藻藍(lán)色素調(diào)控RIPK1對(duì)多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性的影響

郝 帥，李凡念，劉媛璞，李 爽，楊 起，李前程，王成濤

（北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京100048）

肺癌是目前最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)其腫瘤細(xì)胞的特征可以劃分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）兩大類[1]，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌發(fā)病率的80%以上，且轉(zhuǎn)移率和死亡率極高[2]，是目前人們關(guān)注的一類惡性腫瘤。目前對(duì)非小細(xì)胞肺癌最有效的治療手段是外科手術(shù)，然而許多患者在診斷時(shí)已為晚期，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，需借助放療、化療手段進(jìn)行治療[3]。盡管如此，5年存活率仍然只有16%[4]。非小細(xì)胞肺癌的有效治療已成為全世界廣泛關(guān)注的問(wèn)題。

近年來(lái)，許多海洋天然產(chǎn)物被證實(shí)具有廣譜的抗腫瘤活性，同時(shí)兼有高效、無(wú)毒、無(wú)副作用等特點(diǎn)，具有極大的藥物開(kāi)發(fā)的潛力，也是目前功能性食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[5]。藻藍(lán)蛋白（Phycocyanin，PC）是一類典型的功能性海洋天然產(chǎn)物。藻藍(lán)蛋白又稱為藻藍(lán)色素蛋白，是源于螺旋藻、藍(lán)藻等細(xì)胞中的藻膽蛋白（PBP）家族成員之一[6-7]，由α 亞基和β 亞基組成的水溶性色素蛋白復(fù)合體。根據(jù)我國(guó)GB2760-2014 《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，藻藍(lán)蛋白已被列為我國(guó)允許使用的天然食品著色劑[8]，在飲料、糕點(diǎn)、糖果等食品行業(yè)都有重要應(yīng)用。此外，國(guó)內(nèi)外研究表明，藻藍(lán)蛋白具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種生理功能[9-10]，是一種重要的食藥同源型食品添加劑。目前，藻藍(lán)蛋白的抗腫瘤活性是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一，相關(guān)研究顯示，藻藍(lán)蛋白對(duì)肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種癌細(xì)胞系均有不同程度的抑制效果[11-17]。其中肺癌，僅有文獻(xiàn)[18]～[20]研究了藻藍(lán)蛋白在非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞中的簡(jiǎn)單功能，其具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。深入探究藻藍(lán)蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控機(jī)制，能為藻藍(lán)蛋白的開(kāi)發(fā)利用和肺癌的治療奠定重要的理論基礎(chǔ)。

受體相互作用蛋白（receptor interacting protein，RIP）家族是一組能夠參與調(diào)控細(xì)胞增殖和炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶[21]，其中，受體相互作用蛋白激酶1（receptor interacting proteinkinase1，RIPK1）作為RIP 家族中的第一成員，在調(diào)控細(xì)胞增殖和程序性死亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[22]。近年研究發(fā)現(xiàn)，RIPK1 在許多腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，如朱廣偉[23]發(fā)現(xiàn)特異性沉默RIPK1 的表達(dá)能夠抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖。寧志豐等[24]通過(guò)研究證明沉默RIPK1 的表達(dá)能夠顯著降低膀胱癌細(xì)胞T24 的體外增殖能力、克隆形成能力和侵襲能力。譚詩(shī)云等[25]將大腸癌Lovo 細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染RIPK1 特異性小干擾RNA（siRNA），發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢、凋亡比例增加等現(xiàn)象。本研究中，對(duì)藻藍(lán)蛋白處理的H1299 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，旨在發(fā)現(xiàn)RIPK1 的表達(dá)差異。此外，為了深入研究藻藍(lán)蛋白在多種肺癌中的調(diào)控機(jī)理，以H1299、H460 以及LTEP-a-2 3 種非小細(xì)胞肺癌為模型，研究藻藍(lán)蛋白影響細(xì)胞增殖和凋亡的功能以及調(diào)控機(jī)制，為功能性食用色素藻藍(lán)蛋白的深度利用提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞株 人類非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞系（以下簡(jiǎn)稱H1299 細(xì)胞系）、NCI-H460 細(xì)胞系（以下簡(jiǎn)稱H460 細(xì)胞系）、LTEP-a-2 細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室（北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心）保存。

