)劑可有效緩解逆境對作物所造成的傷害，前人已對大豆[18]、綠豆[19]、蕓豆[20]和水稻[21]等作物進行了相關(guān)報道。植物生長調(diào)節(jié)劑包括促進型植物生長調(diào)節(jié)劑和延緩型植物生長調(diào)節(jié)劑等[22]，其中，延緩型植物生長調(diào)節(jié)劑烯效唑（uniconazole，S3307）被廣泛應(yīng)用[23]，S3307為三唑類植物生長調(diào)節(jié)劑，可提高植物在逆境脅迫下的抵抗能力，包括低氧[24]、高溫[25]、鹽脅迫[26]和干旱[27]等。項洪濤等[28]研究指出，葉面噴施S3307可通過降低MDA含量，提高保護酶活性等生理過程，抵御低溫脅迫對紅小豆造成的傷害。AHMED等[29]研究表明，S3307可提高植株內(nèi)SOD、POD等相關(guān)保護酶活性，減少MDA的生成量和積累量提高細(xì)胞膜透性，進而增強細(xì)胞膜對抗逆境的應(yīng)激防御能力。另有研究指出，S3307處理能夠有效緩解鹽脅迫對大豆葉片細(xì)胞膜的傷害[30]。目前，研究表明S3307可提高淹水脅迫下大豆體內(nèi)抗氧化酶SOD和POD活性，降低體內(nèi)膜脂過氧化物MDA含量，減少淹水脅迫對大豆造成的生理傷害[5]，但關(guān)于S3307緩解淹水脅迫下AsA-GSH循環(huán)損傷的研究尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】目前，淹水脅迫對作物AsA-GSH循環(huán)的影響研究較少，且關(guān)于S3307緩解大豆淹水傷害的研究更是鮮見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過探究R1淹水脅迫對耐澇性不同的2個大豆品種葉片內(nèi)活性氧和AsA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵酶和抗氧化劑含量的影響，以及噴施S3307后對其調(diào)控效應(yīng)，旨在揭示S3307增強大豆耐澇性的作用機理，以期為大豆的耐澇栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用大豆品種墾豐14和墾豐16為試驗材料，其中墾豐14為耐澇品種，墾豐16為澇漬敏感品種[5,31]。

供試生長調(diào)節(jié)劑選用烯效唑（S3307），由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物生長調(diào)節(jié)劑工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 試驗設(shè)計

于2019年在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心盆栽場進行盆栽試驗。選用帶有隔水層和排水口的樹脂花盆（上口徑×底徑×高= 32 cm×23 cm×31 cm），試驗用土按栽培土﹕腐殖土﹕沙子=7﹕2﹕1體積比例混合組成，每盆裝土18 kg。5月19日進行播種，每個品種設(shè)正常水分管理（CK）、淹水脅迫處理（W）和淹水脅迫+S3307處理（W+S），采用完全隨機區(qū)組設(shè)計。每盆播種10粒，子葉期定苗5株，具體設(shè)計見表1。待植株生長至R1期（播種后53 d），進行葉面噴施S3307（濃度為50 mg·L-1，噴施量為225 L·hm-2），并于噴藥后第5天（播種后58 d，淹水脅迫處理第0天，記作R1+5）進行淹水處理（套盆淹水，水淹沒土表面，高于土面2—3 cm為準(zhǔn)），淹水持續(xù)5 d（淹水第5天為播種后第63天，記作R1+10），淹水脅迫處理5 d后（播種后68 d，記作R1+15）放水恢復(fù)正常水分管理。處理期間，分別對R1+5、R1+10、R1+15 3個時間點進行取樣，各處理取樣后立即放入液氮中，而后置于-80℃冰箱中保存，供生理指標(biāo)測定。

表1 試驗設(shè)計方案

1.3 測定項目與方法

超氧陰離子產(chǎn)生速率（superoxide anion production rates，）采用羥胺氧化法[33-34]進行測定。取0.5 ml提取液，加入0.5 ml PBS（0.05 mol·L-1，pH 7.8），1 ml 10 mmol·L-1鹽酸羥胺溶液后搖勻，同時對照管以PBS代替樣品提取液；在25℃下保溫1 h，保溫后需加入2 ml乙醚萃取葉綠素；依次加入1ml 17 mmol·L-1對氨基苯磺酸，1ml 7 mmol·L-1a-萘胺，混合后渦旋，在25℃下保溫20 min后3 000×離心3 min，在530 nm下測定OD值。

