山茱萸炮制前后的UPLC特征圖譜研究

林碧珊，陳錦霞，史紫娟，陳科成，曾杉

（國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東佛山528305）

山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）是山茱萸科山茱萸屬植物的成熟干燥果肉［1］，主產(chǎn)于我國(guó)安徽、陜西、浙江、河南等省。山茱萸具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的作用，主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等癥［2?4］。山茱萸的主要成分包括環(huán)烯醚萜苷類(lèi)、有機(jī)酸及其酯類(lèi)、五環(huán)三萜類(lèi)、鞣質(zhì)、多糖等，主要的苷類(lèi)成分有山茱萸苷、莫諾苷、馬錢(qián)苷、獐牙菜苷及山茱萸裂苷等，其中莫諾苷和馬錢(qián)苷是山茱萸中最主要的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分［5?7］。

目前，《中國(guó)藥典》中尚無(wú)區(qū)分山茱萸生品和炮制品的鑒別內(nèi)容，而文獻(xiàn)對(duì)山茱萸的研究多集中在其化學(xué)成分、藥理作用及含量測(cè)定上，對(duì)炮制前后藥材指紋圖譜的差異沒(méi)有系統(tǒng)分析方法，不能完整反映真實(shí)質(zhì)量，缺乏綜合有效的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［8］。采用中藥指紋圖譜可以較全面反映中藥材及其飲片所含成分的真實(shí)情況，適用于中藥的鑒別和質(zhì)量控制，本研究通過(guò)考察不同產(chǎn)地山茱萸炮制前后特征圖譜的變化，為山茱萸飲片在加工炮制過(guò)程中的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H?class UPLC高效液相色譜儀（PDA二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；AL104型電子天平（梅特勒?托利多公司）；KQ?500DE型數(shù)控超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；M MILLIPORE Syner?gy UV超純水儀（美國(guó)默克公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品：莫諾苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111998?201602）；馬錢(qián)苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111640?201707）；沒(méi)食子酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831?201605）；5?羥甲基糠醛（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110998?201608）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其他試劑均為市售分析純。

1.3 樣品

17批山茱萸藥材分別從河南、陜西、浙江、安徽等不同產(chǎn)地購(gòu)得，經(jīng)國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司按《中國(guó)藥典》2015年版檢驗(yàn)均合格，將檢驗(yàn)合格的17批藥材嚴(yán)格按照《中國(guó)藥典》2015年版一部酒萸肉飲片項(xiàng)下規(guī)定炮制成酒萸肉飲片。17批山茱萸生品、炮制品信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱：CORTECS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.6μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～3 min，2%→8%A；3～9 min，8%→15%A；9～13 min，15%→25%A；13～16 min，25%→100%A；16～19 min，100%A；19.1～23 min，2%A）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：1μL；理論塔板數(shù)按馬錢(qián)苷峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

表1 17批山茱萸生品、炮制品樣品信息Table 1 The Information about 17 batches of Cornusofficinalis Sieb.et Zucc of hygiene and processed products

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取莫諾苷對(duì)照品和馬錢(qián)苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加80%甲醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）制成每1 mL各含50μg的混合溶液。取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加入70%甲醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。取5?羥甲基糠醛對(duì)照品適量，精密稱定，加入70%甲醇制成每1 mL各含0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 精密稱取山茱萸生品和山茱萸炮制品各1份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，與空白溶劑按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，空白溶劑對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取山茱萸生品1份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰4（馬錢(qián)苷）為參照峰，以共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD值，結(jié)果均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取山茱萸生品1份,按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，以峰4（馬錢(qián)苷）為參照峰，以共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積計(jì)算RSD值，結(jié)果均小于1.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

A.空白溶劑;B.山茱萸藥材;C.酒萸肉飲片。圖1專屬性考察色譜圖Figure 1 The chromatograms of specificity

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密平行稱取山茱萸生品6份，按“2.3”項(xiàng)的方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰4（馬錢(qián)苷）為參照峰，以共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積計(jì)算RSD值，結(jié)果均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 山茱萸生品特征圖譜共有模式建立及分析

2.5.1 特征圖譜的建立 吸取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液和“2.3”項(xiàng)供試品溶液各1μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。經(jīng)與對(duì)照品進(jìn)行比較，確認(rèn)峰1為沒(méi)食子酸，峰2為5?羥甲基糠醛，峰3為莫諾苷，峰4為馬錢(qián)苷。

