嬰幼兒配方奶粉對(duì)人結(jié)腸腺癌系Caco-2細(xì)胞和SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞自由基水平的影響

丁亞男，高觀禎，汪惠勤，周建武，饒平凡

（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心 杭州310035）

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）是指機(jī)體內(nèi)活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）代謝失衡，ROS 濃度超過內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)抗氧化能力而產(chǎn)生的現(xiàn)象，過量的活性氧自由基會(huì)氧化生物大分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而損傷線粒體、溶酶體，引起細(xì)胞和機(jī)體的損傷[1]。氧化應(yīng)激與許多疾病都有著密切的關(guān)系，比如氧化應(yīng)激和不同病因的高血壓均存在密切關(guān)系[2]；氧化應(yīng)激是造成血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的主要因素；血糖水平與氧化應(yīng)激的程度密切相關(guān)；結(jié)腸上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致腸組織損傷[3]等。胃、腸道作為體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧與膳食抗氧化劑作用的第一場(chǎng)所，腸黏膜在吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)不斷暴露于各種外來抗原，此時(shí)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的胃、腸道黏膜細(xì)胞必須產(chǎn)生強(qiáng)有力的保護(hù)性免疫反應(yīng)，如分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、黏附因子等生物標(biāo)志物，以應(yīng)對(duì)各種致病性物質(zhì)侵襲[4]。

食物的攝入是影響人體氧化-還原平衡重要的因素之一，抗氧化食品及其抗氧化成分的研究也成為近年來的研究熱點(diǎn)。伴隨著抗氧化成分的研究，抗氧化能力的各種測(cè)定方法日益完善。體外的抗氧化能力評(píng)估方法可以分為胞外和胞內(nèi)2 種形式，胞外的方法包括2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽【Trolox equivalent antioxidant capacity/2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）assay，ABTS·+】、鐵離子還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）和氧自由基清除能力測(cè)定（Oxygen radical absorbance capacity，ORAC）等，其原理主要是通過測(cè)定樣品是否具有通過氫電子轉(zhuǎn)移（Hydrogen atom transfer，HAT）或單電子轉(zhuǎn)移（Single electron transfer，SET）途徑對(duì)自由基進(jìn)行猝滅的能力[5]。胞外抗氧化能力的整體評(píng)估效應(yīng)逐漸受到質(zhì)疑，很多研究認(rèn)為該方法不能完整體現(xiàn)受測(cè)樣品在生物系統(tǒng)內(nèi)的抗氧化能力[6]。近年來，一類基于細(xì)胞模型的胞內(nèi)抗氧化測(cè)定方法逐漸發(fā)展并得到廣泛的應(yīng)用。這種統(tǒng)稱為細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性測(cè)定方法（Cellular antioxidant activity assay，CAA）由Wolfe 等[7]和Wang 等[8]發(fā)展并完善，通常以Caco-2 和HepG2 細(xì)胞作為模型，可以對(duì)水果、蔬菜等食物的抗氧化能力做出較全面的評(píng)估[9-10]。

嬰幼兒體內(nèi)的氧化-還原平衡很大程度上依賴于攝入的母乳或者嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行調(diào)節(jié)[11]。對(duì)使用配方奶粉的嬰幼兒來說，嬰幼兒配方奶粉不僅提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，也是其食物抗氧化能力的唯一或主要來源。嬰幼兒配方奶粉的配方和生產(chǎn)過程中，受關(guān)注的不僅是營(yíng)養(yǎng)成分的含量和穩(wěn)定程度，還應(yīng)包含對(duì)其抗氧化能力的評(píng)估。