過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）含量采用碘化鉀法[35]測定。取1 g植物樣品，加入0.5 mL的0.1% TCA，在液氮下研磨，研磨后所得勻漿以19 000×離心20 min。取上清液0.5 mL，加2 ml 1 mol·L-1KI溶液和0.5 ml 100 mmol·L-1硫酸鉀的緩沖液，暗反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后，以0.1%的TCA為參比，在390 nm下測定OD值。

1.3.2 AsA和DHA含量的測定 還原型抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和氧化型抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）采用Zhang等[36]方法測定。稱取1 g樣品置于研缽中，加入5 mL的5%的偏磷酸，在4℃下研磨，所得勻漿于8 000×離心15 min，收集上清液用于測定（AsA+DHA）和AsA的含量。取0.3 mL上清液，加入0.75 mL含5 mmol.L-1EDTA的磷酸緩沖液（150 mmol·L-1，pH 7.4）和0.15 mL 10 mmol·L-1的二硫蘇糖醇溶液（DTT）。室溫下放置10 min后，加入0.15 mL 0.5% N-乙基馬來酰亞胺以消除多余的DTT。加入0.6 mL的10%三氯乙酸（TCA）、0.6 mL的44%正磷酸溶液、0.6 mL的0.5% BP-乙醇溶液和0.15 mL的0.3%（W/V）FeCl3溶液?；靹蚝?0℃水浴40 min，測525 nm處AsA+DHA的OD值。AsA的測定過程中以0.3 mL水代替DTT和N-乙基馬來酰亞胺，其余操作步驟如上所述。DHA為AsA+DHA與AsA的差值。

1.3.3 GSH和GSSG含量的測定 還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（glutathiol，GSSG）含量測定采用二硫代硝基苯甲酸法[34,37]測定。取植物葉片1.0 g，加5 ml的5%偏磷酸溶液，在4℃下研磨，8 000 r/min離心25 min，上清液供測定，5℃保存。取樣品母液0.2 ml，加入150 mmol·L-1磷酸二氫鈉溶液（pH 7.7）2.6 ml，混勻后，加入0.2 ml DTNB溶液，在30℃保溫10 min，測定412 nm 下的OD值。GSSG的測定需要在反應(yīng)體系中加入0.1 mmol·L-12-乙烯吡啶，在27℃反應(yīng)1 h，計算GSSG的含量。

1.3.4 APX、GR、MDHAR和DHAR活性的測定 過氧化氫酶（aseorbateperoxidase，APX）參考高俊鳳[34]的測定方法。稱取0.5 g樣品，分3次加入10 ml 50 mmol·L-1預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH 7.8），在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，在4℃、12 000×下離心20 min，上清夜即為APX粗提液。以3 ml體系測定，取0.10 ml酶液，加入2.60 ml含0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉的PBS（0.05 mol·L-1，pH 7.0），再加入0.15 ml 5 mmol·L-1的AsA，最后加入0.15 ml 20 mmol·L-1H2O2，立即在20℃下測定290 nm下每30 sOD值的變化。

谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）根據(jù)ZHU等[38]和Wheeler等[39]方法測定，稱取0.2 g樣品，分3次加入1.6 ml（0.6、0.5、0.5 ml）50 mmol·L-1預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH 7.8），在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，在4℃、12 000×下離心20 min，上清液即為GR粗提液。取樣品上清液0.1 ml，放入試管中，加入Hepes 1.7 ml，NADPH 0.1 μl及GSSG 0.1 μl，在340 nm下測定OD值。

(3)礦山企業(yè)規(guī)模越大，工業(yè)總產(chǎn)值越高。2017年河北省持證礦山企業(yè)大型、中型、小型及小礦工業(yè)總產(chǎn)值依次為379.23億元、130.34億元、36.37億元及3.62億元。數(shù)據(jù)顯示礦山企業(yè)規(guī)模越大、工業(yè)總產(chǎn)值越高。

脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbatereductase，DHAR）根據(jù)Murshed等[40]的方法測定。稱取0.8 g植株樣品，在50 mmol·L-1，pH7.5的磷酸緩沖液中研磨成勻漿，定容至8 ml，4℃、12 000×下離心20 min，提取上清液。3 ml的反應(yīng)體系含有100 mmol·L-1Hepes-KOH（pH 7.0）、2.5 mmol·L-1H2O2、0.5 mmol·L-1AsA及0.05 ml酶提取液，測定290 nm處OD值的變化。