1.1.2 抗體 鼠抗β-Actin 抗體、兔抗RIPK1 抗體、兔抗Bax 抗體、鼠抗Bcl-2 抗體、抗鼠IgG 抗體、抗兔IgG 抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 試劑 純品藻藍(lán)蛋白，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)；胎牛血清，天津康源生物技術(shù)公司；1%青霉素-鏈霉素，美國(guó)Corning 公司；Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基；Lipofectamine 3000，美國(guó)Invitrogen 公司；FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒、SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版，天根生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；Western Blot 化學(xué)發(fā)光液、PVDF 膜，美國(guó)Millipore 公司；siRNA 陰性對(duì)照（以下簡(jiǎn)稱NC）、RIPK1 siRNA，上海吉瑪制藥有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Heraeus Eppendorf 公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀及膜轉(zhuǎn)印裝置，美國(guó)Bio-Rad 公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD 公司；SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD 公司；Tanon5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀，北京原平皓生物技術(shù)有限公司；X-Ray 洗片機(jī)，上海德沐泰鈳科貿(mào)有限公司；Phantom9900XL 掃描儀，MICROTEK 公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) H1299、H460、LTEP-a-2 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株培養(yǎng)基均由含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃、5% CO2恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，確保每次用于試驗(yàn)的細(xì)胞株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)最佳。

1.3.2 藻藍(lán)蛋白處理細(xì)胞 由于前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示4.8 μmol/L 藻藍(lán)蛋白處理的細(xì)胞效果明顯，因此本研究也采用此濃度處理細(xì)胞。稱取純品藻藍(lán)蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液，過(guò)濾除菌后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，配制4.8 μmol/L 濃度的培養(yǎng)基，用于處理3 種細(xì)胞株。放回細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 siRNA 的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 將處于最佳狀態(tài)的細(xì)胞鋪于60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中過(guò)夜培養(yǎng)，確保第2 天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度為30%～50%，且細(xì)胞單層均勻貼壁。配制siRNA-Lipofectamine 3000 混合物。首先取12.5 μL siRNA 加到125 μL Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基中輕柔混勻；取7.5 μL 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 溶于125 μL Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基中，同樣輕柔混勻；隨后將兩混合物混合，室溫孵育10 min，使siRNA-Lipofectamine 3000 混合物形成；最后將脂質(zhì)體混合物均勻滴加到細(xì)胞中，輕晃混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 藻藍(lán)蛋白處理的細(xì)胞增殖檢測(cè)：以5 000 個(gè)/孔細(xì)胞量將3 種細(xì)胞接種于96 孔板中，過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，加入4.8 μmol/L 藻藍(lán)蛋白處理，再加入10 μL MTT 溶液，6 h 后加入100 μL SDS-HCl 裂解液，12 h 后測(cè)定570 nm 處吸光值。連續(xù)測(cè)定5～6 d 吸光值并記錄數(shù)據(jù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值（OD 值）為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

轉(zhuǎn)染siRNA 的細(xì)胞增殖檢測(cè)：將轉(zhuǎn)染24 h 的RIPK1 siRNA、NC 的細(xì)胞鋪于96 孔板中，按照以上操作測(cè)定吸光值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集藻藍(lán)蛋白處理48 h的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染RIPK1 siRNA 48 h 的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105和1×106個(gè)/mL。取1 mL 細(xì)胞懸液，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入1 mL 冰浴預(yù)冷的PBS 緩沖溶液，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入250 μL 1×結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC 染色液，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min；加入5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI），輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)5 min；最后加入250 μL 1×Binding Buffer，利用流式細(xì)胞儀FITC 和PI通道檢測(cè)細(xì)胞凋亡的程度。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞早期、晚期凋亡比例。

