甘草來源內(nèi)生真菌多樣性和抗菌活性研究

劉文杰，李隴強，唐佳慧，姜淑玲，楊 平，陳春晨，郭文強

井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，吉安 343009

深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytes，DSE)作為一群定殖于植物根內(nèi)且具有深色菌絲和明顯橫隔的特殊真菌，其生活史中的某段時期存在于植物根的表皮、皮層甚至維管束組織的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙中，并能夠形成獨特的微菌核，但不會在根組織內(nèi)轉(zhuǎn)化成病原菌而引起植物病理學(xué)特征[1]。大部分植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌都屬于DSE范疇，隨著自然界長期的進(jìn)化選擇，該類真菌與宿主之間形成了動態(tài)平衡關(guān)系。在植物的生長周期中，內(nèi)生真菌在一定程度上具有促進(jìn)植物生長、提高宿主植物的抗病蟲害以及抵御環(huán)境壓力的作用。同時，內(nèi)生真菌與宿主植物次生代謝產(chǎn)物的積累也有密不可分的關(guān)系[2]。DSE廣泛分布于地球的所有生境中，越來越多的研究表明，DSE可能具有與根際土壤真菌類似的生態(tài)學(xué)功能，在不同生境下的微生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要共生作用，由此也可能具有異于普通生境下真菌的代謝途徑，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新型、活性獨特的天然產(chǎn)物[3,4]。

甘草屬于豆科甘草屬多年生草本植物，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳的功效，主要道地產(chǎn)區(qū)分布在寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古和新疆等地，因特殊的藥效而被廣泛使用[5]。而不同產(chǎn)地甘草藥材在品質(zhì)上存在差異，其主要原因可能為外部環(huán)境因子如產(chǎn)地氣候、土壤等造成產(chǎn)地差異性[6]。近年來，關(guān)于甘草中的DSE功能研究逐漸引起了人們的重視，相關(guān)研究表明，從甘草內(nèi)生真菌發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了與宿主相同的有效成分，如甘草酸、甘草苷、異甘草苷、甘草次酸、甘草素等[7-9]。此外，從甘草中分離的內(nèi)生真菌中篩選具有生物活性的菌株，聚焦其活性化合物也已成為天然產(chǎn)物研究的新方向[10,11]。鑒于此，本研究將展開對不同產(chǎn)地甘草來源內(nèi)生真菌種群多樣性和抗菌活性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品

新鮮健康的烏拉爾甘草樣品分別于2018年9月、10月采集于內(nèi)蒙古赤峰市、甘肅張掖市、寧夏吳忠市。甘草樣品采集后置于4 °C冰箱中保藏，并且由北京中醫(yī)藥大學(xué)孫志蓉教授鑒定為烏拉爾甘草。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(真菌2號)：葡萄糖(10 g/L)，麥芽糖(20 g/L)，谷氨酸鈉(10 g/L)，甘露糖醇(20 g/L)，KH2PO4(0.5 g/L)，玉米漿(1 g/L)，酵母浸粉(3 g/L)，MgSO4·7H2O(0.3 g/L)和蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH為6.5。

1.1.3 實驗儀器

超凈工作臺SW-CJ-2D(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)；高壓滅菌器KXQ-LS(上海博訊有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9082P03Ⅳ(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000A(鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司)；低溫冷卻液循環(huán)泵DLSK-5/20(鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵SHK-Ⅲ(鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司)；超聲波清洗器KQ-300E；電子天平BSA-124SNMR。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌分離純化

甘草樣品經(jīng)過75%酒精浸泡處理1 min后無菌水沖洗干凈，加水充分研碎并吸取上清液，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于28 °C孵育3～5天。從中分離出具有不同形態(tài)的真菌菌落，將其重新接種到新的PDA培養(yǎng)基，并在28 °C下再孵育培養(yǎng)36 h。根據(jù)在PDA平板上的菌落形態(tài)(顏色、質(zhì)地、邊界類型和徑向生長速率等)，將其分為不同的形態(tài)類型，最終得到內(nèi)生真菌純菌株。

1.2.2 內(nèi)生真菌種屬鑒定

將數(shù)據(jù)由Gardner模型擬合得到如圖2所示的曲線，圖中各點表示實測數(shù)據(jù)，曲線為擬合結(jié)果，各點與曲線基本重合。

從該來源的內(nèi)生真菌中提取DNA并進(jìn)行PCR反應(yīng)，實驗采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增內(nèi)部轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)(ITS)[12-14]。PCR產(chǎn)物由睿博生物科技有限公司(中國，北京)純化和測序。通過BLAST分析將鑒定出的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的其他序列進(jìn)行比較分析，并在ClustalW中進(jìn)行比對[15]。利用Godinho提出的標(biāo)準(zhǔn)來分析驗證GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST結(jié)果：對于查詢覆蓋率和序列同一性≥98%，該物種種屬可以被確定；對于覆蓋率和序列同一性在95%～97%之間的可以確定到種，而對于覆蓋率和序列同一性≤95%，則可以認(rèn)為是新菌[16]。系統(tǒng)進(jìn)化分析則是采用MEGA X進(jìn)行的，N-J法被用來估計種屬進(jìn)化距離，其自舉值是根據(jù)1 000次重復(fù)計算而得出的結(jié)果[17]。