APX、GR、DHAR酶活性（U·g-1·min-1）=（△340×0）/（0.01×1××FW）。其中，△340為時間內(nèi)吸光值變化的代數(shù)和，0表示酶提取液體積，1表示測定時酶液體積，表示為測定變化時間，F(xiàn)W表示樣品鮮重。以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活性單位（U）。

單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）采用試劑盒法（Solarbio公司）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013進行數(shù)據(jù)錄入及整理、用SPSS 25和Origin 2018進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及制圖。

2 結(jié)果

2.1 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片膜脂過氧化程度的影響

R1+5 時，W+S處理有效降低了墾豐14和墾豐16葉片中MDA含量，但與CK相比未達顯著差異水平。R1+10 時，W處理的2個大豆品種葉片MDA含量與CK相比顯著增加，其中，墾豐14增加60.48%，墾豐16增加70.09%；與W處理相比，W+S處理顯著降低了2個大豆品種葉片內(nèi)MDA含量，其中墾豐14降低4.57%，墾豐16降低32.79%?；謴?fù)正常水分后（R1+15），2個品種W處理的MDA含量有所降低，但仍顯著高于CK；W+S處理后2個品種大豆葉片恢復(fù)能力快于W處理，其中墾豐16 W+S處理恢復(fù)至CK水平，說明葉面噴施S3307能夠緩解活性氧對膜脂過氧化程度的損傷，在淹水脅迫下效果顯著（圖1）。

2.2 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

R1+5時，S3307噴施抑制了2個大豆品種葉片內(nèi)產(chǎn)生速率和H2O2含量的積累，其中，墾豐14分別較CK顯著降低10.21%和4.35%，墾豐16較CK顯著降低9.36%和6.04%（圖2）。R1+10 時，2個大豆品種葉片中產(chǎn)生速率和H2O2含量上升趨勢一致，淹水脅迫顯著增加了2個大豆品種葉片內(nèi)產(chǎn)生速率和H2O2含量；S3307噴施可有效抑制2個大豆品種葉片內(nèi)產(chǎn)生速率和H2O2含量的積累，其中，墾豐14較W處理顯著降低6.48%和3.65%，墾豐16較W處理顯著降低18.78%和2.46%?；謴?fù)正常水分后（R1+15），2個品種W處理的產(chǎn)生速率和H2O2含量明顯降低，但仍顯著高于CK，S3307可進一步緩解產(chǎn)生速率和H2O2含量的積累，且墾豐14的降幅大于墾豐16，說明耐澇品種受淹水脅迫造成的傷害小于澇漬敏感品種，S3307對維持淹水脅迫條件下ROS代謝平衡具有積極作用（圖2）。

不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。下同Different small letters indicate significantly different at 0.05 probability level. The same as below

2.3 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片AsA和DHA含量的影響

R1+5時，墾豐14和墾豐16 W+S處理與各自對照CK相比，提高了2個大豆品種葉片內(nèi)AsA、DHA和AsA+DHA含量。R1+10時，墾豐14和墾豐16各處理葉片的AsA、DHA和AsA+DHA含量均表現(xiàn)為W+S＞W(wǎng)＞CK，且差異達到顯著水平?；謴?fù)正常水分后（R1+15），墾豐14和墾豐16各處理與R1+10時相比呈相反變化趨勢，但墾豐14和墾豐16 AsA、DHA和AsA+DHA含量高低順序與R1+10時相同，且各處理之間達差異顯著水平。說明S3307可促進淹水脅迫下葉片內(nèi)AsA、DHA和AsA+DHA含量的增加，并在恢復(fù)正常水分處理后延緩其含量的降低，以緩解淹水造成的傷害（圖3）。

2.4 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片GSH和GSSG含量的影響

R1+5時，墾豐14 W+S處理葉片內(nèi)的GSH、GSSG和GSH＋GSSG含量顯著高于CK，分別較CK增加6.23%、7.80%和6.70%；墾豐16 W+S處理分別較CK增加8.65%、1.24%和6.05%，差異顯著。R1+10時，墾豐14和墾豐16葉片內(nèi)GSH、GSSG和GSH+GSSG含量的趨勢表現(xiàn)為W+S＞W(wǎng)＞CK，方差分析表明各處理之間差異顯著，說明S3307在淹水脅迫下可顯著提高葉片內(nèi)GSH、GSSG和GSH+GSSG含量?；謴?fù)正常水分后（R1+15），墾豐14和墾豐16 W和W+S處理的GSH、GSSG和GSH+GSSG含量迅速降低，但2個處理上述指標(biāo)含量高低與R1+10時趨勢相同，說明葉面噴施S3307具有延緩淹水脅迫下大豆葉片內(nèi)GSH、GSSG和GSH+GSSG含量減少的作用（圖4）。

