再生障礙性貧血患兒骨髓T-bet、GATA3蛋白和外周血細(xì)胞因子表達(dá)及意義

柯福彬，Anil Kumar Yadav，謝曉恬，喬曉紅

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，上海 200065)

獲得性再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA，簡(jiǎn)稱再障)由多種病因引起的機(jī)體造血功能障礙，以骨髓造血干細(xì)胞數(shù)量減少、骨髓造血組織脂肪化和外周血全血細(xì)胞減少為特征的血液系統(tǒng)疾病。其發(fā)病機(jī)制目前尚未十分清楚，近年來多數(shù)學(xué)者認(rèn)為獲得性AA的主要發(fā)病機(jī)制為機(jī)體中T細(xì)胞免疫異?；罨瘜?dǎo)致骨髓造血功能衰竭，可能原因與機(jī)體T淋巴細(xì)胞功能異常激活，產(chǎn)生抑制性造血細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ等抑制骨髓造血干細(xì)胞的增殖分化[1]。人體T細(xì)胞亞群如TH1，TH2，Treg等分泌各種細(xì)胞因子，IL-2、IFN-γ、IL-4等調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，抑制性的細(xì)胞因子表達(dá)增加可抑制機(jī)體的造血功能。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者較為關(guān)注調(diào)節(jié)TH1、TH2細(xì)胞平衡的轉(zhuǎn)錄因子T-bet及GATA3。Solomou等[2]研究發(fā)現(xiàn)在獲得性AA患兒外周T淋巴細(xì)胞中T-bet表達(dá)上調(diào)。而在獲得性AA患兒骨髓T-bet，GATA3的表達(dá)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究檢測(cè)獲得性AA患兒骨髓組織中促使Th細(xì)胞分化為TH1、TH2細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子T-bet，GATA3蛋白的表達(dá)變化，同時(shí)分析其外周血細(xì)胞因子水平，進(jìn)一步闡明獲得性AA的免疫病理機(jī)制，為獲得性AA科學(xué)研究以及臨床醫(yī)師治療獲得性AA決策提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科2005年8月—2018年8月保存完整的獲得性AA患兒骨髓活檢石蠟標(biāo)本49例，該標(biāo)本均為既往滿足臨床診斷后剩余的科學(xué)保存的石蠟標(biāo)本。獲得性AA患兒診斷與臨床分型參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)的診療建議[3]，臨床表現(xiàn)為外周血細(xì)胞減少，骨髓涂片和活檢等顯示造血功能降低，且除外低增生性白血病和骨髓異常增生綜合征等其他可導(dǎo)致外周血三系下降的疾病。重型為中性粒細(xì)胞<0.5×109/L、網(wǎng)織紅細(xì)胞<20×109/L、血小板<20×109/L，上述3項(xiàng)中滿足2項(xiàng)；若中性粒細(xì)胞<0.2×109/L則為極重型。非重型組25例，重型和極重型組24例。男性患兒27例，女性患兒22例，中位年齡8歲(4～10歲)。本研究獲得上海市同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KYSB-2015-35)。

1.2 主要試劑

T-bet單克隆抗體與GATA3單克隆抗體由美國(guó)ABCAM公司生產(chǎn)，組化試劑盒DAB顯色劑由丹麥DAKO公司生產(chǎn)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

(1) 石蠟切片脫蠟至水；(2) 抗原修復(fù)；(3) 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；(4) 血清封閉；(5) 加入一抗:在切片上滴加PBS按一定比例(預(yù)實(shí)驗(yàn)約為1∶200)配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)，4℃孵育過夜；(6) 加入二抗:圈內(nèi)滴加二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織，室溫孵育；(7) DAB顯色:玻片置于PBS(pH=7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液；(8) 復(fù)染細(xì)胞核:Harris蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，氨水返藍(lán)；(9) 脫水封片；(10) 切片掃描錄入，圖像采集分析。

1.4 平均光密度值(average optical density,AOD)測(cè)定

切片使用數(shù)字切片全景掃描儀器進(jìn)行掃描錄入，隨機(jī)選取切片全景圖3處，進(jìn)行放大400倍后采集圖像，T-bet，GATA3陽(yáng)性表達(dá)圖片顯示為棕黃色。使用圖像分析軟件IPP6.0對(duì)所采集圖像進(jìn)行平均光密度AOD值的測(cè)定，AOD值與T-bet，GATA3表達(dá)正相關(guān)，3次測(cè)定結(jié)果取平均值。