1.3.6 提取細(xì)胞總RNA 并檢測(cè)RIPK1 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異 采用TRIZOL 法提取沉默RIPK1 的3 種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的總RNA，溶于DEPC 水中，-80 ℃保存。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物cDNA 作為熒光定量PCR 試驗(yàn)的模板，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染siRNA-RIPK1 和NC 的細(xì)胞株中RIPK1 基因在轉(zhuǎn)錄水平上的沉默效果。熒光定量PCR 試驗(yàn)采用三步法進(jìn)行，反應(yīng)過(guò)程為：95 ℃2 min 的預(yù)變性，95 ℃30 s，60 ℃1 min，一共40 個(gè)循環(huán)。其引物序列見(jiàn)表1（內(nèi)參基因?yàn)镚APDH）。

表1 用于定量PCR 的引物序列表Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.7 Western Blot RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，收集藻藍(lán)蛋白處理72 h 的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染RIPK1 siRNA 72 h 的細(xì)胞，加兩倍于細(xì)胞沉淀體積的RIPA 裂解液，將裂解充分的細(xì)胞4 ℃、12 000 r/min 離心45 min，取其上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中備用，棄細(xì)胞沉淀。取出適量蛋白上清液，用于蛋白濃度測(cè)定。蛋白濃度采用Bradford 法測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算上樣量。向總蛋白上清液中加入6×蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水浴煮10 min 使蛋白變性。根據(jù)計(jì)算的上樣量分裝蛋白放置-80 ℃保存。

按照Marker、對(duì)照組、試驗(yàn)組蛋白依次上樣，用12% SDS-PAGE 膠分離蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，350 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。接下來(lái)按照檢測(cè)蛋白大小將蛋白剪膜，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，孵育一抗過(guò)夜。用TBST溶液清洗3～4 次，每次10 min，37 ℃恒溫孵育二抗40～60 min，再用TBST 溶液清洗3～4 次，孵化學(xué)發(fā)光液顯色，采用化學(xué)發(fā)光圖像分析儀對(duì)目的蛋白條帶曝光，保存圖片，分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理軟件采用Microsoft Excel 2010，作圖軟件為Origin 8.5，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。顯著性差異分析采用Student t-test 雙尾檢驗(yàn)分析，其中P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01 為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299、H460、LTEP-a-2 細(xì)胞增殖的影響

前期研究表明，4.8 μmol/L 藻藍(lán)蛋白對(duì)多種非小細(xì)胞肺癌具有較好的抑制效果，因此本研究采用此濃度做細(xì)胞試驗(yàn)。首先將藻藍(lán)蛋白處理的H1299、H460 及LTEP-a-2 細(xì)胞用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖能力。如圖1所示，與對(duì)照組相比（未經(jīng)過(guò)藻藍(lán)蛋白處理組），藻藍(lán)蛋白處理后，3 種細(xì)胞的體外增殖能力顯著降低，表明藻藍(lán)蛋白能夠有效抑制H1299，H460 及LTEP-a-2 細(xì)胞的生長(zhǎng)，這與和Bingula 等[18]和Li 等[19-20]在A549 細(xì)胞中的試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖1 藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299、H460、LTEP-a-2 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of C-phycocyanin on proliferation of NSCLC H1299，H460 and LTEP-a-2 cells

2.2 藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299、H460、LTEP-a-2 凋亡的影響

隨后，為證實(shí)藻藍(lán)蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，采用Annexin V-FITC/PI 染液對(duì)藻藍(lán)蛋白處理的細(xì)胞進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度。由圖2 可知，與對(duì)照組相比，藻藍(lán)蛋白處理后，3種細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡比例均顯著增加，表明藻藍(lán)蛋白能促進(jìn)H1299、H460 及LTEP-a-2細(xì)胞的凋亡。這一結(jié)果與圖1 中細(xì)胞增殖結(jié)果相佐證。