2.5 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片關(guān)鍵酶活性的影響

圖2 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

圖3 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片AsA、DHA和AsA+DHA含量的影響

圖4 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片GSH、GSSG和GSH+GSSG含量的影響

圖5 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片APX活性的影響

2.5.2 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片GR活性的影響 R1+5時，W+S處理可提高墾豐14和墾豐16葉片內(nèi)GR活性，與2個品種CK相比分別增加5.39%和1.43%，但均未達顯著差異水平。R1+10時，墾豐14和墾豐16各處理之間趨勢表現(xiàn)為W+S＞W(wǎng)＞CK，淹水脅迫提高了2個品種葉片內(nèi)GR活性，葉面噴施S3307后可進一步促進2個品種葉片內(nèi)GR活性的提高，緩解大豆在淹水脅迫下所受到的傷害。R1+15時，墾豐14和墾豐16各處理之間高低趨勢與R1+10時相同，說明淹水脅迫下噴施S3307具有延緩大豆葉片內(nèi)GR活性降低的作用（圖6）。

2.5.3 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片MDHAR活性的影響 R1+5時，W+S處理略提高墾豐14和墾豐16葉片內(nèi)MDHAR活性，但與2個品種CK相比未達顯著差異水平。R1+10時，墾豐14和墾豐16各處理之間MDHAR活性高低趨勢均表現(xiàn)為W+S＞W(wǎng)＞CK，說明淹水脅迫提高了大豆葉片內(nèi)MDHAR活性，噴施S3307后進一步提高了MDHAR活性。恢復(fù)正常水分后（R1+15），2個品種W處理MDHAR活性均呈降低趨勢，但仍顯著高于CK，W+S處理的2個品種MDHAR活性雖有降低，但仍維持較高水平，說明S3307可延緩MDHAR活性的降低，減緩淹水脅迫對大豆所造成的傷害（圖7）。

2.5.4 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片DHAR活性的影響 R1+5時，S3307噴施可提高墾豐14和墾豐16葉片內(nèi)DHAR活性，但與CK相比無顯著性差異。R1+10時，墾豐14和墾豐16葉片內(nèi)DHAR活性高低趨勢均表現(xiàn)W+S＞W(wǎng)＞CK，說明淹水脅迫提高了大豆葉片體內(nèi)DHAR活性，噴施S3307后可進一步提高DHAR活性?；謴?fù)正常水分后（R1+15），墾豐14和墾豐16 W處理和W+S處理葉片內(nèi)DHAR活性雖有降低，但高低趨勢與R1+10時相同，W+S處理雖有降低，但顯著高于W處理和CK，說明S3307具有延緩DHAR活性降低的作用，有利于增強清除活性氧的能力（圖8）。

圖6 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片GR活性的影響

圖7 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片MDHAR活性的影響

圖8 烯效唑?qū)1期淹水脅迫下大豆葉片DHAR活性的影響

2.6 R1期淹水脅迫對大豆葉片AsA-GSH的損傷及S3307的緩解效應(yīng)

淹水脅迫導(dǎo)致產(chǎn)生速率的增加，隨后被歧化為H2O2，和H2O2含量的增加會改變膜的流動性，形成MDA等膜脂過氧化物。AsA-GSH可有效清除淹水脅迫積累的ROS。AsA可被APX催化與H2O2反應(yīng)生成MDAHAR，MDHAR可協(xié)同APX清除H2O2，使H2O2分解為H2O和O2。DHAR是存在于AsA和DHA之間的關(guān)鍵酶，在GSH和NADH存在的條件下催化DHA轉(zhuǎn)化為AsA。GSH具有清除的作用，可被DHAR氧化生成GSSG。淹水脅迫增加了AsA、GSH、DHA、GSSG含量，并提高了關(guān)鍵酶（APX、GR、DHAR、MDHAR）的活性，S3307處理后可進一步增加上述指標(biāo)的活性，并有效抑制了ROS和積累和MDA含量的增加，進而起到提高大豆耐澇性的作用（圖9）。

