液相芯片技術(shù)進(jìn)展及在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用

陳錚錚，呂火烊

作者單位： 310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院

生物芯片技術(shù)是對(duì)生命體海量信息進(jìn)行檢測(cè)和分析的重要手段，生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片等。生物芯片雖在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的檢測(cè)、分析和研究中發(fā)揮了重要的作用，但仍存在較多不足。液相芯片技術(shù)因其所有反應(yīng)都在液相中完成，是集微球編碼技術(shù)、液流控制技術(shù)、激光技術(shù)、生物技術(shù)及數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)為一體的新型生物分子檢測(cè)技術(shù)。相比傳統(tǒng)固相生物芯片，液相芯片將固相平板載體替換為編碼微球，每個(gè)微球都攜帶一種可識(shí)別的編碼信息，以鑒別固定在其表面的探針。一旦微球表面探針種類被識(shí)別，探針?biāo)东@的靶分子就能被定性或定量分析，以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，液相芯片技術(shù)是最適宜的高通量多指標(biāo)檢測(cè)技術(shù)之一，本文擬對(duì)液相芯片技術(shù)的發(fā)展以及在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用做一綜述。

1 液相芯片技術(shù)的發(fā)展

液相芯片又稱懸浮芯片，最早是1997 年美國(guó)Luminex 公司開發(fā)研制的多功能分析平臺(tái)，其所有反應(yīng)都在液相中完成，有機(jī)地整合了熒光編碼微球技術(shù)、激光分析技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、高速數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)及計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則等多項(xiàng)最新科技成果，在同一平臺(tái)上即可完成蛋白質(zhì)和核酸的檢測(cè)等。液相芯片技術(shù)在保持高通量檢測(cè)的同時(shí)，將反應(yīng)體系由液相－固相反應(yīng)改變?yōu)榻咏锵到y(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的擬液相反應(yīng)體系，有效確保了生物分子間的特異性反應(yīng)，發(fā)生在正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)之上，大大提高了生物分子反應(yīng)效率，縮短了檢測(cè)時(shí)間。通過不同染色功能化微球，快速對(duì)一個(gè)樣本進(jìn)行多重檢測(cè)和分析。

在此基礎(chǔ)上Luminex 公司已研發(fā)出多種商品化的微球以供用于免疫和分子檢測(cè)試劑的開發(fā)。最初的xMAP 微球根據(jù)內(nèi)部?jī)煞N熒光染料的光譜特征進(jìn)行區(qū)分，可提供100 種光譜不同的微陣列，進(jìn)一步使用3 種熒光染料將微陣列擴(kuò)增至500 種。根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景的不同，開發(fā)出了系列微球，如直徑5.6m 的未包被Microplex裸球?yàn)榫郾揭蚁┪⑶?，攜帶羧基可共價(jià)結(jié)合捕獲分子，提供500 種不同的顏色組合。LumAvidin微球表面包被抗生物素蛋白，能夠結(jié)合生物素化的捕獲試劑，使待測(cè)分子因生物素和生物素蛋白間隔遠(yuǎn)離微球表面，反應(yīng)空間更加舒展。SeroMAP 是針對(duì)血清學(xué)檢測(cè)中出現(xiàn)的高背景而專門研發(fā)的微球，羧基化的微球可提供100 種不同的顏色組合，可減少非特異性的結(jié)合。MagPlex 是直徑為5.6m 的超順磁性微球，表面具有羧基功能基團(tuán)，可提供500 種不同顏色的組合，可通過磁力作用與溶液分離，易于自動(dòng)化和洗滌。

