含枯草芽孢桿菌肥料對大豆葉片光合作用及土壤酶活性的影響

黃國東，宋清暉，王曉慧，王學(xué)剛，馮宇涵，孫思淼，李洪濤，張占勝，王 楠，宋福強(qiáng)

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心， 黑龍江 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué) 黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點實驗室， 黑龍江 哈爾濱 150080；3.黑龍江省慶東陽光農(nóng)業(yè)生物科技股份有限公司，黑龍江 肇東 151100)

0 引 言

大豆(Glycinemax)是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，東北是大豆的主產(chǎn)區(qū)，其中黑龍江省種植大豆的面積最大。為了保證大豆的產(chǎn)量，采取的主要措施就是大量施用化肥[1]。過量施用化肥會加重土壤酸化和鹽漬化，從而間接引起植物病害發(fā)生，作物減產(chǎn)，生產(chǎn)成本提高及環(huán)境污染等問題[2]。因此，開發(fā)環(huán)境友好型肥料及合理的施肥措施是保證作物產(chǎn)量，恢復(fù)土壤肥力，維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑[3]。

利用微生物肥料修復(fù)或改良土壤生態(tài)系統(tǒng)，恢復(fù)土壤肥力成為降低化肥對土壤污染問題的有效措施[4]。大豆施用微生物肥料，不僅可以減少化肥用量，還可以減少土壤中養(yǎng)分的損失，活化土壤養(yǎng)分，利于養(yǎng)分的有效化，促進(jìn)大豆對土壤養(yǎng)分的有效利用，提高肥料利用率。孫壯等[5]研究表明，適當(dāng)減少化肥的用量，配合適量的生物菌劑可以有效提高大豆產(chǎn)量，降低成本。馬鳴超等[6]發(fā)現(xiàn)，對大豆施用膠質(zhì)類芽孢桿菌和慢生大豆根瘤菌的復(fù)合菌劑不但能夠改善大豆品質(zhì)，增加大豆產(chǎn)量，還能提高土壤肥力，改善土壤微生物區(qū)系。因此，施用微生物肥料是一種具有良好應(yīng)用前景的施肥方式。

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)因其可以通過固氮、溶磷、解鉀及產(chǎn)生抗生物質(zhì)促進(jìn)植物生長，提高植株抗病性和抗逆性等功能[7]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)作為植物根際促生菌的一種，在促進(jìn)植物生長和改善土壤環(huán)境方面有良好的效果。尹施淇[8]發(fā)現(xiàn)，用枯草芽孢桿菌菌劑部分代替化肥能夠改善土壤環(huán)境，提高辣椒對土壤養(yǎng)分的吸收能力。緱晶毅[9]研究認(rèn)為，施用枯草芽孢桿菌菌劑明顯提高了蒺藜苜蓿和白三葉草的葉綠素含量。

前人對枯草芽孢桿菌的研究主要集中在高效菌株的篩選和單獨(dú)施用枯草芽孢桿菌菌劑對植物和土壤的影響，而枯草芽孢桿菌與其他肥料聯(lián)合施用對植物和土壤的影響鮮有報道。本研究將枯草芽孢桿菌與多種肥料聯(lián)合施用，以大豆為研究對象，綜合評價各種肥料組合對大豆光合作用和土壤酶活的效果，以期篩選出最優(yōu)的肥料組合，為開發(fā)出適應(yīng)于東北黑土區(qū)大豆生產(chǎn)的微生物肥及減少化肥用量提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗樣地位于黑龍江省綏化市肇東市試驗基地(45°10′～46°20′N，125°22′～126°22′E)，試驗地屬寒溫帶氣候，年平均降水量為536 mm，全年無霜期平均在140天左右。試驗地土壤類型為黑鈣土，土壤pH為5.3，速效N、速效P、速效K含量分別為141.5 mg·kg-1、32.6 mg·kg-1及103.2 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量為37.9 g·kg-1。