3 討論

淹水脅迫會對植物生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響，且表現(xiàn)為淹水時間越長傷害作用越高的趨勢。初花期（R1）是大豆?fàn)I養(yǎng)生長和生殖生長并進的時期，在R1期，大豆受到淹水脅迫，會嚴(yán)重抑制植株的生長發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量降低[41]。烯效唑是重要的外源控長調(diào)節(jié)劑，通過浸種[42]、葉噴等方式[21]，均可提高作物的抗逆性。研究表明，烯效唑可通過提高抗氧化酶含量，清除過多活性氧，保持較高的抗氧化劑含量，增強作物抗氧化能力，減輕膜脂過氧化程度，緩解逆境脅迫對植物造成的傷害[43-45]。

紅色箭頭表示R1期淹水脅迫對各指標(biāo)的影響（增加或減少）；綠色箭頭表示R1期淹水脅迫下S3307處理對各指標(biāo)的影響（增加或減少）

3.1 R1期淹水脅迫及S3307處理對大豆膜脂過氧化程度的影響

MDA是植物細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量是衡量植物細(xì)胞膜脂過氧化程度和質(zhì)膜損傷的重要指標(biāo)[46]。葉片內(nèi)MDA含量的增加，會導(dǎo)致表面細(xì)胞膜受害程度加大，MDA可與膜上酶和蛋白質(zhì)等結(jié)合，使細(xì)胞失活，從而破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞的物質(zhì)代謝[47]。本試驗結(jié)果表明，淹水脅迫下墾豐14和墾豐16 2個品種大豆葉片MDA含量增加，加劇膜脂過氧化和細(xì)胞膜破壞程度，且澇漬敏感品種墾豐16受到破壞程度大于耐澇品種墾豐14，說明耐澇品種承受淹水脅迫能力更強，這與張洪鵬等[48]研究結(jié)果一致。于奇等[49]研究表明，在淹水脅迫下應(yīng)用S3307處理可降低R1期綠豆葉片MDA含量，緩解淹水脅迫對綠豆葉片細(xì)胞膜的傷害。項洪濤等[28]研究指出，S3307能夠影響植物體內(nèi)自由基和△-二氫吡咯-5-羧酸合成酶的合成，自由基作用于膜脂過氧化合成，最終產(chǎn)物是MDA，S3307處理可抑制自由基的合成，并降低MDA含量，提高作物的耐寒性。本試驗研究結(jié)果表明，淹水脅迫條件下，S3307處理后，降低了2個大豆品種葉片內(nèi)MDA含量，減輕了淹水脅迫下膜脂過氧化程度對大豆葉片造成的傷害，保證大豆在淹水脅迫下正常生長發(fā)育。

3.2 R1期淹水脅迫及S3307處理對大豆活性氧代謝的影響

一般來說，植物在正常條件下生長，可通過自身產(chǎn)生的酶促和非酶促氧化防御體系來抵抗過量的ROS積累，促進植物正常生長，而淹水脅迫會抑制作物的正常生長，使植物體內(nèi)相對平穩(wěn)的活性氧遭到淹水脅迫的破壞，進而導(dǎo)致超氧陰離子（）和過氧化氫（H2O2）的增生。過多的活性氧自由基不能被及時清除，會加快膜脂過氧化進程，降低膜系統(tǒng)的完整性，損傷蛋白質(zhì)，最終導(dǎo)致植物體內(nèi)生理生化代謝紊亂，抑制植物生長發(fā)育[50]。本研究得出，R1期淹水脅迫顯著增加2個大豆品種葉片中產(chǎn)生速率和H2O2含量，與各自CK相比，R1期淹水脅迫5 d時（R1+10），墾豐14增加了1.60倍和1.30倍，墾豐16增加了1.28倍和1.16倍。研究指出，外施S3307可提高作物在逆境脅迫下的耐受性，原因可能是S3307可幫助降低由ROS過度積累引起的膜損傷[5,28-29]。本試驗研究表明，S3307可有效減少淹水脅迫下2個大豆品種葉片內(nèi)產(chǎn)生速率和H2O2含量的積累，說明S3307對維持ROS平衡具有積極作用。