在不同熒光編碼的微球上可進(jìn)行抗原、抗體、酶、底物、配體、受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)。通過紅、綠兩束激光分別檢測(cè)微球編碼和報(bào)告熒光來達(dá)到定性和定量的目的，一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100 種不同的生物學(xué)反應(yīng)。迄今為止，全球已有數(shù)百套基于xMAP技術(shù)的檢測(cè)試劑用于免疫學(xué)、蛋白質(zhì)、核酸檢測(cè)及基因研究等領(lǐng)域，該技術(shù)已成為一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究工具，是最早通過美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）認(rèn)證的用于臨床診斷的生物芯片技術(shù)，并逐漸成為一種高通量代表性技術(shù)。美國(guó)Applied Bio Code Inc 公司又提出了一種全新的數(shù)碼液相芯片技術(shù)，采取數(shù)碼磁珠作為編碼元素，將順磁性材料摻入具有生物兼容性的高分子聚合物內(nèi)，通過光刻法將12 位二進(jìn)制的數(shù)字條碼刻到磁珠上，通過這種工藝制備得到4 096 種不同編碼的數(shù)碼磁珠，將蛋白、抗體或核酸分子偶聯(lián)在特定的磁珠上，通過特定的數(shù)碼液相芯片檢測(cè)儀器精準(zhǔn)識(shí)別數(shù)碼磁珠上的數(shù)字條碼信號(hào)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高通量多指標(biāo)的檢測(cè)。通過光刻法制備的數(shù)碼磁珠，其批間差小，且具有極穩(wěn)定的表面化學(xué)特性，同時(shí)數(shù)碼磁珠上的條形碼圖案可以提供強(qiáng)對(duì)比度的信號(hào)，保證使用數(shù)碼液相芯片技術(shù)得到更加精準(zhǔn)且穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。

2 液相芯片技術(shù)的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)

2.1 高通量 可對(duì)同一樣本中的多種不同待測(cè)分子同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)、定性、定量分析。在不存在交叉反應(yīng)的情況下，檢測(cè)的通量等于編碼微球的種類數(shù)，理論上最多可達(dá)到上百甚至上千種，可以真正實(shí)現(xiàn)高通量、多指標(biāo)的快速檢測(cè)。

2.2 樣本用量少 由于在同一個(gè)反應(yīng)孔中可以同時(shí)完成幾十種不同的生物學(xué)反應(yīng)，大大節(jié)省了樣本用量，少至0.1l 的樣本即可檢測(cè)，非常適合分析微小體積尤其是稀有樣品。

2.3 操作簡(jiǎn)單、快速 由于是基于液相反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)速度快，孵育時(shí)間大為縮短。免疫學(xué)分析可在1 ～2 h內(nèi)完成檢測(cè)，核酸雜交分析在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增后1 h 內(nèi)可得到結(jié)果。不需要洗滌即可直接讀數(shù)，計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)換能力強(qiáng)，可迅速得出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，約1 h內(nèi)即可完成96 個(gè)樣品的檢測(cè)，給出9 600 個(gè)數(shù)據(jù)，檢測(cè)效率大為提高。

2.4 靈敏度高 液相反應(yīng)環(huán)境有利于保持蛋白質(zhì)等的天然結(jié)構(gòu)，有利于探針和檢測(cè)物之間的反應(yīng)。微球表面積大，每個(gè)微球上可包被105～106個(gè)捕獲抗體，高密度的捕獲抗體保證了最大程度地與樣本中的抗原分子結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度，最低檢測(cè)濃度可達(dá)0.1pg/ml。

2.5 檢測(cè)范圍廣 可達(dá)3 ～5 個(gè)數(shù)量級(jí)，且樣品無需濃縮或稀釋。

2.6 特異性強(qiáng) 無需洗滌即可將與微球結(jié)合的和未結(jié)合的分子區(qū)分開來，只讀取單個(gè)微球上的熒光信號(hào)，信噪比好。兩束激光分別分析微球上的熒光和待測(cè)分子上報(bào)告分子的熒光，并且激光只分析一定半徑微球上的信號(hào)，檢測(cè)特異性強(qiáng)，背景信號(hào)低。

2.7 準(zhǔn)確性高 采用熒光區(qū)分熒光編碼微球，每個(gè)微球都可高密度的共價(jià)結(jié)合探針分子，產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)，微球上的報(bào)告分子熒光強(qiáng)度與結(jié)合的待測(cè)分子呈正比，且液相芯片技術(shù)的檢測(cè)范圍廣而減小誤差。

2.8 重復(fù)性好 液相芯片技術(shù)中的熒光讀值更加直接、穩(wěn)定、靈敏，因每種微球檢測(cè)100 個(gè)，取熒光強(qiáng)度中值作為結(jié)果，相當(dāng)于對(duì)每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)了100次，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性大為提高。

