卷枝毛霉蘋果酸轉(zhuǎn)運蛋白生物信息學(xué)分析

王艷霞,王璐,楊俊換,張瑤

(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

早期研究表明，氮源限制是產(chǎn)脂微生物積累脂質(zhì)的重要營養(yǎng)特征，當(dāng)培養(yǎng)基中氮源耗盡后，細胞內(nèi)能荷升高，腺苷一磷酸(adenosine monophosphate，AMP)度降低，三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)受阻，此時胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等大分子的合成趨于停止，菌體不再生長，而培養(yǎng)基中大量的碳源(葡萄糖及其他被微生物吸收利用的糖類)持續(xù)吸收并轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)，引起胞內(nèi)脂質(zhì)大量積累[1-3]。至今，科學(xué)家們對微生物脂質(zhì)積累過程做了大量的研究工作，對產(chǎn)脂微生物氮源限制引發(fā)三羧酸循環(huán)調(diào)節(jié)到脂肪酸合成的生化機制有了較為清楚的認(rèn)識[3-4]。對真核生物而言，糖酵解的終產(chǎn)物——丙酮酸進入線粒體內(nèi)，經(jīng)丙酮酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為重要中間代謝產(chǎn)物——乙酰-CoA。線粒體內(nèi)乙酰-CoA必須轉(zhuǎn)運到細胞溶膠，才能用于脂質(zhì)合成[5-7]；因此，轉(zhuǎn)運乙酰-CoA(檸檬酸為其乙?；d體)的線粒體三羧酸(檸檬酸)轉(zhuǎn)運體系是連接糖代謝與脂質(zhì)合成的紐帶，是影響真核生物脂質(zhì)合成的一個重要因素[5-7]。

三羧酸(檸檬酸)轉(zhuǎn)運體系中另一個重要轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)是蘋果酸(或二羧酸)轉(zhuǎn)運體(malate transporter,MT)。對大鼠肝臟[8]、胰腺beta細胞[9]線粒體，以及從大鼠肝臟中分離、純化的二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)[10-11]的研究結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)運體通過電荷中性交換原則，在轉(zhuǎn)入磷酸鹽(或含硫化合物)的同時，將二羧酸(蘋果酸、琥珀酸)轉(zhuǎn)出線粒體用于糖異生。對釀酒酵母二羧酸轉(zhuǎn)運體的研究[12-14]顯示，MT有可能通過轉(zhuǎn)入蘋果酸而增加線粒體內(nèi)檸檬酸的合成量，從而促進線粒體檸檬酸的轉(zhuǎn)出。近年來，隨著全基因組測序與全外顯子測序等高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展[15]，大量新的基因序列及氨基酸序列被載入到生物數(shù)據(jù)庫中，促進了生物信息學(xué)的繁榮。研究那些通過實驗難以確定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，利用生物信息學(xué)軟件對其結(jié)構(gòu)進行快速預(yù)測和分析，具有重要的理論意義和實用價值。

產(chǎn)脂真菌卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)是研究脂質(zhì)積累機制的模式生物，也是全球首次商業(yè)化生產(chǎn)微生物油脂的菌株，其生產(chǎn)的油脂富含ω-6多不飽和脂肪酸γ-亞麻酸[5-6]。目前關(guān)于產(chǎn)脂絲狀真菌檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)和功能報道較少。本研究借助生物信息學(xué)分析技術(shù)對來源于卷枝毛霉的MT蛋白的理化特性、空間結(jié)構(gòu)及功能位點進行預(yù)測，為后續(xù)探究該轉(zhuǎn)運蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

1 實驗方法

1.1 卷枝毛霉MT蛋白序列

根據(jù)JGI數(shù)據(jù)庫公布的卷枝毛霉CBS277.49的基因組信息，通過BLAST工具將基因組中全部基因序列與轉(zhuǎn)運體系分類數(shù)據(jù)庫(TCDB)進行比對，找到編碼卷枝毛霉MT蛋白的基因只有一個，通過BLAST工具在CBS277.49的基因數(shù)據(jù)庫(http://genome.jgi.doe.gov/pages/search-for-genes.jsf?organism=Mucci2)中查找CBS 277.49中的蘋果酸轉(zhuǎn)運體相關(guān)基因，序列如下：

MGEKLERKSLKEMVRHFTPSWFSVIMGTGILSILLHVFPFQFRGLQTIALVVYIMNVVMFCIFLIITIARYAIWPSIIRLVLEHSNQSLFIGTMPMGLTTITNFTILAIREKYAWGLNLAFVLWIIEYVLTILTVLVVPYFVIVHHNHALETMNGTWLLPIVPCVVASASGGLLAQYLDQDRALVVLVISIITMGMGLSLALSVIVIYFYRLIVNKLPPKEVIISSFLPLGPLGQGAYGVIQLGIASKAVLGDRFIVGLGDVAHSVGFLLALFLWGYGVWYLVVATFSVGITTKQGIPFNMGWWALTFPLGVFTAGTLSIGNVLNSMFFWVLGAIFTCLLVLLWLAVMAKTLKGIFTGEMFYAPCLSPVILNS