3.3 R1期淹水脅迫及S3307處理對大豆AsA-GSH循環(huán)的影響

AsA-GSH循環(huán)參與植物脅迫反應(yīng)，其中，AsA和GSH是循環(huán)中重要的抗氧化物質(zhì)，是清除自由氧系統(tǒng)的重要組成物質(zhì)，可有效清除H2O2和ROS[50]。APX、GR、MDHAR、DHAR是AsA-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶，和其他抗氧化物質(zhì)共同作用清除ROS，使ROS保持平衡，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[51]。吳秀等[52]研究表明，APX和DHAR是AsA-GSH循環(huán)中活性最強的2個關(guān)鍵酶，其活性會直接影響AsA和DHA含量。APX在清除H2O2時，先將H2O2還原成H2O，從而清除H2O2，并伴隨MDHAR的產(chǎn)生，MDHAR會氧化成DHA，當(dāng)MDHAR和DHAR共同存在時，DHAR將利用GSH還原DHA，并有MDHAR和DHA重新生成AsA，AsA可直接參與清除[53]，而GSH在反應(yīng)過程中被氧化成GSSG，再通過GR氧化NADPH重新還原產(chǎn)生[54-55]。前人研究指出，GSH在植物脅迫抵抗中的主要作用是保持較高的含量，促進膜蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此，GSH和GR活性水平被認(rèn)為是機體抗氧化狀態(tài)的重要標(biāo)志[56]，同時GR活性可直接影響GSH含量，GR活性上升是造成GSH含量增加的一個因素之一[57]。顧帆等[58]在對高溫和干旱脅迫對黃薇抗氧化系統(tǒng)的影響中研究表明，APX是循環(huán)中主要的清除酶類，其余的酶則維持循環(huán)內(nèi)的平衡，保證活性氧的清除能力。

本試驗結(jié)果表明，墾豐14和墾豐16 APX、GR、MDHAR、DHAR活性在淹水脅迫第5天（R1+10）時顯著增加，表明在淹水脅迫下，抗氧化酶活性急劇增加，這可能是大豆為適應(yīng)淹水脅迫所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，葉面噴施S3307后可進一步促進APX、GR、MDHAR、DHAR活性的提高，且耐澇品種的酶活性高于澇漬敏感品種，這說明S3307能快速激活A(yù)sA-GSH中關(guān)鍵酶活性，保持AsA和GSH含量在較高水平，及時清除脅迫產(chǎn)生的H2O2和，促進AsA-GSH循環(huán)的運轉(zhuǎn)?；謴?fù)正常水分后（R1+15），淹水脅迫解除，抗氧化酶活性降低，耐澇品種較澇漬敏感品種恢復(fù)能力快，復(fù)水后可逐漸恢復(fù)至正常水平。另外，AsA、DHA、GSH和GSSG含量變化是可反映淹水脅迫下植物變化特征的重要指標(biāo)。郭欣欣等[50]指出，淹水脅迫下，植物體內(nèi)較高含量的抗氧化劑含量（AsA和GSH）和氧化還原力（DHA和GSSG）可保護細(xì)胞膜免受傷害，確保植物具有較強的抗逆能力，與本試驗結(jié)果一致。淹水脅迫5 d（R1+10）時促進了墾豐14和墾豐16 W抗氧化劑含量（AsA和GSH）和氧化還原力（DHA和GSSG）的增加，且S3307處理可進一步促進上述指標(biāo)含量的增加，說明S3307可清除淹水脅迫下大豆植株體內(nèi)堆積的大量膜脂過氧化物，加強植株抵御逆境脅迫的性能和自身修復(fù)機制，恢復(fù)正常水分后（R1+15），S3307處理可保持較高的抗氧化劑含量，有助于快速恢復(fù)至正常生理狀態(tài)。上述指標(biāo)耐澇品種的含量均高于澇漬敏感品種，表明耐澇性強品種受到的傷害要小于澇漬敏感品種，S3307可有效防止大豆在淹水脅迫下細(xì)胞膜受損，提高耐澇性。

4 結(jié)論

淹水脅迫導(dǎo)致大豆葉片內(nèi)ROS代謝紊亂，膜脂過氧化程度提高，噴施S3307可使淹水脅迫下ASA和GSH維持較高含量，提高關(guān)鍵酶活性，保證ASA-GSH循環(huán)的正常運行，并維持恢復(fù)正常水分管理后關(guān)鍵酶和抗氧化劑含量，提高大豆抗氧化能力，減輕膜脂過氧化程度，進而增加大豆的耐澇性。耐澇品種墾豐14受淹水脅迫造成的傷害程度低于澇漬敏感品種墾豐16。

