固本清目方對實驗性干性年齡相關性黃斑變性小鼠的干預作用

張晶，許凱，梁麗娜，莊曾淵，梁潔

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）屬于視網膜變性類疾病的范疇，是嚴重威脅視力的致盲性眼病，患者多為50 歲以上人群，并且隨著年齡增加發(fā)病率也逐漸升高。在我國經濟發(fā)展程度較高的城市，AMD 甚至已成為老年人群致盲性眼病的第2 位原因[1]。根據臨床特點的不同，AMD 可分為滲出性（濕性）和非滲出性（干性）。對于濕性AMD 的治療隨著抗新生血管藥物的使用已取得了較好的臨床效果。但對于干性AMD 引起的視力喪失，目前仍缺乏有效的治療藥物。

中醫(yī)辨證論治和整體治療的理念為AMD 的治療提供了新的思路[2]。一項關于中藥治療干性AMD療效meta 分析的結果顯示，中藥治療后，患者視力以及視覺誘發(fā)電位振幅都有明顯改善[3]。固本清目方是莊曾淵研究員臨床治療AMD 的基本方，臨床初步觀察顯示有較好的效果，為進一步明確固本清目方保護AMD 的作用及機制，本實驗模擬AMD 發(fā)生的高危因素建立小鼠AMD 模型，觀察固本清目方對實驗性視網膜變性的保護作用，并就其相關機制進行探討，為固本清目方的臨床應用提供理論依據及支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4 月齡健康雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠60 只（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2016-0006]。實驗動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院實驗動物中心屏障級動物房內[SYXK（京）2019-0049]。溫度（22±5）℃，濕度（50±5）℃。所有實驗操作遵循《北京市實驗動物管理條例》，并按實驗動物3R 原則給予人道關懷。

1.2 試劑與儀器

固本清目方水煎劑（組成：枸杞子，當歸，刺五加，郁金，山梔子，由中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院藥劑科煎制），煎制濃縮到0.6 g/ml；氫醌（Sigma-Aldrich，H9003）；TUNEL 細胞原位凋亡試劑盒（Roche Life Science，12156792910）；HE 染色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，C02-04004）；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色液（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，BD PharmingenTM，564907）；抗熒光淬滅劑（北京博奧森生物技術有限公司，C-101）；DNA 酶I（大連TaKaRa 公司，D2270A）；冰凍包埋劑（optimal cutting temperature compound，OCT，美 國SAKURA Sakura 公司，4583）；4%多聚甲醛（北京Unique 生物科技有限公司，P1110）；Fas（Abcam，ab216991）；FasL（Abcam，ab15285）；羅丹明標記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，ZF0316）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA,北京博奧森生物技術有限公司，bs-2315）。熒光定量PCR（qualitative real-time PCR，RT-PCR）試劑盒（TAKAR寶生物工程(大連)有限公司，DRR820A），引物（上海生物工程公司），SuperScript III 逆轉錄酶試劑盒（ThermoFisher，12574018）小動物視覺電生理檢測儀（Diagnosis，D430），光學顯微鏡（Leica，DM2500）,冰凍切片機（Leica，CM1850），光照度計（北京師范大學光電儀器廠，ST-85），大鼠SPF 級生長繁育飼料（北京科奧協(xié)力飼料有限公司），實驗性慢性視網膜光損傷裝置（自主設計研發(fā)，實用新型專利證書號：ZL201721043922.6）。

1.3 動物模型的建立與分組

4 月齡C57BL/6J 小鼠40 只，每日喂以含8g/（kg.bw）氫醌的飼料，同時每日接受12 h、強度2500 lux 的光照以建立視網膜變性模型[4]。3.5 個月后，將小鼠隨機分為中藥組、模型組，每組20 只。中藥組小鼠每日給予0.6 kg/kg 固本清目方0.3 ml 灌胃1 次；模型組小鼠每日給予同體積蒸餾水灌胃1 次。取正常未干預C57BL/6J 小鼠20 只作為正常組，常規(guī)飼養(yǎng)作為對照。

1.4 視網膜電圖檢測

各組小鼠于檢測前暗適應24 h，復方托吡卡胺滴眼液點雙眼常規(guī)散瞳20 min；采用鹽酸氯胺酮-鹽酸塞拉嗪混合麻醉劑（比例為1∶7）肌注（0.01 ml/kg）麻醉小鼠。視網膜電圖（electroretinogram，ERG）檢測操作全程均在弱紅光燈下進行操作。將雙側角膜電極置于小鼠雙側眼角膜正中，保持各電極間阻抗始終＜5 kΩ。根據國際臨床視覺電生理協(xié)會（ISCEV）制定的最新國際標準[5]，依次選定視桿細胞反應，最大反應，暗適應震蕩電位，（自動明適應5 min）視錐細胞反應以及10 Hz 閃爍光反應進行檢測。依次記錄各組振幅值（μV）。