1.2 試驗作物和肥料

供試作物大豆品種為黑農(nóng)252，市購；表1是供試肥料詳細(xì)信息，枯草芽孢桿菌與各肥料均為摻混使用。試驗中所用的菌株為本實驗室篩選獲得，菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ACCC11025。

表1 供試肥料信息Table 1 Information of test fertilizers

1.3 試驗設(shè)計

田間種植，共設(shè)6個處理，每個處理3次重復(fù)，共計18區(qū)，各區(qū)隨機(jī)分布。每個區(qū)面積667 m2，壟作，壟間距0.6 m，株距0.25 m，播種密度為4.2×105株· hm-2。其他管理措施同當(dāng)?shù)卮筇镆恢隆?/p>

1.4 測定項目

大豆菌根侵染率：采用Phillip[10]的酸性品紅染色方法測定。

大豆葉片光合參數(shù)：于大豆結(jié)莢期(7月29日)采用CL-3400手持光合測量系統(tǒng)(美國)測定各處理主莖功能葉(倒3葉)的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。

大豆葉片葉綠素含量：采用分光光度法測定葉綠素a和葉綠素b的含量以及總?cè)~綠素含量。

土壤酶活性：根據(jù)土壤標(biāo)準(zhǔn)采樣法，于大豆結(jié)莢期(7月29日)在每塊樣地用土鉆采集耕層(0～20 cm)土壤樣品1 kg。具體為每個小區(qū)隨機(jī)取10個樣品充分混合后帶回實驗室放入4 ℃冰箱保存。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定土壤中的蔗糖酶活性，結(jié)果用24 h以后1 g土壤中葡萄糖的毫克數(shù)表示(mg·g-1)；采用磷酸苯二鈉比色法測量土壤中堿性磷酸酶活性，結(jié)果用2 h后1 g土中釋放出的酚的毫克數(shù)表示(mg·g-1)；采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定土壤中脲酶活性，結(jié)果用24 h后1 g土中釋放的NH3-N-的毫克數(shù)表示(mg·g-1)[11]。對每個處理獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2016和SPSS 25.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用One-Way ANOVA分析和Duncan法進(jìn)行方差分析(P<0.05)，利用Excel 2016 軟件作圖。圖表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同肥料處理對大豆侵染率和葉片光合參數(shù)的影響

各處理的菌根侵染率均在90%以上(圖1)，說明各處理的大豆根系均能與叢枝菌根(AM)真菌建立良好的共生關(guān)系。菌根侵染率從大到小依次為T4>T3=T5>CK>T2>T1。各處理與CK的差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

注：不同小寫字母表示處理間在0.05水平上差異顯著。下同。Note:Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at P<0.05.The same is as below.圖1 不同肥料處理的大豆根系A(chǔ)M真菌侵染率Fig.1 Infection rates of AM fungi in soybean roots with different fertilizers

與CK相比，T2和T3處理的凈光合速率顯著降低了19.0%和16.3%(P<0.05，表2)，T2處理凈光合速率最低為11.9 μmol·m-2·s-1，T5為凈光合速率的最高為15.9 μmol·m-2·s-1。與CK相比，除T5處理的蒸騰速率顯著增加29.8%外，其他處理的蒸騰速率均顯著降低(P<0.05)。T5處理的氣孔導(dǎo)度較CK顯著增加32.0%，T2和T3處理分別顯著降低47.6%和39.5%(P<0.05)。除T2處理外，其余各處理的胞間CO2濃度與CK差異不顯著(P<0.05)。

表2 不同肥料處理大豆葉片光合參數(shù)Table 2 Photosynthetic parameters of soybean leaves with different fertilizers

各處理的葉綠素a含量，T2、T3與CK無顯著差異(P>0.05)(圖2)。T1處理的葉綠素a含量最高，比CK高17.3%，而T4、T5處理葉綠素a的含量較CK分別降低21.3%和24.0%，其中T5為葉綠素a含量最低。T4和T5處理的葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著低于CK(P<0.05)，其中，葉綠素b分別降低了32%和30.5%，總?cè)~綠素分別降低了25.1%和27.0%。

圖2 不同肥料處理大豆葉片葉綠素含量Fig.2 Chlorophyll contents of soybean leaves with different fertilizers