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Damage of AsA-GSH Cycle of Soybean Leaves Under Waterlogging Stress at Initial Flowing Stage and the Mitigation effect of Uniconazole

1College of Coastal Agricultural Sciences, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, Guangdong;2College of Agriculture, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang;3Institute of Crop Cultivation and Tillage, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086

【】The aim of this study was to investigate effects of waterlogging stress on the ascorbate-glutathione (AsA-GSH) cycle of soybean leaves and the regulating effect of uniconazole (S3307) during initial flowering stage (R1), so as to provide a theoretical basis for improving soybean waterlogging resistance and the application of uniconazole.【】This study was conducted in the pot plant of the National Coarse Grain Engineering Technology Research Center of Bayi Agricultural University in Heilongjiang in 2019. The water-tolerant variety KenFeng 14 and the waterlogging-sensitive variety KenFeng 16 were used as test materials for pot planting experiments. The leaves were sprayed with S3307 (concentration 50 mg·L-1, appropriate spray amount 225 L·hm-2). After spraying S3307 for 5 days, the waterlogging stress treatment was started after 0 d (R1+5) and 5 d (R1+10) and normal water treatment for 5 days (R1+15) after sampling, respectively, and the various physiological indicators were measured by using spectrophotometer to study the degree of membrane lipid peroxidation (MDA) of soybean leaves under waterlogging stress. The effects of reactive oxygen species (ROS) and non-enzymatic antioxidants (AsA, DHA, GSH, and GSSG) and key enzymes (APX, GR, MDHAR, and DHAR) in the AsA-GSH circulatory system and the mitigating effects of S3307 were analyzed. 【】In the R1 stage after R1+5 of waterlogging stress, compared with CK, the S3307 treatment reduced the MDA,production rate and H2O2content, and also increased the content of non-enzyme antioxidants and key enzymes in the AsA-GSH cycle to maintain ROS balance, thus promoted the growth and development of two soybean varieties. At R1+10, W treatment significantly increased the MDA content in the leaves of the two soybean varieties, which were significantly increased by 40.02% and 37.53% higher than that of CK, respectively, and accelerated ROS (and H2O2); theproduction rate of the two varieties under waterlogging stress was significantly increased by 60.29% and 27.77%, compared with CK, respectively; The H2O2content was significantly increased by 49.45% and 43.40% compared with CK, respectively; The waterlogging sensitive variety KenFeng 16 suffered more damage than the waterlogging resistant variety KenFeng 14, and at the same time, under the waterlogging stress, the antioxidant substances and key enzyme activities in the leaves of both soybean varieties were increased to adapt to the waterlogging stress response from stress. After S3307 treatment, W+S treatment could further increase antioxidant substances (AsA, GSH), redox substances (DHA, GSSG), total ascorbic acid (AsA + DHA) and total glutathione (GSH +GSSG) content under waterlogging stress.content, and increase the activity of antioxidant enzymes (APX, GR, MDHAR, DHAR), reduce the MDA content of the leaves, inhibit the accumulation of ROS, and reduce the damage caused by waterlogging stress to the membrane system. After returning to normal water treatment for 5d (R1 + 15), the above indexes of two soybean varieties W treatment were reduced, but W+S treatment could maintain the two soybean leaves. The higher antioxidant enzyme activity and antioxidant substance content accelerated the removal of excessive accumulation of MDA and ROS, promoted the AsA-GSH cycle operation in soybean leaves under waterlogging stress, and then promoted the return of the two soybean varieties to normal state.【】Waterlogging stress had different degrees of influence on membrane lipid peroxidation, ROS accumulation, and key enzyme activities and non-enzyme antioxidants in the AsA-GSH cycle of soybean leaves. Spraying S3307 could improve key enzyme activity at some extent to promote oxidation ability, so as to reduce the harm caused by waterlogging stress.

soybean; waterlogging stress; AsA-GSH cycle; leaves; uniconazole

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.02.004

2020-03-14；

2020-05-12

國家自然科學(xué)基金面上項目（31871576）、國家“十三五”重點研發(fā)計劃（2019YFD1002205）

王詩雅，E-mail：wsy1106ok@126.com。通信作者鄭殿峰，E-mail：zdffnj@163.com。通信作者馮乃杰，E-mail：byndfnj@126.com

（責(zé)任編輯 楊鑫浩）