1.5 患兒外周血細(xì)胞因子水平測(cè)定

采取無發(fā)熱的獲得性AA患兒清晨空腹外周血，離心(離心半徑12.5cm，3000r/min，10min)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定IL-2、IL-4、IFN-γ水平，測(cè)定時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，試劑盒由上海瓦蘭生物有限公司提供。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組獲得性AA患兒基線情況

兩組患兒年齡、性別、外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、血小板情況如表1所示。

表1 兩組獲得性AA患兒基線情況與單因素分析Tab.1 Baseline and univariate analysis of two groups of children with aplastic anemia

2.2 兩組患兒骨髓病理表現(xiàn)

相較與非重型獲得性AA患兒，在重型獲得性AA患兒骨髓的H-E染色中造血細(xì)胞下降更明顯，脂肪組織等非造血組織形成空泡更多，見圖1。

圖1 不同程度獲得性AA患兒骨髓H-E染色(×200)Fig.1 H-E staining of bone marrow in children with different degrees of acquired aplastic anemia(×200)A:非重型獲得性AA患兒骨髓H-E染色；B:重型獲得性AA患兒骨髓H-E染色

2.3 T-bet、GATA3蛋白在獲得性AA患兒骨髓表達(dá)

T-bet蛋白在獲得性AA患兒骨髓中多呈棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，T-bet在重型與極重型組較非重型組陽(yáng)性表達(dá)顯著增多，見圖2A、B。GATA3在兩組獲得性AA患兒未見明顯陽(yáng)性表達(dá)，見圖2C、D和表2。

表2 獲得性AA患兒骨髓T-bet、GATA3蛋白表達(dá)比較Tab.2 Comparison of T-bet and GATA3 protein expression in bone marrow of children with aplastic anemia

圖2 T-bet、GATA3蛋白在不同程度獲得性AA患兒骨髓表達(dá)Fig.2 Expression of T-bet and GATA3 protein in bone marrow of children with different degrees of acquired aplastic anemiaA:非重型獲得性AA患兒骨髓T-bet表達(dá)(×400)；B:重型獲得性AA患兒骨髓T-bet表達(dá)(×400)；C:非重型獲得性AA患兒骨髓GATA3表達(dá)(×400)；D:重型獲得性AA患兒骨髓GATA3表達(dá)(×400)

2.4 兩組獲得性AA患兒治療前外周血細(xì)胞因子水平比較

不同程度病情獲得性AA患兒IL-2，IL-4，IFN-γ表達(dá)比較，IL-2及IFN-γ在重型與極重型組顯著高于非重型組(P=0.000，P=0.007)，IL-4兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.289)，見表3。

表3 兩組獲得性AA患兒治療前細(xì)胞因子水平比較Tab.3 Comparison of cytokine levels between two groups of children with AA before treatment

3 討 論

我國(guó)屬于獲得性AA高發(fā)地區(qū)，年發(fā)病率為7.4/100萬[4-5]。獲得性AA的自然病程長(zhǎng)、治療周期長(zhǎng)，預(yù)計(jì)我國(guó)兒童獲得性AA的現(xiàn)患率并不低于白血病，且多為重型獲得性AA[6]。獲得性AA嚴(yán)重威脅我國(guó)兒童的生命健康，重型獲得性AA常因外周血下降導(dǎo)致嚴(yán)重感染或顱內(nèi)出血而引起死亡。應(yīng)用免疫抑制治療獲得性AA可使部分患兒病情緩解，免疫抑制治療的有效性也進(jìn)一步提示獲得性AA的發(fā)病機(jī)制主要為機(jī)體免疫異常所致。

獲得性AA涉及免疫紊亂可能為人體T淋巴細(xì)胞的異常激活，導(dǎo)致人體骨髓造血微環(huán)境的紊亂，進(jìn)而影響造血干細(xì)胞增殖與分化[6-7]。獲得性AA主要發(fā)病機(jī)制涉及Th1/Th2細(xì)胞比例失衡。Th1及Th2細(xì)胞分化階段受不同抗原-抗原受體、共刺激信號(hào)分子等多種因素共同作用，而T-bet、GATA3蛋白在T細(xì)胞亞群分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能[8-9]。