嬰幼兒配方奶粉是供3 歲以內(nèi)嬰幼兒食用的奶制品，它以牛乳或羊乳為主要原料，加入維生素和礦物質(zhì)等成分，使其營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)最大限度地接近母乳[12]。雖然世界衛(wèi)生組織（WHO）大力推薦母乳喂養(yǎng)，但是嬰幼兒配方奶粉仍有巨大的市場(chǎng)需求。在中國(guó)市場(chǎng)，特別是在2013年放開二胎政策后，嬰幼兒配方奶粉的需求逐年增高，預(yù)計(jì)未來繼續(xù)增長(zhǎng)[13]。牛奶中含有天然非酶抗氧化劑（如維生素A、C 等）、抗氧化酶類以及具有抗氧化作用的蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物[14]，配方奶粉中還額外添加了其它一些抗氧化劑。目前，乳制品大多以總抗氧化能力（Total antioxidative capacity）評(píng)估樣品，以ABTS·+、FRAP[15]和ORAC[16]等化學(xué)方法或紅外光譜等物理方法檢測(cè)，少有報(bào)道應(yīng)用CAA 法測(cè)定其胞內(nèi)抗氧化能力[17]。

本研究報(bào)道一種用于評(píng)估嬰幼兒配方奶粉的，基于巨噬細(xì)胞和Caco-2 細(xì)胞的CAA 胞內(nèi)抗氧化能力評(píng)估模型，這2 種細(xì)胞分別代表消化道黏膜系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞。對(duì)隨機(jī)選取的市售嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行胞內(nèi)抗氧化能力調(diào)查，以期獲得該配方奶粉對(duì)消化道上皮細(xì)胞及其黏膜免疫系統(tǒng)自由基水平的調(diào)節(jié)能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

5 種品牌一段嬰幼兒奶粉，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?；SD大鼠，4～8 周齡，雄性，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；人結(jié)腸腺癌系Caco-2 細(xì)胞，由中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、MEM、磷酸鹽緩沖液PBS、Hank’s 緩沖液（HBSS）、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素混合溶液、0.25%胰酶細(xì)胞消化液、MitoSOX Red 熒光染色液，Thermo Fisher 公司；二甲基亞砜（DMSO，細(xì)胞級(jí)）、2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、2，2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH），美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.3 儀器與設(shè)備

熒光倒置顯微鏡（DMI3000 B），美國(guó)Leica 公司；多功能鈣流檢測(cè)工作站（FlexStation 3），美國(guó)Molecular Devices 公司；電子分析天平（微量，XS105DU），Mettler Toledo 儀器（上海）有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（XMTD-8222），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 奶粉母液的配制 5 種配方奶粉中的必需成分（蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)）含量符合GB10765-2010，可選擇性成分的種類和添加量存在稍許差異。

稱取1 g 奶粉，加入5 mL 70 ℃的超純水中，攪拌并置于超聲水?。?0 ℃）5 min，促進(jìn)溶解均勻。獲得的奶粉溶液即200 mg/mL 母液，置于37℃水浴，待用。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.4.2.1 人結(jié)腸腺癌系Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸腺癌系Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)基為MEM，另含有12%胎牛血清、1%非必須氨基酸、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素。置于37 ℃，CO2含量為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞匯合度在70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。人結(jié)腸腺癌系Caco-2 細(xì)胞傳代數(shù)在15～20 之間。

1.4.2.2 原代腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 將SD 大鼠脫頸處死，在75%乙醇溶液中浸泡5 min。將大鼠倒立提起30 s，置于無菌操作臺(tái)上，從腹腔左下角注入不含血清的DMEM 維持液10 mL，仰臥平放大鼠，輕輕揉大鼠腹部后靜置5 min。小心打開大鼠腹腔皮層，用針管注射器輕輕探入腹腔并抽取體液，吸取過程中需小心，避免刺到肌肉或組織而使紅細(xì)胞混雜于體液中。將得到的8～9 mL 體液移入無菌離心管中，于25 ℃條件下400×g 離心5 min。將沉淀用含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素DMEM 培養(yǎng)基重懸，即為細(xì)胞懸液，根據(jù)試驗(yàn)需要調(diào)整細(xì)胞濃度，接種到培養(yǎng)瓶中用于試驗(yàn)。