2.2 不同肥料處理對土壤酶活性的影響

各處理的土壤脲酶活性均顯著高于CK(P<0.05，圖3)，T1、T2、T3、T4、T5處理分別較CK增加了8%、12.5%、6.8%、8%和17.7%，但T1、T3和T4這3個處理之間無顯著差異。

土壤蔗糖酶從高到低依次為T1>T3>CK>T5>T4>T2，其中T1、T2和T3與CK有顯著差異(P<0.05，圖3)。T1處理土壤蔗糖酶活性最高，為9.29mg·g-1，較CK高18.9%；T2處理土壤蔗糖酶活性最低，為5.03 mg·g-1，比CK降低了28.7%。

各處理中，T1、T4處理的堿性磷酸酶活性較CK顯著增加了2.3%和7.0%(P<0.05，圖3)，T2和T5處理的堿性磷酸酶活性雖然有所提升，但不顯著(P>0.05)。T3處理的堿性磷酸酶活性最低僅為8.55 mg·g-1。

圖3 不同肥料處理對大豆土壤酶活性的影響Fig.3 Different fertilizers effects on soil enzyme activities of soybean

3 討論

植物生長和生物量生產(chǎn)的主要驅(qū)動力是光合作用，光合作用為植物提供生長發(fā)育所需的能量[12-13]。本研究結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌+氨基酸型有機(jī)肥(T1)、枯草芽孢菌秸稈腐熟有機(jī)肥(T4)和枯草芽孢桿菌雞糞腐熟有機(jī)肥(T5)處理的凈光合速率較CK提高了5.0%、0.7%和8.0%(表2)，說明含有枯草芽孢桿菌的生物有機(jī)肥可提高大豆葉片的凈光合速率。施用枯草芽孢桿菌與氨基酸顆粒的微生物復(fù)合肥能夠提高凈光合速率，可能有兩種原因：一方面氨基酸可以被作物直接吸收利用，植物通過吸收含有碳、氮等元素的小分子態(tài)氨基酸，為植物提供氮素養(yǎng)分[14]，同時參與植物體內(nèi)的能量代謝和有機(jī)體蛋白物質(zhì)的合成[15]，加速了植物體內(nèi)生理生化反應(yīng)的進(jìn)程，從而對植物生長發(fā)育起到促進(jìn)作用；另一方面氨基酸可以作為枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)物質(zhì)，保證菌株在土壤中擴(kuò)繁使其能夠充分發(fā)揮固氮作用，進(jìn)而提高土壤中可利用養(yǎng)分的含量，促進(jìn)植株對養(yǎng)分的吸收利用[16]。此外，凈光合速率與氣孔導(dǎo)度呈正相關(guān)關(guān)系，也說明枯草芽孢桿菌與氨基酸顆粒的聯(lián)合施用促進(jìn)了大豆葉片氣孔的開放，使較多的CO2能夠進(jìn)入到葉肉細(xì)胞中進(jìn)行同化，提高了葉片的凈光合速率，這與張亞等[17]的研究結(jié)果相似。施用枯草芽孢桿菌秸稈腐熟肥后提高了大豆的凈光合速率，可能是由于腐熟后的秸稈作為外源碳的加入導(dǎo)致土壤碳氮比增加，而微生物為了適應(yīng)碳氮比的變化，加速了對土壤有機(jī)質(zhì)的礦化，使土壤中大量固定的氮被釋放出來，從而提高了土壤的供氮能力[18]，菌株因獲得了充足的養(yǎng)分，使得其充分發(fā)揮固氮、溶磷和解鉀的作用，保證了植物的生長發(fā)育。唐志敏等[19]的試驗結(jié)果表明，秸稈還田可以促進(jìn)植物葉片氣孔的開放，提高葉片的光合速率，本研究的結(jié)果與之基本一致?？莶菅挎邨U菌雞糞腐熟有機(jī)肥提高凈光合速率的原因可能是枯草芽孢桿菌和雞糞的聯(lián)合作用，改善土壤的理化性質(zhì)，增強(qiáng)土壤的微生物活性，增加了有機(jī)質(zhì)含量，促進(jìn)了植株對養(yǎng)分的吸收，間接影響作物的光合生理代謝，這與孫運(yùn)杰等[20]在藍(lán)莓上的研究結(jié)果一致。