1.2 卷枝毛霉MT蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過借助在線分析工具Protparam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)對卷枝毛霉MT蛋白的理化性質(zhì)進行分析；借助ProtScale(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)對 MT 蛋白的疏水性進行分析。通過借助在線預(yù)測工具PredictProtein(http://www.predictprotein.org)和Sopma(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)預(yù)測 MT 蛋白的二級結(jié)構(gòu)，借助在線分析網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進一步預(yù)測該蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。借助 SWISS-MODEl工具在線完成 MT 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建。

1.3 卷枝毛霉MT蛋白功能預(yù)測

通過借助在線預(yù)測工具 SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測 MT 蛋白的信號肽；借助在線分析工具TMHMMServer v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對MT蛋白的跨膜特征進行分析；借助 NCBI 網(wǎng)站上 Conserved Domains Search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)工具分析 MT 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；借助在線分析工具NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析 MT 蛋白的磷酸化位點以及借助 Motif Scan(https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)在線工具對 MT 蛋白翻譯后修飾位點及膜體位置進行分析。

1.4 卷枝毛霉MT蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用卷枝毛霉MT蛋白序列在NCBI網(wǎng)站上借助BLAST工具進行同源性分析，從中挑選出同源性較高的不同代表性物種的蛋白序列進行多重序列比對，并使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷枝毛霉MT蛋白的理化性質(zhì)

通過對卷枝毛霉中MT蛋白理化性質(zhì)的分析，得知該轉(zhuǎn)運蛋白的分子量約為41 247.79 Da，分子式為C1967H3062N454O475S18，等電點為9.14，不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為24.01(Ⅱ級)，因此將該類蛋白歸類為相對穩(wěn)定的蛋白。該蛋白的氨基酸總數(shù)為373個，含量相對較高的氨基酸主要包括Leu(56個，15.0%)、Val(40個、10.7%)、Ile(38個、10.2%)、Gly(32個、8.6%)、Phe(25個、6.7%)、Ala(24個、6.4%)、Thr(23個、6.2%)，不含有Pyr和Sec兩類氨基酸，因此其脂肪族氨基酸指數(shù)偏高，約為135.82。該蛋白為膜蛋白，它的親水性總平均值為1.052，一般根據(jù)親水性總平均值的正負來判斷其親水性與疏水性(正值為疏水性，負值為親水性)，因此我們推斷這是一個疏水性蛋白。通過使用ProtScale工具對該蛋白的疏水性進一步分析，結(jié)果表明MT蛋白的疏水性較強，利于它向內(nèi)部折疊形成二級結(jié)構(gòu)，進一步形成結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)等，同時利于形成α螺旋，保證其穩(wěn)定性，符合其跨膜蛋白的特性(圖1)。

圖1 MT蛋白的疏水性/親水性預(yù)測Fig.1 Hydrophobic/hydrophilic prediction of MT protein

2.2 卷枝毛霉MT蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對卷枝毛霉MT蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖2)顯示，該蛋白中二級結(jié)構(gòu)為:α螺旋(藍色線條,193殘基)占比為51.74%、無規(guī)則卷曲(紫色線條，101殘基)占比為27.08%、延伸鏈(紅色線條，65殘基)占比為17.43%、β轉(zhuǎn)角(綠色線條，14殘基)占比為3.75%。α螺旋占比最高，是組成該MT蛋白的主要結(jié)構(gòu)。膜蛋白分子中，鑲嵌在膜內(nèi)的部分為α螺旋結(jié)構(gòu)。借助Phyre工具進一步對跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖3)進行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白總計有10處跨膜區(qū)，分別位于：19-36，48-72，87-107，119-141，156-176，186-221，225-242，263-290，303-321，329-358氨基酸位點處。

圖2 MT蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary structure of MT protein

圖3 MT蛋白的跨膜螺旋拓撲結(jié)構(gòu)Fig.3 Transmembrane helical topology of MT protein

2.3 卷枝毛霉MT蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

卷枝毛霉MT蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖4所示，可知該蛋白在N端以無規(guī)則卷曲和延伸的形式存在，中部由10個α螺旋和少量β轉(zhuǎn)角交替出現(xiàn)，C端以β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)束。整個模型是通過α螺旋和少量β轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)元素在三維空間的上述形式排列形成的一個接近于橢球形的蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。此蛋白分子由10個跨膜螺旋逆時針形成活性中心鑲嵌于膜內(nèi)的磷脂雙分子層之間，符合其跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)。

圖4 預(yù)測的MT蛋白的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Predicted tertiary structures of MT protein