1.4.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的密度調(diào)至5×105cell/mL 后，接種于透明96 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液200 μL，置37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待80%細(xì)胞融合后，分為對(duì)照組、空白對(duì)照組和樣品組，分別加入樣品后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出，在每孔中加入20 μL，5 mg/mL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后，每孔中加入180 μL DMSO 溶解的紫色的甲瓚晶體，振蕩培養(yǎng)10 min 后在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光值，測(cè)定波長(zhǎng)570 nm。根據(jù)公式（1）計(jì)算各組的細(xì)胞存活率。

式中，A0，A1，A2——分別代表空白對(duì)照組、對(duì)照和樣品組的吸光度。

1.4.4 細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性（CAA）檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的密度調(diào)至5×105cell/mL 后，接種于黑板透底的96 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液200 μL，置5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。待80%細(xì)胞融合后，移去殘余培養(yǎng)基，用PBS 清洗1 次，加入100 μL 含樣品的維持液，于5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)30 min。取出，每孔加入100 μL DCFH-DA 熒光探針（終濃度為25 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)30 min。移去殘余培養(yǎng)液，在每孔中加入150 μL HBSS 清洗1次，最后在每孔中加入100 μL，600 μmol/L AAPH溶液，然后立即于發(fā)射波長(zhǎng)538 nm，入射波長(zhǎng)485 nm 條件下測(cè)定熒光值，測(cè)定時(shí)間1 h，每5 min 測(cè)定3 個(gè)重復(fù)孔，生成動(dòng)力曲線。每個(gè)樣品梯度做3個(gè)平行孔，陽(yáng)性對(duì)照組和空白組做5 個(gè)平行孔。以維持液中的細(xì)胞為陰性對(duì)照，以AAPH 處理的細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)公式（2）計(jì)算各組CAA 值。

式中，∫SA——樣品組熒光曲線的積分下面積；∫CA——對(duì)照組熒光曲線的積分下面積。

1.4.5 胞漿ROS 檢測(cè) 細(xì)胞接種與CAA 法相同，待80%細(xì)胞融合后，移去殘余培養(yǎng)基，用PBS清洗1 次。每孔加入100 μL 含1 mg/mL 樣品的維持液（每個(gè)梯度做3 個(gè)平行孔，空白組做5 個(gè)平行孔）。在5% CO2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 h，移去殘余培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μL HBSS 清洗1次，再加入100 μL，10 μmol/L DCFH-DA 熒光探針溶液，孵育30 min，然后每孔加入150 μL HBSS清洗2 次，立即于發(fā)射波長(zhǎng)538 nm，入射波長(zhǎng)485 nm 條件下測(cè)定熒光值。根據(jù)公式（3）可以計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞內(nèi)的自由基清除率。

1.4.6 線粒體內(nèi)ROS 檢測(cè) 細(xì)胞接種與CAA 法相同，待80%細(xì)胞融合后，移去殘余培養(yǎng)基，用PBS 清洗1 次。每孔加入100 μL 含1 mg/mL 樣品的維持液（每個(gè)梯度做3 個(gè)平行孔，空白組做5 個(gè)平行孔）。于5% CO2，37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，移去殘余培養(yǎng)液，每孔加入150 μL HBSS，再移除HBSS，加入100 μL 2.5 μmol/L 線粒體超氧化物紅色熒光探針（MitoSOX Red）于37 ℃下染色10 min，吸出反應(yīng)液，加入150 μL HBSS 清洗2 次，用熒光倒置顯微鏡觀察線粒體內(nèi)自由基水平。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理與分析 相關(guān)試驗(yàn)均做3 次平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示。利用Microsoft Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，采用GraphPad Prism 5.0 軟件作圖，ImageJ軟件處理熒光圖像。顯微觀察試驗(yàn)做3 次平行，以確保試驗(yàn)的重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方奶粉對(duì)細(xì)胞存活率的影響