1.5 組織病理學檢查

于干預后14 d 及28 d，每組分別頸椎脫臼法處死3 只小鼠用于病理學檢查，快速摘取眼球，1 ml 注射器角膜穿刺置于4%多聚甲醛固定20 min，解剖顯微鏡下小心去除眼前節(jié)和部分玻璃體，余下組織繼續(xù)固定24 h，梯度酒精脫水、二甲苯透明后浸蠟包埋。連續(xù)4 μm 切片，切片常規(guī)脫蠟至水后行HE 染色，光學顯微鏡觀察視網膜各層病理改變。

1.6 TUNEL 檢測視網膜細胞凋亡

于干預后14 d 及28 d，每組分別處死3 只小鼠制作眼球冰凍切片，小鼠眼球取材同HE 染色，4%多聚甲醛液中4℃固定24 h 后，冰凍包埋劑OCT 包埋后液氮冷凍。冰凍切片機-23℃下行垂直視網膜的8 μm 冰凍切片。冰凍切片磷酸緩沖液（PBS）室溫15 min×3 次洗脫包埋劑，進行TUNEL 檢測，具體操作參見試劑盒說明，完成后進行DAPI 復染細胞核，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每組隨機選取10 張片子，每張片子計數一個高倍視野下凋亡的感光細胞數及感光細胞總數。計算凋亡率，凋亡率=（凋亡陽性細胞數）/（視網膜總細胞數）×100%。

1.7 Fas 及FasL 的表達

免疫熒光檢測：將冰凍切片置于磷酸緩沖液（PBS）室溫10 min×3 次，然后置于1% TritonX-100溶液30 min，2%牛血清白蛋白的室溫封閉2 h 后滴加分別一抗Fas、FasL，4℃孵育過夜。PBS 溶液室溫洗滌10 min×3 次，滴加羅丹明標記的山羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h，PBS 清洗10 min×3 次，DAPI 復染細胞核5 min。抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

RT-PCR 檢測Fas 及FasL mRNA 的表達：于干預后14 d 及28 d，每組分別處死4 只小鼠用于RT-PCR 檢查，采用Trizol 法提取視網膜組織總RNA，參照試劑盒SuperScriptTM III 提供的操作方法，逆轉錄合成cDNA，紫外分光光度計測定其濃度。引物序列見表1。常規(guī)PCR 操作擴增程序檢測Fas、FasL 的mRNA 表達水平。數據進行2-ΔΔCt轉換后，進行分析比較。

表1 RT-PCR 引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 軟件包進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，經正態(tài)性檢驗后，對符合正態(tài)分布的兩樣本均數比較采用獨立樣本t 檢驗；多個樣本均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗。對于不符合正態(tài)分布的數據采用秩和檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組視網膜電圖（ERG）比較

14 d：（1）與正常組比較，中藥組10 Hz 閃爍光反應降低（t=7.360，P=0.000），但視桿細胞反應、最大反應、暗適應震蕩電位以及視錐細胞反應各項差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（2）中藥組與模型組比較，視桿細胞反應（t=2.937，P=0.022）、最大反應（t=3.153，P=0.016）、暗適應震蕩電位（t=3.597，P=0.009）、視錐細胞反應（t=2.988，P=0.020）振幅均升高，差異均有統(tǒng)計學意義，但在10 Hz 閃爍光反應方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 干預14 d 時各組小鼠ERG 結果比較（，n=10）

表2 干預14 d 時各組小鼠ERG 結果比較（，n=10）

注：▲與正常組比較，P＜0.05；◆與中藥組比較，P＜0.05。ERG 視網膜電圖

28d：（1）與正常組比較，中藥組最大反應（t=13.229，P=0.000）、10 Hz 閃爍光反應（t=10.651，P=0.000）振幅值均降低，差異均有統(tǒng)計學意義。但視桿細胞反應、暗適應震蕩電位、視錐細胞反應各項，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（2）中藥組與模型組比較，視桿細胞反應（t=4.687，P=0.002）、暗適應震蕩電位（t=3.371，P=0.012）、視錐細胞反應（t=4.176，P=0.004）振幅仍升高，差異均有統(tǒng)計學意義；而最大反應、10 Hz 閃爍光反應的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