T-bet蛋白是Th1分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，T-bet功能結(jié)構(gòu)域有與IFN-γ等造血抑制性細(xì)胞因子結(jié)合的能力。機(jī)體的T-bet不僅表達(dá)在Th1細(xì)胞，IFN-γ誘導(dǎo)下也可使NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表達(dá)[10]。Solomou等[2]發(fā)現(xiàn)獲得性AA患兒Itk激酶表達(dá)水平增加可刺激機(jī)體T-bet表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促使IFN-γ基因的主動(dòng)轉(zhuǎn)錄。IFN-γ等抑制性細(xì)胞因子通過Fas通路、半胱天冬酶和相關(guān)促凋亡基因的上調(diào)降低造血基因的表達(dá)，上調(diào)IFN-γ基因增強(qiáng)小鼠凋亡基因表達(dá)及活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞，增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞破壞[11-12]。既往研究顯示可通過免疫調(diào)節(jié)劑OCH調(diào)節(jié)NKT細(xì)胞改善免疫機(jī)制介導(dǎo)骨髓衰竭模型小鼠Th1/Th2的失衡，促使Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化而改善骨髓衰竭，同時(shí)檢測(cè)到骨髓中T-bet表達(dá)的改變[13]。

與T-bet相對(duì)的GATA3是GATA家族成員中的一種鋅指蛋白[14]。在外界環(huán)境刺激或外源性IL-4等誘導(dǎo)分化體系中能通過STAT通路促使Th細(xì)胞向著Th2方向分化且檢測(cè)到Th細(xì)胞胞內(nèi)GATA3的mRNA表達(dá)水平明顯增加[15]。Ouyang等[16]發(fā)現(xiàn)利用反轉(zhuǎn)錄病毒將GATA3的DNA轉(zhuǎn)入Th細(xì)胞，Th細(xì)胞可在不受外界誘導(dǎo)環(huán)境下分化為Th2細(xì)胞，甚至將GATA3轉(zhuǎn)入已經(jīng)進(jìn)行早期Th1誘導(dǎo)環(huán)境中的T細(xì)胞后，可促使Th1細(xì)胞分化被逆轉(zhuǎn)為Th2細(xì)胞且分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-13等由Th2細(xì)胞分泌的相關(guān)免疫因子。近年來促炎細(xì)胞因子受到廣泛關(guān)注，如羅斌等[17]分析促炎因子IL-6與患者臨床結(jié)局之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IL-6有效地判斷患兒的疾病危重程度及預(yù)測(cè)患兒的臨床結(jié)局。本研究中顯示Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL-2與IFN-γ在重型和極重型再障組明顯高于非重型再障組，說明T-bet相關(guān)的Th1的異?；罨讷@得性AA的發(fā)病中可能起著一定作用。

國(guó)內(nèi)有研究通過流式細(xì)胞術(shù)與RT-PCR檢測(cè)獲得性AA與正常人外周血Th1、Th2、外周單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3 mRNA基因表達(dá)，與正常人群相比，重型再障組T-bet明顯升高，GATA3相比正常對(duì)照顯著降低[18]。檢測(cè)獲得性AA患兒骨髓T-bet和GATA3的表達(dá)水平或可更直接反映骨髓Th1、Th2細(xì)胞分化水平，進(jìn)一步揭示再障疾病的免疫病理機(jī)制。本研究顯示重型與極重型再障患兒T-bet蛋白表達(dá)較輕型表達(dá)顯著高，T-bet可能加重獲得性AA患兒骨髓細(xì)胞Th1/Th2失衡而加重獲得性AA的發(fā)生。本研究未檢測(cè)到GATA3蛋白在不同程度獲得性AA患兒骨髓病理切片表達(dá)差異，僅檢測(cè)出T-bet的差異，提示T-bet在判斷獲得性AA病情輕重方面優(yōu)于GATA3蛋白表達(dá)。目前獲得性AA疾病嚴(yán)重程度臨床診斷主要依靠于外周血常規(guī)，由于外周血常規(guī)計(jì)數(shù)受到輸血制品及感染等情況的影響，臨床指標(biāo)并不一定能及時(shí)有效提示疾病嚴(yán)重程度，但機(jī)體骨髓在一定時(shí)間保持穩(wěn)定狀態(tài)，T-bet的表達(dá)高低一定程度上或可反映了機(jī)體免疫損傷的程度。兒童獲得性AA病因復(fù)雜，通過T-bet蛋白的檢測(cè)或可識(shí)別出免疫損傷因素導(dǎo)致的再障，排除先天性骨髓衰竭，以選擇免疫抑制治療，避免先天性骨髓衰竭患兒盲目使用免疫抑制治療，錯(cuò)過了移植治療的最佳時(shí)機(jī)。

本研究涉及的骨髓活檢標(biāo)本部分存放時(shí)間偏長(zhǎng)，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響；進(jìn)一步研究還需要與先天性骨髓衰竭或其他疾病進(jìn)行對(duì)比研究；該疾病為罕見病，需多中心進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本進(jìn)行分析；或結(jié)合患兒的預(yù)后情況進(jìn)行相關(guān)分析，為獲得性AA患兒的精準(zhǔn)治療方案的選擇提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。