1.2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)與處理

將各菌株接種到含有100 mL真菌2號液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 °C靜置發(fā)酵培養(yǎng)30天。發(fā)酵完成后將發(fā)酵混合物用等體積的乙酸乙酯超聲萃取2次，經(jīng)減壓蒸餾獲得粗提物后，甲醇溶解，并用微孔濾膜過濾除去不溶固體雜質(zhì)。揮干溶劑后稱重，用甲醇重新溶解，配成濃度為5 mg/mL的溶液，低溫冷藏備用。

1.2.4 指紋圖譜分析

真菌粗提物在HPLC系統(tǒng)(Waters Co.)中分析，該系統(tǒng)包含996型二極管陣列紫外檢測器和ODS-C18色譜柱(YMC，4.6 mm×250 mm，5 μm)。40 min內(nèi)從5%～100%甲醇梯度洗脫，并在100%甲醇條件下繼續(xù)洗脫10 min。

1.2.5 抗菌活性測試

以草分支桿菌、枯草芽孢桿菌、恥垢分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌作為抗菌活性指示菌，利用紙片擴散法進(jìn)行粗提物抗菌活性篩選與評價。氯霉素(0.1 μg/μL)被用作抗菌活性測定的陽性對照。將紙片(直徑10 mm)吸取菌株甲醇粗提液后揮干，并放置在鑒定菌瓊脂表面上。37 ℃下培養(yǎng)24 h后，測量五種鑒定菌下紙片的生長抑制區(qū)直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘草來源內(nèi)生真菌種屬分析與鑒定

對該來源的134株內(nèi)生真菌進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)其包含子囊菌類和接合菌類兩大真菌類群。依據(jù)Godinho的分類標(biāo)準(zhǔn)，對提交到GenBank數(shù)據(jù)庫的序列與相似菌株進(jìn)行覆蓋率和相似度的比對。結(jié)果可知大部分菌株與其最接近的種屬展示了較高的相似度，可以確定到種屬，由此發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地甘草內(nèi)生真菌群落組成也各不相同。內(nèi)蒙產(chǎn)地的55株甘草內(nèi)生真菌歸屬于11個種屬(Penicillium、Aspergillus、Byssochlamys、Talaromyces、Cladosporium、Fusarium、Clonostachys、Arthopyrenia、Alternaria、Sarocladium、Parastagonospora)，其中以青霉屬和鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌屬，分別占分離菌株總數(shù)的41.81%和16.36%。甘肅產(chǎn)地的41株內(nèi)生真菌隸屬于6個種屬(Cladosporium、Penicillium、Aspergillus、Fusarium、Ascomycota、Mucor)，其中以曲霉屬為優(yōu)勢類群,占分離菌株總數(shù)的39.02%。寧夏產(chǎn)地的38株內(nèi)生真菌隸屬于9個種屬(Penicillium、Aspergillus、Ascomycota、Cladosporium、Nigrospora、Hannaella、Alternaria、Didymella、Phoma)，以曲霉屬為優(yōu)勢菌，占分離菌株總數(shù)的23.68%。綜上，青霉和曲霉屬為各地甘草內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬，但各產(chǎn)地之間真菌種屬間差異性較大，初步發(fā)現(xiàn)甘肅產(chǎn)地甘草的內(nèi)生真菌種群多樣性較其他兩地低(見表1)。

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

將所有甘草內(nèi)生菌株的ITS序列輸入MEGA X進(jìn)行進(jìn)化分析，并通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹來對甘肅、內(nèi)蒙和寧夏的甘草內(nèi)生真菌的親緣性進(jìn)行種系發(fā)育研究(見圖1～3)。

圖1 內(nèi)蒙甘草來源內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationship of endophytic fungi from G.uralensis in Inner Mongolia

圖2 甘肅甘草來源內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationship of endophytic fungi from G.uralensis in Gansu

2.2 甘草來源內(nèi)生真菌抗菌活性

將所有菌株采用真菌2號培養(yǎng)基靜置發(fā)酵30天后，獲得134個代謝粗提物。在對其進(jìn)行五種鑒定菌的抗菌活性篩選后，發(fā)現(xiàn)35株內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出較好的抗菌活性，綜合活性率為26.1%。其中菌株AspergilluswesterdijkiaeCFGC-5-04、Fusariumsp.CFGC-5-14、Parastagonosporasp.CF