2.4 卷枝毛霉MT蛋白的分析

通過使用SignalIP 3.0 Server工具Neural Networks(NN)程序?qū)碇γ筂T蛋白的信號肽進行分析，發(fā)現(xiàn)Cleavage site score(C-score)沒有明顯特征、Signal peptide score(S-score)在40殘基處有高的分值；但綜合分析信號肽剪切分值并不高，因此預(yù)測該蛋白不存在信號肽屬于非分泌型蛋白(圖5)。通過使用TMHMM工具對卷枝毛霉MT蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進行分析(圖6)，發(fā)現(xiàn)該蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的位置為：20-42，52-74，87-109，122-144，156-178，188-210，223-245，265-287，299-321，326-348氨基酸位點處，符合其跨膜蛋白的特性。TMHMM工具對卷枝毛霉MT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的位置預(yù)測與上述Phyre工具的位點稍有偏差，但跨膜區(qū)域總數(shù)相一致。

圖5 MT蛋白的信號肽分析Fig.5 Signal peptide analysis of MT protein

圖6 MT蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.6 Transmembrane analysis of MT protein

2.5 卷枝毛霉MT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過使用NCBI網(wǎng)站上的Conserved domains分析可知，卷枝毛霉MT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域有一個(圖7)，預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白中14-348氨基酸屬于亞硒酸鹽抗性/二羧酸轉(zhuǎn)運體(TDT)家族。含有門控離子通道中的苯丙氨酸，與亞硫酸鹽敏感蛋白(SSU1)保守結(jié)構(gòu)域一致。

圖7 MT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 Conservative domain analysis of MT protein

2.6 卷枝毛霉MT蛋白翻譯后修飾與結(jié)構(gòu)的特征性序列分析

通過對卷枝毛霉MT蛋白理化性質(zhì)的分析可知，絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)不是其主要組成，含量較低，故此推測該蛋白的磷酸化位點較少。通過借助NetPhos 2.0 Server分析工具進一步預(yù)測的結(jié)果表明，MT蛋白潛在的Ser磷酸化位點有3個，潛在的Thr磷酸化位點有2個，無潛在的酪氨酸(Tyr)磷酸化位點。

不同的翻譯后修飾類型都可能影響蛋白的基本性質(zhì)進而影響其功能，借助Motif Scan程序分析卷枝毛霉MT蛋白翻譯后修飾位點及膜體位置見表1。由表1可知：該蛋白存在3個ASN-糖基化位點，分別位于氨基酸86-89、103-106、154-157處；8個豆蔻?；稽c，分別位于氨基酸116-121、171-176、195-200、296-301、311-316、321-326、333-338、354-359處；1個酪蛋白激酶II磷酸化位點，位于氨基酸9-12處；3個蛋白激酶C磷酸化位點，分別位于氨基酸9-11、291-294、351-353處。同時在氨基酸19-316處存在一個C4-二羧酸轉(zhuǎn)運體/MT蛋白保守結(jié)構(gòu)域，概率值為4.8e-89，與功能域預(yù)測的結(jié)果一致。

2.7 卷枝毛霉MT蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析

借助網(wǎng)站NCBI中的Blast工具將卷枝毛霉MT蛋白與其他物種中的MT蛋白進行同源性分析隨后生成系統(tǒng)發(fā)育樹(圖8)。結(jié)果顯示卷枝毛霉CBS277.49與毛霉菌(Mucorambiguous)的同源性最高，其次與卷枝毛霉WJ11也有很高的同源性，因此聚為一類；與栽培大豆(Cultivatedsoybeans)和植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)兩個物種親緣關(guān)系較遠。

3 結(jié)束語

本研究借助生物信息學(xué)分析技術(shù)對產(chǎn)脂絲狀真菌卷枝毛霉的MT蛋白進行多方面預(yù)測。經(jīng)分析推斷可知，該蛋白疏水性強且性質(zhì)穩(wěn)定，不存在明顯的信號肽特征，屬于非分泌型蛋白。α螺旋是組成該MT蛋白占比最高的二級結(jié)構(gòu)，并且膜蛋白分子中α螺旋結(jié)構(gòu)是鑲嵌在膜內(nèi)的部分[6]，符合該蛋白跨膜運輸?shù)奶匦浴T蛋白由10個跨膜螺旋逆時針排列形成一個接近于橢球形的蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。對MT蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，該蛋白存在一個C4-二羧酸轉(zhuǎn)運體/MT蛋白保守結(jié)構(gòu)域。該轉(zhuǎn)運蛋白磷酸化位點、翻譯后修飾與結(jié)構(gòu)的特征性序列分析顯示其潛在的Ser磷酸化位點有3個，潛在的Thr磷酸化位點有2個，無潛在的Tyr磷酸化位點；有8個豆蔻?；稽c，3個ASN-糖基化位點和蛋白激酶C磷酸化位點，1個酪蛋白激酶II磷酸化位點。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)卷枝毛霉MT蛋白與毛霉菌(Mucorambiguous)的同源性最高，聚為一類，與植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的親緣關(guān)系較遠。本研究將為后續(xù)探究MT蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

表1 MT蛋白翻譯后修飾位點預(yù)測Tab.1 Post-translational modification site prediction of MT protein

圖8 不同種屬的MT蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of MT protein system from different species