如圖1a所示，在質(zhì)量濃度10～4 400 μg/mL-1范圍，5 種嬰幼兒配方奶粉對(duì)Caco-2 細(xì)胞存活率均無明顯影響，既未造成細(xì)胞毒性，也未表現(xiàn)出對(duì)Caco-2 細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用。如圖1b所示，在巨噬細(xì)胞的MTT 測(cè)試中，質(zhì)量濃度為4 400 μg/mL 時(shí)，1，2，4 號(hào)及5 號(hào)配方奶粉樣品均表現(xiàn)出對(duì)巨噬細(xì)胞顯著的促生長(zhǎng)作用（P＜0.05）。在質(zhì)量濃度為1 100 μg/mL 時(shí)，1 號(hào)和2 號(hào)樣品也表現(xiàn)出對(duì)巨噬細(xì)胞顯著的促生長(zhǎng)作用（P＜0.05）。在其余受測(cè)質(zhì)量濃度下，5 種配方奶粉樣品對(duì)巨噬細(xì)胞存活率均無明顯影響。通過MTT 法評(píng)估5 種嬰幼兒配方奶粉對(duì)2 種細(xì)胞存活率的影響，在后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)中選取的配方奶粉質(zhì)量濃度在40～1 000 μg/mL范圍，以避免配方奶粉的細(xì)胞毒性或增殖作用對(duì)后續(xù)測(cè)試結(jié)果的影響。

2.2 配方奶粉的胞內(nèi)抗氧化活性

如圖2所示，在腹腔巨噬細(xì)胞和Caco-2 細(xì)胞的CAA 模型中，不同質(zhì)量濃度（0.04，0.20，1.00 mg/mL）下的5 種嬰幼兒配方奶粉均表現(xiàn)出不同程度的胞內(nèi)抗氧化活性。在2 種細(xì)胞的CAA 測(cè)定中，配方奶粉的抗氧化能力均表現(xiàn)出一定的質(zhì)量濃度相關(guān)性，質(zhì)量濃度越高的樣品表現(xiàn)出的胞內(nèi)抗氧化能力越強(qiáng)。相同的配方奶粉樣品在腹腔巨噬細(xì)胞和Caco-2 細(xì)胞的CAA 模型中分別表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。如圖2a所示，在Caco-2 細(xì)胞CAA 模型中，表現(xiàn)出最強(qiáng)胞內(nèi)抗氧化活性的是為5 號(hào)樣品（1 mg/mL），CAA 值分別達(dá)到56 個(gè)CAA單位。如圖2b所示，在巨噬細(xì)胞CAA 模型中3 號(hào)樣品表現(xiàn)出最強(qiáng)抗氧化活性，為63 個(gè)CAA 單位，在Caco-2 細(xì)胞的CAA 模型中其抗氧化值為53個(gè)CAA 單位。類似的，相同質(zhì)量濃度的同一樣品在2 個(gè)細(xì)胞系中的CAA 值均不同。

圖1 嬰幼兒配方奶粉對(duì)Caco-2 細(xì)胞（a）、腹腔巨噬細(xì)胞（b）存活率的影響Fig.1 Effects of infant formula milk powders on the survival rate of Caco-2 cells（a）and peritoneal macrophages（b）

如圖3所示，在Caco-2 和腹腔巨噬細(xì)胞2 種細(xì)胞CAA 模型中，質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的嬰幼兒配方奶粉的DCFH 氧化動(dòng)力學(xué)曲線有明顯不同，表現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)特征。在圖3a Caco-2 細(xì)胞模型中，自由基清除速率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，而圖3b 腹腔巨噬細(xì)胞模型中，自由基清除速率基本保持一致。

圖2 嬰幼兒配方奶粉在Caco-2 細(xì)胞（a）、腹腔巨噬細(xì)胞（b）中的抗氧化力Fig.2 Antioxidant capacity（in CAA units）of infant formula milk powders in Caco-2 cells（a）and peritoneal macrophages（b）