表3 干預28 d 各組小鼠ERG 結果比較（，n=10）

表3 干預28 d 各組小鼠ERG 結果比較（，n=10）

注：▲與正常組比較，P＜0.05；◆與中藥組比較，P＜0.05。ERG 視網膜電圖

2.2 組織病理學

HE 染色顯示，正常組小鼠視網膜各層結構清晰，細胞形態(tài)均一，視網膜色素上皮（retina pigment epithelium，RPE）細胞呈單層連續(xù)排列（圖1A、1D）。與正常組相比，模型組小鼠RPE 層呈現萎縮樣改變（圖1B、1E），中藥組小鼠RPE 細胞排列較規(guī)整，色素均勻分布于細胞內，Bruch 膜結構相對完整，（圖1C、1F）。14 d 時，中藥組的視網膜感光細胞個數（231.67±9.71）較模型組（203.67±10.26）顯著升高（t=6.346，P=0.000），而與正常組（235.33±17.00）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；28 d 時，中藥組感光細胞個數（182.67±12.12）仍顯著高于模型組（176.67±36.17）（t=5.827，P=0.001），而與正常組（213.33±15.00）的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 小鼠視網膜病理圖像觀察（HE 染色×400）。1A 正常組14 d；1B 模型組14 d；1C 中藥組14 d；1D 正常組28 d；1E 模型組28 d；1F 中藥組28 d

2.3 TUNEL 法觀察各組小鼠視網膜細胞凋亡

TUNEL 染色結果顯示，正常組視網膜罕見凋亡細胞（圖2A、2D），14 d 及28 d 時，中藥組（圖2C、2F）和模型組（圖2B、2E）均可見凋亡陽性細胞呈現紅色熒光（圖2B），主要分布于視網膜內、外核層及RPE 細胞層。14 d 時，中藥組凋亡率（16.00±2.34）%明顯低于模型組（43.00±2.17）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.714，P=0.030）；28 d 時，中藥組與模型組細胞凋亡率分別為（7.00±2.35）%和（36.00±2.13）%，差異具有統(tǒng)計學意義（t=3.231，P=0.014）。

圖2 TUNEL 法檢測各組小鼠視網膜細胞凋亡（TUNEL 染色×400）。2A 正常組14 d；2B 模型組14 d；2C 中藥組14 d；2D 正常組28 d；2E 模型組28 d；2F 中藥組28 d

2.4 免疫熒光檢測各組視網膜組織Fas 及FasL 的表達

Fas：正常組視網膜中可見少量Fas 蛋白表達，呈紅色熒光，主要分布在RPE 層（圖3A，3D），14 d時，中藥組Fas 蛋白表達趨勢與正常組類似，主要集中于RPE 層（圖3C），而模型組Fas 表達較正常組增強，RPE 層可見到明顯的陽性信號（圖3B）。28 d時，中藥組（圖3F）和模型組（圖3E）Fas 蛋白表達均較14 d 時減弱，但表達分布趨勢與14 d 相似。

圖3 免疫熒光檢測各組小鼠視網膜Fas 表達情況（×400）。3A 正常組14 d；3B 模型組14 d；3C 中藥組14 d；3D 正常組28 d；3E 模型組28 d；3F 中藥組28 d

FasL：正常組可見FasL 少量表達（圖4A，4D），呈紅色熒光，主要分布在RPE 層。14 d 時，模型組表達較正常組增強，在RPE 層和感光細胞內核層均可見到紅色熒光信號（圖4B）；中藥組僅在RPE層可見少量表達（圖4C）。28 d 時，中藥組（圖4F）和模型組（圖4E）FasL 的表達分布于14 d 時相近，在RPE 層以及內核層均可見陽性信號，中藥組表達弱于模型組。

圖4 免疫熒光檢測各組小鼠視網膜FasL 表達情況（×400）。4A 正常組14 d；4B 模型組14 d；4C 中藥組14 d；4D 正常組28 d；4E模型組28 d；4F 中藥組28 d

2.5 RT-PCR 檢測各組視網膜組織Fas 及FasL mRNA 的表達

Fas：14 d 時，中藥組Fas 表達較模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.153，P=0.000）；中藥組與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；28 d 與14 d 趨勢相近，中藥組表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.204，P=0.000），而與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖5）。

圖5 RT-PCR 檢測各組Fas、FasL mRNA 的表達情況。5A FasmRNA的表達；5B FasL mRNA 的表達

FasL：14 d 時，中藥組FasL 表達低于模型組（t=8.372，P=0.000），而與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；28 d 時，中藥組FasL 表達仍低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.011，P=0.000），而與正常組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