2.9 成本低 同時(shí)檢測(cè)一個(gè)樣本中的多項(xiàng)指標(biāo)可節(jié)約時(shí)間、樣本、試劑、耗材和勞動(dòng)，降低檢測(cè)成本，同時(shí)提高分析效率，還可隨檢測(cè)指標(biāo)的增加進(jìn)一步降低費(fèi)用。

2.10 靈活性好 微球表面可以包被各種特異性探針，如抗原、抗體、寡核苷酸、酶底物或者受體，應(yīng)用于免疫測(cè)定、酶學(xué)檢驗(yàn)等分子生物學(xué)研究的多個(gè)方面，商品化試劑盒的使用者只需增減探針交聯(lián)微球和標(biāo)記分子即可滿足不同檢測(cè)項(xiàng)目的需要?？蓱?yīng)用于分子診斷、免疫診斷、伴隨診斷、個(gè)體化醫(yī)療及生命科學(xué)研究等。

3 國(guó)內(nèi)液相芯片技術(shù)發(fā)展的現(xiàn)狀

由于具有高性能的熒光編碼微球制備過程復(fù)雜、涉及到多學(xué)科交叉、技術(shù)門檻很高，屬于體外診斷領(lǐng)域最為高精尖技術(shù)之一，國(guó)際上基本被Luminex 所壟斷。早期以美國(guó)Luminex 為代表的國(guó)外液相芯片技術(shù)以專利授權(quán)或合作形式進(jìn)入中國(guó)，國(guó)內(nèi)液相生物芯片技術(shù)起步較晚，其中較為出名的是上海透景生命科技股份有限公司，作為國(guó)內(nèi)最早和Luminex授權(quán)與合作的公司，現(xiàn)已推出了多腫瘤標(biāo)志物、人乳頭瘤病毒（HPV）的聯(lián)檢測(cè)試劑盒、優(yōu)生優(yōu)育試劑盒等。

另一些國(guó)內(nèi)公司以新的技術(shù)路線，在多維編碼微球及熒光信號(hào)智能采集處理等方面進(jìn)行創(chuàng)新，逐漸打破國(guó)外公司的技術(shù)壁壘，建立起中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的液相生物芯片技術(shù)體系。另外，研究者根據(jù)研究需要自行制備探針微球交聯(lián)微球，建立反應(yīng)體系對(duì)各種標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

雖然以美國(guó)Luminex 成為液相芯片技術(shù)的代表，也是最適宜的高通量、多指標(biāo)生物檢測(cè)技術(shù)發(fā)展方向之一，但仍然存在制約其發(fā)展的瓶頸。如編碼微球在制備時(shí)，將具有不同特性的熒光材料同時(shí)裝載在微球內(nèi)部或者表面，幾種不同熒光特性的材料相互靠近會(huì)發(fā)生相互作用甚至干擾，從而影響編碼的精準(zhǔn)性。由于微球空間的限制以及將熒光元素同時(shí)裝載在微球內(nèi)部或者表面的方式，必須采用裝載特性相互兼容的熒光材料，限制了可用于編碼的熒光材料的選擇范圍與編碼容量。中翰盛泰生物技術(shù)股份有限公司與上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院在液相芯片技術(shù)上提出了“基于主客體結(jié)構(gòu)的新型光學(xué)編碼微球新策略”，包含主體球和客體球兩個(gè)組成單元，每個(gè)組成單元都含有特定的編碼元素。以微米級(jí)顆粒為主體球，以納米顆粒為客體球，通過化學(xué)共價(jià)方式將大量客體熒光子球牢固結(jié)合至單個(gè)主體母球表面，獲得表面具有多級(jí)微納結(jié)構(gòu)的主-客體復(fù)合微球。通過改變主、客體球的種類和不同客體球的配比，對(duì)復(fù)合微球的熒光特性進(jìn)行精確調(diào)控。主、客體球中的編碼元素可以是有機(jī)染料、金屬化合物、量子點(diǎn)等多類新型熒光元素。這種新型編碼微球能有效避免不同熒光編碼元素之間的相互干擾。此外，不同主、客體球可以分別合成，將擴(kuò)大熒光編碼元素的選擇范圍，依據(jù)熒光編碼元素本身特點(diǎn)在最合適的條件下進(jìn)行單獨(dú)制備，并且具有多級(jí)微納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的復(fù)合微球相對(duì)于傳統(tǒng)光滑表面的微球具有更大的比表面積，為待測(cè)靶分子的固定提供更多結(jié)合位點(diǎn)，提高多指標(biāo)檢測(cè)的性能，并已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