圖2 藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299、H460、LTEP-a-2 細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of C-phycocyanin on apoptosis of NSCLC H1299，H460 and LTEP-a-2 cells

2.3 藻藍(lán)蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌凋亡相關(guān)蛋白的影響

此外，在藻藍(lán)蛋白處理前、后的3 種細(xì)胞中檢測(cè)到兩個(gè)凋亡相關(guān)的經(jīng)典蛋白（Bax 和Bcl-2）的表達(dá)。Bax 是經(jīng)典的促凋亡蛋白，而B(niǎo)cl-2 具有抗凋亡作用。從圖3 可看出，與對(duì)照組相比，藻藍(lán)蛋白處理后3 種細(xì)胞中的Bax 蛋白均出現(xiàn)明顯上調(diào)，而B(niǎo)cl-2 蛋白明顯下調(diào)，這與圖2 的細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 藻藍(lán)蛋白處理非小細(xì)胞肺癌H1299、H460、LTEP-a-2 后Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)分析Fig.3 Analysis of Bax and Bcl-2 expressions in NSCLC H1299，H460 and LTEP-a-2 cells after C-phycocyanin treatment

2.4 藻藍(lán)蛋白處理H1299 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

在前期的研究中，采用藻藍(lán)蛋白處理H1299細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。分析結(jié)果表明，從轉(zhuǎn)錄組共篩選出1 521 個(gè)差異基因（圖4），其中710 個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因（紅色點(diǎn)表示），811 個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因（藍(lán)色點(diǎn)表示）。其中，RIPK1 在藻藍(lán)蛋白處理后出現(xiàn)極顯著下調(diào)（下調(diào)比例接近80%），是一個(gè)重要的差異調(diào)控基因（圖4）。由于RIPK1 能夠參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此猜想RIPK1 可能在藻藍(lán)蛋白影響非小細(xì)胞肺癌增殖和凋亡過(guò)程中擔(dān)任重要角色。隨后，對(duì)藻藍(lán)蛋白的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。

圖4 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析Fig.4 Transcriptome analysis result

2.5 定量qRT-PCR 轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證

基于轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，采用定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)RIPK1 的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證。由圖5所示，與對(duì)照組相比，藻藍(lán)蛋白處理后，RIPK1 在H1299、H460 和LTEP-a-2 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低（降低比例超過(guò)90%），表明藻藍(lán)蛋白能夠抑制RIPK1 基因在3 種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，這與轉(zhuǎn)錄組的篩選結(jié)果一致。

2.6 RIPK1 特異性小干擾RNA（RIPK1 siRNA）的轉(zhuǎn)染效果

以上研究結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白能抑制3 種細(xì)胞的體外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且顯著降低RIPK1 基因的轉(zhuǎn)錄水平，因此推測(cè)藻藍(lán)蛋白可能通過(guò)下調(diào)RIPK1 的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。隨后，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA）的手段特異性沉默RIPK1 的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行測(cè)定。圖6 顯示siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后RIPK1 表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果。H1299、H460 和LTEP-a-2 細(xì)胞沉默RIPK1 后，分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平得到明顯的沉默效果，這也進(jìn)一步為后續(xù)細(xì)胞增殖和凋亡驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

圖5 RIPK1 表達(dá)量的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果驗(yàn)證Fig.5 Validation of RIPK1 expression in transcriptome results

圖6 RIPK1 小干擾RNA 在3 種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果Fig.6 Transfection effect analysis of RIPK1 siRNA in three cells