GC-5-27、FusariumoxysporumJWGG-5-50、DidymellamacrostomaJWNG-2-37、AlternariaangustiovoideaJWNG-2-39表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，同時的Cladosporiumsp.JWNG-2-15和Fusariumsp.CFGC-5-14的代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌顯示出較好的抑制活性(見表2)，顯示出潛在的代謝產(chǎn)物研究價值。

表2 甘草來源內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物抗菌活性Table 2 Antibacterial activity of secondary metabolites of endophytic fungi from G.uralensis

圖3 寧夏甘草來源內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.3 Phylogenetic relationship of endophytic fungi from G.uralensis in Ningxia

2.3 內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物分析

通過對所有甘草來源內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物的HPLC-UV圖譜進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)其有多個菌株的代謝產(chǎn)物具有特征的指紋圖譜(見圖4)。

圖4 部分內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物HPLC-UV指紋圖譜Fig.4 Comparison of metabolite fingerprints using HPLC-UV in representative endophytic fungi

其中活性菌株P(guān)enicilliumoxalicumCFGC-5-34、PenicilliumhalotoleransJWGG-5-46、Cladosporiumsp.JWNG-2-15的指紋圖譜中分別表現(xiàn)出λmax320 nm、λmax270 nm、λmax285 nm的系列的紫外吸收，預(yù)示著活性內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物中具有系列的天然產(chǎn)物。

3 討論

已有研究表明，DSE的分布范圍包含了不同的生境：從沿海灘涂到內(nèi)陸高原山地；從熱帶、溫帶到凍原地區(qū)及南北極地區(qū)均有DSE的分布。越來越多的研究結(jié)果支持DSE與宿主植物之間能形成互惠共生的內(nèi)在關(guān)系[1]。并且，DSE能夠促進(jìn)植物對土壤營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用、增強植物的抗逆性(包括抗旱、抗寒、耐重金屬等)、增強植物的抗病能力、影響植物群落、對不良環(huán)境植被的恢復(fù)和重建都有促進(jìn)作用[18]。近年來，傳統(tǒng)中藥中DSE越來越受到重視，其不僅在植物生理學(xué)、代謝組學(xué)等方面表現(xiàn)出巨大的研究價值，還被發(fā)現(xiàn)是良好生物活性天然產(chǎn)物的重要資源庫。

本研究以不同產(chǎn)地的甘草樣品為研究對象，研究其可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的物種多樣性和生物活性。與以往的研究相似，我們發(fā)現(xiàn)該來源DSE群落中既有優(yōu)勢種，也有稀有真菌種，屬于地方性、冷適應(yīng)型和世界性類群，表現(xiàn)出有趣而獨特的生態(tài)學(xué)特征。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一些具有高度生物活性的菌株，有待進(jìn)一步研究其次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和活性的多樣性，這些未開發(fā)的DSE菌株可能是獨特的微生物資源。

通過對不同產(chǎn)地甘草內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化來考察其生物多樣性，在參考已有報道研究中對甘草內(nèi)生真菌分離方法的基礎(chǔ)上[5]，對甘肅、內(nèi)蒙和寧夏甘草主產(chǎn)地的DSE進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)3個產(chǎn)區(qū)分離率、真菌種屬多樣性等方面都具有較大的差異性，其顯示出可能的甘草地域性與內(nèi)生真菌種屬之間的潛在關(guān)系。對于中藥的道地性等問題上，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為道地藥材是植物基因和環(huán)境相互作用的產(chǎn)物，多集中于特定的地理因素或氣候因素等植物外環(huán)境的作用，很少從植物內(nèi)環(huán)境方面進(jìn)行考慮，而內(nèi)生菌又是植物內(nèi)環(huán)境的重要組成部分[19]。研究也推測DSE是道地藥材在特定區(qū)域分布的重要原因之一，也是道地藥材與非道地藥材品質(zhì)差異的一個潛在原因。同時還發(fā)現(xiàn)植物DSE能夠影響中藥材的道地性，能夠提高藥用植物對某些次級代謝產(chǎn)物的累積[20,21]。

對不同產(chǎn)地甘草內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物的抗菌活性篩選與評價，發(fā)現(xiàn)各個產(chǎn)地甘草的內(nèi)生真菌對多種病原菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，同時HPLC-UV分析也發(fā)現(xiàn)多個系列類型的天然產(chǎn)物存在，這在挖掘其次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性方面具有潛在的研究價值。因此，分析甘草DSE的種屬多樣性，對相關(guān)菌株代謝產(chǎn)物的深入研究仍有必要，其對于甘草的道地性意義闡明和活性天然產(chǎn)物挖掘研究都具有重要的意義。