4 液相芯片技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

4.1 細(xì)胞因子檢測(cè)方面的應(yīng)用 同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞因子可以全面判斷機(jī)體免疫功能，在疾病診斷、病程觀察及療效評(píng)價(jià)方面有重要意義，還能用于研究發(fā)病機(jī)制與藥物作用機(jī)制。

4.2 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方面的應(yīng)用 腫瘤標(biāo)志物是反映腫瘤存在的生物標(biāo)志物，其存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化及細(xì)胞功能，采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)肺癌、婦科腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌及宮頸癌中相關(guān)的癌基因，經(jīng)多項(xiàng)研究與化學(xué)發(fā)光法相比具有良好的相關(guān)性。

4.3 病原體檢測(cè)方面的應(yīng)用 如采用液相芯片快速檢測(cè)結(jié)核耐藥基因和常見細(xì)菌大環(huán)內(nèi)酯類和-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因，檢測(cè)幽門螺桿菌相關(guān)蛋白基因與臨床常見細(xì)菌大環(huán)內(nèi)酯類和 內(nèi)酰胺酶類耐藥基因，檢測(cè)乙型肝炎DNA、抗體和HBV 變異株，分別從蛋白質(zhì)和核酸水平對(duì)乙型肝炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)HPV病毒感染的疾病進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，為預(yù)防宮頸癌的發(fā)生提供一種早期診斷依據(jù)，設(shè)計(jì)針對(duì)禽流感病毒H5N1 亞型的檢測(cè)方法等。

4.4 基因檢測(cè)方面的應(yīng)用 只需在擴(kuò)增基礎(chǔ)上，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物采用液相芯片進(jìn)行分析即可，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、易掌握、結(jié)果穩(wěn)定可靠。如采用液相芯片技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR 基因突變，還可從男性不育、食管鱗癌、非小細(xì)胞癌及尖銳濕疣等方面采用液相芯片技術(shù)對(duì)相關(guān)基因突變進(jìn)行研究，采用液相芯片技術(shù)研究PCR-LDR 對(duì)KRAS 基因分型的關(guān)系，采用液相芯片法檢測(cè)人HLA 相關(guān)基因從而為腎移植術(shù)后監(jiān)測(cè)提供了依據(jù)，采用液相芯片檢測(cè)了青年女性胃癌組織和晚期胃癌患者的ERCC 1、TYMS、TUBB3 mRNA 的水平等。

除上述應(yīng)用以外，液相芯片技術(shù)還可用于激素、炎癥因子中醫(yī)癥型、中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、自身抗體、研究酶/底物與分析蛋白表達(dá)等方面。

5 液相芯片技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)與展望

鑒于液相芯片技術(shù)在核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的大規(guī)模分析中具有巨大的應(yīng)用潛力，還可用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體-配體識(shí)別分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及蛋白質(zhì)核酸相互作用分析等眾多領(lǐng)域的研究。隨著數(shù)字化技術(shù)的發(fā)展，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的升級(jí)與數(shù)據(jù)處理能力的提升，以及檢測(cè)流程自動(dòng)化水平的提高，并隨著人類對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)不斷深入，對(duì)疾病檢測(cè)不再僅僅依賴于單一指標(biāo)進(jìn)行診斷，而是將人體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)，利用多種指標(biāo)的組合對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后進(jìn)行更加精準(zhǔn)的檢測(cè)、判斷以及治療指導(dǎo)。作為最適宜多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的技術(shù)，將會(huì)在“遏制疾病，診斷先行”得到更廣發(fā)的推廣和使用，除了將在檢測(cè)醫(yī)學(xué)中發(fā)揮作用，還將會(huì)在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、新藥開發(fā)、司法鑒定和食品衛(wèi)生監(jiān)督等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。