2.7 沉默RIPK1 對(duì)3 種非小細(xì)胞肺癌增殖的影響

siRNA 沉默RIPK1 后，首先對(duì)3 種細(xì)胞的體外增殖能力進(jìn)行驗(yàn)證。由圖7 可知，干預(yù)RIPK1蛋白的表達(dá)均抑制了3 種細(xì)胞的體外生長(zhǎng)能力。沉默RIPK1 后從第1 天（H460 和LTEP-a-2 細(xì)胞）或第2 天（H1299 細(xì)胞）開(kāi)始，細(xì)胞的增殖數(shù)量就顯著低于對(duì)照組。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，RIPK1 的表達(dá)干預(yù)確實(shí)能顯著影響H1299、H460 和LTEPa-23 種非小細(xì)胞肺癌的體外增殖能力，也進(jìn)一步證實(shí)了RIPK1 在藻藍(lán)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制過(guò)程中參與了重要的調(diào)控作用。

2.8 沉默RIPK1 對(duì)3 種非小細(xì)胞肺癌凋亡的影響

此外，對(duì)沉默RIPK1 后的3 種細(xì)胞進(jìn)行凋亡程度的檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8。與對(duì)照組相比，除了H460 細(xì)胞的晚期凋亡比例沒(méi)有顯著差異外，干預(yù)RIPK1 的表達(dá)后，細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡比例均明顯增加，表明沉默RIPK1 后也能夠引起H1299、H460 和LTEP-a-2 細(xì)胞的凋亡，這與藻藍(lán)蛋白處理后的結(jié)果一致，也進(jìn)一步證實(shí)RIPK1 介導(dǎo)了藻藍(lán)蛋白誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程。

圖7 沉默RIPK1 對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299、H460、LTEP-a-2 增殖的影響Fig.7 Effect of silencing RIPK1 on proliferation of NSCLC H1299，H460 and LTEP-a-2 cells

圖8 沉默RIPK1 對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299、H460、LTEP-a-2 凋亡的影響Fig.8 Effect of silencing RIPK1 on apoptosis of NSCLC H1299，H460 and LTEP-a-2 cells

2.9 沉默RIPK1 對(duì)非小細(xì)胞肺癌凋亡相關(guān)蛋白的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)RIPK1 參與藻藍(lán)蛋白誘導(dǎo)3種非小細(xì)胞肺癌凋亡過(guò)程，對(duì)沉默RIPK1 后3 種細(xì)胞中的促凋亡蛋白Bax 和抑凋亡蛋白Bcl-2 進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖9。與對(duì)照組相比，Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)表現(xiàn)出不同程度的差異，總體來(lái)看，Bax 蛋白水平出現(xiàn)上調(diào)，Bcl-2 蛋白水平出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。Bcl-2/Bax 的比率傾向于引起細(xì)胞凋亡。這與圖8 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了RIPK1 通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 參與藻藍(lán)蛋白誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌凋亡的過(guò)程。

3 結(jié)論

本研究以3 種非小細(xì)胞肺癌H1299、H460 和LTEP-a-2 細(xì)胞為研究模型，對(duì)藻藍(lán)蛋白影響細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白能夠顯著抑制3 種細(xì)胞的體外增殖能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)其中一種細(xì)胞H1299 的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，RIPK1 在藻藍(lán)蛋白處理后出現(xiàn)極顯著下調(diào)。在3 種細(xì)胞中采用siRNA 小干擾RNA 特異性沉默RIPK1 的表達(dá)，顯著降低了RIPK1 的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平。此外，干預(yù)RIPK1 的表達(dá)也能夠顯著抑制3 種細(xì)胞的體外增殖能力，并顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，與藻藍(lán)蛋白處理細(xì)胞的表型結(jié)果一致。藻藍(lán)蛋白通過(guò)下調(diào)RIPK1 的表達(dá)而抑制H1299、H460 和LTEP-a-2 細(xì)胞的體外增殖能力，促進(jìn)其凋亡。

圖9 沉默RIPK1 后對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1299、H460、LTEP-a-2 中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)量的檢測(cè)Fig.9 Analysis of Bax and Bcl-2 expressions in NSCLC H1299，H460 and LTEP-a-2 cells after transfection with RIPK1 siRNA