圖3 嬰幼兒配方奶粉對(duì)Caco-2 細(xì)胞（a）、腹腔巨噬細(xì)胞（b）過氧化氫自由基氧化DCFH 的動(dòng)力學(xué)曲線圖（±s，n=3）Fig.3 Effects of infant formula milk powders on the kinetics of the oxidation of DCFH by hydroxyl radical on Caco-2 cells（a）and peritoneal macrophages（b）（±s，n=3）

2.3 配方奶粉清除細(xì)胞內(nèi)自由基能力

熒光染料DCFH-DA 是一種廣泛使用的自由基捕獲劑[18]，它進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞膜中脂酶水解成DCFH，隨后被細(xì)胞內(nèi)的ROS 氧化生成具有熒光的DCF-。通過檢測(cè)DCF-熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞胞漿的ROS 含量[19]。

圖4 顯示5 種嬰幼兒配方奶粉對(duì)胞內(nèi)自由基清除效率。對(duì)Caco-2 細(xì)胞胞內(nèi)自由基清除率最高的為1 號(hào)樣品。腹腔巨噬細(xì)胞中，胞內(nèi)自由基清除率最高的為3 號(hào)樣品。這二者的胞內(nèi)自由基清除率都超過30%。出乎意料的是，在CAA 模型中表現(xiàn)出具有抗氧化活性的受測(cè)奶粉并未完全表現(xiàn)出胞內(nèi)自由基清除能力。無論對(duì)Caco-2 細(xì)胞還是腹腔巨噬細(xì)胞，2 號(hào)與4 號(hào)樣品均未表現(xiàn)出胞內(nèi)自由基清除能力，反而使胞漿自由基含量升高。

2.4 配方奶粉對(duì)線粒體內(nèi)自由基的影響

線粒體不僅是能量物質(zhì)ATP 產(chǎn)生的場(chǎng)所，也是活性氧ROS 的主要來源，同時(shí)也是細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的靶器官[20]。為了探明配方奶粉調(diào)整的胞內(nèi)自由基和線粒體自由基之間的關(guān)系，進(jìn)一步調(diào)查了配方奶粉對(duì)線粒體活性氧自由基的影響。

線粒體超氧化物紅色熒光探針（MitoSOX Red）是活性氧ROS 特異性熒光指示劑，其熒光強(qiáng)度和線粒體內(nèi)的ROS 濃度成正比，可用于線粒體內(nèi)ROS 水平的檢測(cè)。由圖5、6 和7 可知，在腹腔巨噬細(xì)胞和Caco-2 細(xì)胞中，2 號(hào)和4 號(hào)樣品造成的紅色熒光強(qiáng)度都顯著高于對(duì)照組，而1 號(hào)、3 和5 號(hào)樣品造成的紅色熒光強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，這表明1 號(hào)、3 號(hào)和5 號(hào)樣品可降低線粒體活性氧自由基濃度，而2 號(hào)和4 號(hào)樣品則會(huì)增加線粒體活性氧自由基濃度。在腹腔巨噬細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞中，線粒體活性氧自由基造成的紅色熒光強(qiáng)度存在較大差異，腹腔巨噬細(xì)胞線粒體活性氧自由基水平相對(duì)較高，表現(xiàn)為線粒體超氧化物紅色熒光探針（MitoSOX Red）熒光強(qiáng)度高。配方奶粉對(duì)胞漿自由基濃度的影響及線粒體活性氧自由基濃度的影響有較好的相關(guān)性，胞內(nèi)自由基清除率最高的1 號(hào)和3 號(hào)樣品對(duì)線粒體活性氧自由基的清除能力也為最好，2 號(hào)和4 號(hào)樣品在影響胞內(nèi)自由基濃度上升的同時(shí)也影響線粒體活性氧自由基濃度上升。這樣的相關(guān)性提示配方奶粉對(duì)胞漿自由基濃度的改變是通過影響線粒體氧自由基濃度而實(shí)現(xiàn)的。