目前AMD 具體發(fā)病機制尚不十分明確，但大量研究顯示AMD 一個多因素作用、光感受器細胞、RPE 細胞和脈絡膜毛細血管之間相互影響形成的復雜系統(tǒng)的表現。因此，聯(lián)合多種發(fā)病誘因，盡可能模擬AMD 發(fā)生的環(huán)境因素，可能會建立更接近人AMD 發(fā)病機制的動物模型。年齡、吸煙及光損傷是AMD 發(fā)生的重要誘因[6-7]。動物實驗發(fā)現，處于吸煙環(huán)境的老齡小鼠視網膜色素上皮層下出現沉積物、Bruch 膜層膠原增厚及RPE 細胞凋亡，與人AMD早期病理改變相似[8]。另1 項動物實驗顯示：利用可見光持續(xù)照射2 月齡豬3 個月以上，多焦視網膜電圖、光鏡、電鏡觀察證實視網膜發(fā)生了變性損傷，光損傷部位主要在光感受器細胞[9]。上述模型分別以吸煙、光照2 個AMD 危險因素模擬出部分AMD 病理改變，本課題組前期將老齡、吸煙（氫醌為香煙中的有害成分）、可見光持續(xù)照射三因素聯(lián)合建立小鼠AMD 模型，觀察到小鼠視網膜變化與臨床AMD的病變特點更加接近[4]。因此本研究仍采用此種模型小鼠，觀察固本清目方對AMD 的干預作用。

AMD 在中醫(yī)眼科屬“視瞻昏渺”“視直如曲”等病證范疇。雖然臨床上所見證型復雜，但其主要病機是由于機體老化，五臟皆虛，脾腎為重。一方面脾腎虛衰致精血不足，真元耗傷，精氣不能上榮于目，則目失濡養(yǎng)而目視不明；另一方面脾腎功能衰弱，則水濕運化無度，氣機不利，清陽不升，濁陰不降，痰濁之邪內生，加之長期光照、吸煙等外邪刺激皆能化火，耗傷氣血，使痰濕積聚加重，變生玻璃膜疣、滲出、水腫等導致AMD 發(fā)生。

固本清目方組成包括枸杞子、黃芪、當歸、刺五加、郁金、山梔，其中枸杞子補腎填精，黃芪、當歸益氣養(yǎng)血，刺五加補腎益氣，郁金、山梔行氣解郁，諸藥合用，共奏補腎固本、行氣解郁功效?，F代藥理學研究顯示，組方中刺五加水提取物能夠有效清除自由基，減輕缺血-再灌注過程中過氧化引起的線粒體損傷[10]，對胰腺細胞急性炎癥損傷所致的凋亡和自噬等具有確切保護作用[11];此外，刺五加功能成分可改善輻射造成的小鼠腦組織細胞的損傷，具體機制與其黃酮及皂苷等減少輻射小鼠大腦皮質與海馬組織的細胞空洞,提高存活神經元數量密切相關[12]。組方中的枸杞子富含枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP），研究證實枸杞子及LBP 對角膜損傷、視網膜色素變性、AMD 以及糖尿病視網膜病變等多種眼科疾病的防治均具有一定效果。此外在輻射所致的大鼠海馬神經元損傷模型中，LBP 通過增加SOD、Bcl-2 的含量、抑制caspase-3 蛋白表達水平，實現對神經元細胞的保護作用[13-18]；組方中黃芪的功能成分黃芪多糖對視網膜神經節(jié)細胞的炎癥損傷以及凋亡均具有保護作用[19-20]。本研究結果顯示，固本清目方干預14 d 及28 d 后，小鼠ERG 中視桿細胞反應、暗適應震蕩電位、視錐細胞反應的振幅顯著高于模型組，視網膜病理結果顯示中藥組小鼠的視網膜內、外核層細胞數量高于模型組，表明固本清目方對模型小鼠視網膜視桿細胞和視錐細胞的結構和功能具有維持和改善作用。

Fas 蛋白為腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis family receptor，TNFR）家族成員，FasL 為Fas 的配體，屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis family，TNF）家族[21]。生理狀態(tài)下，FasL 存在于虹膜、睫狀體、脈絡膜以及視網膜等眼部組織中[22]，在損傷、炎癥、缺血等因素刺激下活化，與FAS+的細胞結合，介導細胞凋亡過程[23]。本研究中，RT-PCR 及免疫熒光結果顯示固本清目方可以抑制AMD 模型小鼠視網膜組織中Fas/FasL 的表達及分泌，TUNEL 結果顯示中藥組凋亡陽性細胞顯著低于模型組，提示固本清目方可能通過調控Fas/FasL 介導的細胞凋亡通路，抑制視網膜細胞凋亡從而發(fā)揮保護作用。

綜上所述，本研究從形態(tài)學及功能學角度證實固本清目方對實驗性小鼠AMD 具有較好的保護作用，并發(fā)現其機制與調節(jié)Fas/FasL 的表達，進而抑制Fas/FasL 介導的視網膜細胞凋亡有關。在今后的工作中，一方面需要開展規(guī)范的臨床試驗，為固本清目方的臨床推廣提供高質量的循證依據；另一方面進一步深入揭示其作用機制，為固本清目方的應用提供理論支持。