決定植物光合作用強(qiáng)弱的因素之一是葉綠素的含量[21]。不同肥料會改變作物的葉綠素含量，從而影響光合作用。本研究發(fā)現(xiàn)，各處理中僅枯草芽孢桿菌+氨基酸型有機(jī)肥(T1)處理的葉綠素含量高于CK，說明影響葉綠素含量的主要因素是與枯草芽孢桿菌聯(lián)合施用的其他肥料本身。

土壤酶活是土壤質(zhì)量及其健康的重要指標(biāo)，因為它們對土壤的自然變化或人為變化做出響應(yīng)[22]。對土壤酶活性的分析是確定作物生長和生產(chǎn)力最佳條件的關(guān)鍵因素之一。土壤脲酶活性代表將有機(jī)態(tài)土壤氮轉(zhuǎn)化為有效態(tài)的能力[23]。本研究中各處理的土壤脲酶活性均高于CK，說明枯草芽孢桿菌與其他肥料的組合均可提高土壤脲酶活，這與前人對土壤脲酶的研究結(jié)果基本一致[23-24]。其中枯草芽孢桿菌雞糞腐熟有機(jī)肥(T5)處理的脲酶活性最高，這可能是由于雞糞提供了更多的酶促反應(yīng)的底物，從而促進(jìn)了土壤微生物的生長，而土壤脲酶是土壤微生物生長代謝的產(chǎn)物。

蔗糖酶又叫轉(zhuǎn)化酶，它對增加土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)起著重要的作用，蔗糖酶活性與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含量及微生物數(shù)量有關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌+氨基酸型有機(jī)肥對蔗糖酶活性的提升效果最好，提高了18.9%，說明施用枯草芽孢桿菌+氨基酸型有機(jī)肥可提高土壤蔗糖酶活性。已有研究表明，枯草芽孢桿菌能夠提高土壤微生物活性和多樣性，增加土壤中細(xì)菌、放線菌和真菌的豐富度[25-26]，促進(jìn)胞外酶的分泌，此外可能是氨基酸肥的施用作為外源有機(jī)物質(zhì)輸入土壤后，改善了土壤的碳氮比，提高了微生物的活性，促進(jìn)了蔗糖酶的分泌，這與賈娟等[27]在松花菜上的研究結(jié)果基本一致。

堿性磷酸酶能促進(jìn)土壤有機(jī)磷化合物水解，生成能為植物利用的無機(jī)態(tài)磷[28]。本發(fā)現(xiàn)枯草芽孢菌秸稈腐熟有機(jī)肥(T4)處理的堿性磷酸酶活性最高，說明施用枯草芽孢桿菌秸稈腐熟肥夠提升土壤堿性磷酸活性。原因可能是秸稈中含有豐富的碳源，秸稈腐熟后能將其中的養(yǎng)分釋放出來，促進(jìn)土壤微生物繁殖，提高堿性磷酸酶活性，其次研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田能夠降低土壤對磷素的吸附[29]，增加土壤中速效磷的釋放[30]，進(jìn)而提高了堿性磷酸酶活性。

4 結(jié) 論

枯草芽孢桿菌+氨基酸型有機(jī)肥(T1)、枯草芽孢桿菌秸稈腐熟有機(jī)肥(T4)和枯草芽孢桿菌雞糞腐熟有機(jī)肥(T5)提高了大豆葉片光合參數(shù)、凈光合速率和土壤酶活性，具有提高土壤肥力，促進(jìn)植物生長，改善土壤環(huán)境的功能，有作為化肥的優(yōu)良替代品應(yīng)用的潛力，達(dá)到化肥減施、改善土壤環(huán)境、提高土壤肥力的目的，不建議枯草芽孢桿菌與化肥混施。