圖4 嬰幼兒配方奶粉對(duì)細(xì)胞內(nèi)自由基的清除率Fig.4 Free radicals scavenging rate within cells by infant formula milk powders

圖5 嬰幼兒配方奶粉對(duì)線粒體內(nèi)熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of infant formula milk powders on fluorescence intensity in mitochondria

圖6 嬰幼兒配方奶粉對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞線粒體內(nèi)自由基影響Fig.6 Effects of infant formula milk powders on free radicals in mitochondria of peritoneal macrophage

圖7 嬰幼兒配方奶粉對(duì)Caco-2 細(xì)胞線粒體內(nèi)自由基影響Fig.7 Effects of infant formula milk powders on free radicals in mitochondria of Caco-2 cells

3 結(jié)論與討論

CAA 法測(cè)抗氧化能力與其它化學(xué)分析法相比具有更高的生物相關(guān)性，試驗(yàn)結(jié)果更具有理論說服力和應(yīng)用價(jià)值[7]。研究者對(duì)CAA 法進(jìn)行不斷的調(diào)整和改進(jìn)，使其與受測(cè)樣品在體內(nèi)表現(xiàn)出的生理活性更匹配。1999年，Wang 等[8]使用H2O2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激的CAA 模型評(píng)價(jià)黃酮類化合物的抗氧化作用，后繼報(bào)道的CAA 模型中誘導(dǎo)劑由H2O2改為AAPH，PC12 細(xì)胞被改為HepG2和Caco-2 細(xì)胞[8，21-22]。方法改進(jìn)的目的不僅在于獲得更穩(wěn)定的結(jié)果，還在于能更好地反應(yīng)受測(cè)樣品的特性和生理活性。

嬰幼兒時(shí)期攝入的母乳或配方奶粉不僅需促進(jìn)嬰幼兒消化道黏膜系統(tǒng)（包括吸收和免疫功能）的完善，還需進(jìn)行體內(nèi)氧化-還原平衡的調(diào)節(jié)。本研究中選擇Caco-2 為細(xì)胞模型的原因在于：它具有腸細(xì)胞樣特征，常被用作腸上皮細(xì)胞的吸收模型，配方奶粉作用于Caco-2 細(xì)胞，表現(xiàn)出胞內(nèi)抗氧化活性，可能與嬰幼兒消化道黏膜吸收功能相關(guān)聯(lián)。另外，消化道黏膜不僅是營(yíng)養(yǎng)成分吸收的界面，也是對(duì)外來顆粒物質(zhì)吞噬和處理的界面。有研究顯示，食品中膠體顆?？梢酝ㄟ^與免疫細(xì)胞直接作用的方式，調(diào)節(jié)消化道黏膜免疫系統(tǒng)的氧化應(yīng)激水平[23]。奶制品富含膠體顆粒的事實(shí)眾所周知，它和消化道黏膜免疫系統(tǒng)的作用是必然的，這是本研究中選擇巨噬細(xì)胞作為模型的原因，以期能探明配方奶粉對(duì)消化道黏膜免疫系統(tǒng)氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)。

本研究隨機(jī)選取5 種市售一段嬰幼兒配方奶粉，在2 種細(xì)胞的CAA 模型中進(jìn)行胞內(nèi)抗氧化性的測(cè)試，結(jié)果表明，5 種配方奶粉在2 種細(xì)胞的CAA 模型中均表現(xiàn)出胞內(nèi)抗氧化活性，說明這5種配方奶粉均能促進(jìn)嬰幼兒消化道黏膜吸收和免疫功能的完善。CAA 值的差異較為明顯，說明不同配方及加工工藝的配方奶粉的胞內(nèi)抗氧化能力的存在差異性。