2.5.2 山茱萸生品特征圖譜共有模式建立 取“1.3”項(xiàng)17批不同來(lái)源的山茱萸生品，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，將各色譜峰匹配，建立特征圖譜，分析17批樣品的圖譜，選擇5個(gè)峰面積穩(wěn)定且分離度好的色譜峰，確定其為共有指紋峰，17批山茱萸生品UPLC特征圖譜共有模式圖見(jiàn)圖3。

2.6 山茱萸炮制品特征圖譜共有模式建立

取“1.3”項(xiàng)下的17批不同來(lái)源的山茱萸炮制品，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜，將各色譜峰匹配，建立特征圖譜，分析17批樣品的圖譜，選擇5個(gè)峰面積穩(wěn)定且分離度好的色譜峰，確定其為共有峰，17批山茱萸炮制品UPLC特征圖譜疊加圖譜見(jiàn)圖4。17批山茱萸生品、炮制品的對(duì)照?qǐng)D譜比較圖見(jiàn)圖5。

圖2 對(duì)照品及山茱萸生品色譜圖Figure 2 The chromatograms of control substance and Cornus officinalis Sieb.et Zucc of hygiene products

圖3 17批山茱萸生品特征圖譜共有模式Figure 3 The common pattern of 17 batches of Cornus offici?nalis Sieb.et Zucc of hygiene products

2.7 山茱萸炮制前后相似度分析

將17批山茱萸生品和炮制品圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以山茱萸生品圖譜為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行峰匹配，計(jì)算得到山茱萸生品和炮制品圖譜之間的相似度；同時(shí)以峰4（馬錢(qián)苷）為S峰，計(jì)算峰2（5?羥甲基糠醛）的相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，17批山茱萸炮制品與生品的相似度結(jié)果在0.754～0.994之間，表明山茱萸炮制前后色譜峰的構(gòu)成具有較高的相似性，用相似度無(wú)法區(qū)分山茱萸生品和炮制品；同時(shí)計(jì)算生品和炮制品峰2的相對(duì)峰面積；結(jié)果17批山茱萸生品峰2的相對(duì)峰面積在0.044～0.122之間，而炮制品峰2的相對(duì)峰面積在0.284～3.302之間，兩者有明顯的差異，表明山茱萸炮制后5?羥甲基糠醛（峰2）較生品明顯增大，可通過(guò)峰2的相對(duì)峰面積比值加以區(qū)分生品與炮制品。

圖4 17批山茱萸炮制品特征圖譜共有模式Figure 4 The common pattern of 17 batches of Cornus officinalis Sieb.et Zucc of processed products

圖5 山茱萸生品、炮制品對(duì)照特征圖譜Figure 5 The control chromatograms of Cornus officinalis Sieb.et Zucc of hygiene and processed products

3討論

考察了檢測(cè)波長(zhǎng)（210、240、260 nm）、流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈?0.2%磷酸、乙腈?0.1%磷酸、乙腈?0.1%甲酸溶液、乙腈?0.1%乙酸）及柱溫（30、35、40℃）的分離效果，結(jié)果以檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm、流動(dòng)相系統(tǒng)為乙腈?0.2%磷酸及柱溫為35℃時(shí)的分離效果較好。比較提取溶劑（水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇）、提取方式（超聲提取、回流提?。┘疤崛r(shí)間（30、45、60 min）的提取效果，結(jié)果以提取溶劑為50%甲醇、提取方式為超聲提取及提取時(shí)間為30 min時(shí)的提取效果較好。

表2 山茱萸炮制前后相似度和相對(duì)峰面積結(jié)果Table 2 Similarity and Relative peak area of Cornusofficinalis Sieb.et Zucc of processed products and hygiene products

中藥材在炮制過(guò)程可提高或降低藥材中化學(xué)成分的含量，甚至可使某些化學(xué)成分消失或產(chǎn)生新物質(zhì)，本研究的山茱萸藥材經(jīng)過(guò)炮制后化學(xué)成分的含量發(fā)生變化，其中5?羥甲基糠醛含量大幅度增加，呈10倍增加趨勢(shì)，說(shuō)明炮制程度越強(qiáng)其含量變化越大，可用于區(qū)分山茱萸生品和炮制品，也可用于指導(dǎo)山茱萸藥材的炮制。本文結(jié)果為山茱萸炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了一定的科學(xué)依據(jù)，也為山茱萸生品和炮制品的質(zhì)量控制提供了參考方法。