同時(shí)，本研究調(diào)查了配方奶粉對(duì)2 種細(xì)胞的胞漿及線粒體內(nèi)自由基濃度的調(diào)整能力。結(jié)果顯示，依照自由基濃度的調(diào)控方向，5 種配方奶粉可分為下調(diào)和上調(diào)自由基濃度2 種類型。其中，1號(hào)、3 號(hào)和5 號(hào)樣品對(duì)胞內(nèi)自由基和線粒體活性氧自由基均表現(xiàn)出明確的清除效果，而2 號(hào)及4號(hào)樣品明顯升高了胞內(nèi)自由基和線粒體活性氧自由基濃度。

2 號(hào)和4 號(hào)樣品在CAA 模型中的胞內(nèi)抗氧化活性與胞漿及線粒體自由基清除能力數(shù)據(jù)的差異，可能是不同氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞對(duì)抗氧化物質(zhì)的響應(yīng)程度不同所致。CAA 模型中通過加入外源性氧化劑AAPH 來提高胞內(nèi)自由基濃度[24]，體現(xiàn)在較高的氧化應(yīng)激狀態(tài)下配方奶粉的胞內(nèi)抗氧化作用，而不加AAPH 的細(xì)胞模型更好地體現(xiàn)了在較低的氧化應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)胞內(nèi)自由基水平的調(diào)節(jié)作用。這也提示CAA 模型的調(diào)整因素除了細(xì)胞類型、外源誘導(dǎo)劑類型外，外源誘導(dǎo)劑濃度或細(xì)胞內(nèi)的自由基濃度也應(yīng)考慮在內(nèi)。

誕生是從母體分離的過程，意味著嬰兒開始暴露于較高水平的氧化應(yīng)激環(huán)境中。在自身氧化-還原系統(tǒng)完善之前，嬰幼兒體內(nèi)的氧化應(yīng)激很大程度上只能依賴于攝入的母乳或者嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行調(diào)節(jié)[11]。在較高的氧化應(yīng)激水平下，攝入的母乳或配方奶粉具有一定的抗氧化能力，然而在尚未能達(dá)到平衡所需最低劑量時(shí)，體內(nèi)仍表現(xiàn)為氧化應(yīng)激狀態(tài)。從胞內(nèi)抗氧化結(jié)果來看，無論在較高或較低的氧化應(yīng)激水平，胞內(nèi)抗氧化活性不同的配方奶粉有可能產(chǎn)生截然不同的調(diào)節(jié)效果。

不同嬰幼兒配方奶粉的胞內(nèi)抗氧化能力的差異或許可以給我國(guó)消費(fèi)者人群中出現(xiàn)的“上火”癥狀提供些許解釋。有研究認(rèn)為“上火”是機(jī)體受到應(yīng)激因素刺激引起的一種維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)[25]。這種由于不同應(yīng)激原引起的體內(nèi)環(huán)境制約過程與抗氧化平衡狀態(tài)有一定相關(guān)性[26]。氧化應(yīng)激與炎癥是密切相關(guān)的生理過程，兩者往往相互促進(jìn)加劇[27]。然而，配方奶粉胞內(nèi)抗氧化能力表現(xiàn)不佳，不能直接等同于可能引起體內(nèi)的輕微炎癥反應(yīng)，還需進(jìn)一步用細(xì)胞或動(dòng)物的炎癥模型判定。

奶粉“上火”的機(jī)制尚未明確，有研究認(rèn)為奶粉噴霧干燥過程中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)破壞、結(jié)合水喪失，造成腸道黏膜受損，從而引起“上火”癥狀[28]。也有研究認(rèn)為，這是由于奶粉加工過程中產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物引起腸道炎癥[29]。無論如何，嬰幼兒配方奶粉使用過程中被認(rèn)知為“上火”的不良反應(yīng)確實(shí)存在，應(yīng)引起產(chǎn)業(yè)界的重視。在探明奶粉“上火”內(nèi)在機(jī)制之前，需建立一套完善的抗氧化模型對(duì)奶粉的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)估。貼近真實(shí)生理環(huán)境且全面的抗氧化模型對(duì)未來奶粉配方和加工工藝的調(diào)整都具有指導(dǎo)意義。