植物來(lái)源的黃酮類化合物抗體的制備和應(yīng)用研究進(jìn)展

趙靜，秦艷，左巍，崔永亮，焦必寧*

1(西南大學(xué)，柑桔研究所，重慶，400712)2(農(nóng)業(yè)部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)測(cè)試中心，重慶，400712)

黃酮類化合物是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，其作為強(qiáng)烈的抗氧化劑、自由基清除劑、二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑和脂質(zhì)過(guò)氧化劑，在抗病毒、消炎、降血脂、降血糖、抑菌和抗癌等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。最新研究顯示，某些黃酮類化合物能夠與新型冠狀肺炎病毒(SARS-CoV-2)的刺突蛋白、解旋酶和蛋白酶位點(diǎn)高親和力結(jié)合，具有預(yù)防或治療新型冠狀肺炎的潛力[2]。由于天然產(chǎn)物的化學(xué)多樣性和天然親和性，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)化的提取物形式還是基于中藥藥理特性的純化合物，都在新藥開(kāi)發(fā)中發(fā)揮著重要的作用。因此，迅速篩選出富含黃酮類化合物的植物對(duì)于推進(jìn)含有黃酮類化合物的保健食品或中成藥的研發(fā)進(jìn)程至關(guān)重要，但目前黃酮類化合物的檢測(cè)主要集中在儀器分析方面，儀器分析受限于昂貴的儀器和熟練操作的檢測(cè)人員，而免疫分析法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度高和分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常有潛力的檢測(cè)方法。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員在黃酮類化合物半抗原以及抗體制備這一領(lǐng)域做了大量的探索和研究，并取得了一定的進(jìn)展。

1 黃酮類化合物抗原和抗體的制備

1.1 黃酮類化合物半抗原及完全抗原的制備

從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，黃酮類化合物可看作是由C6-C3-C6構(gòu)成的一系列化合物的總稱，如圖1所示，其基本骨架是兩個(gè)苯環(huán)(A環(huán)與B環(huán))通過(guò)3個(gè)碳(C環(huán))相互連接而成。根據(jù)三碳鏈氧化程度、B環(huán)連接位置以及三碳鏈?zhǔn)欠癯森h(huán)等特點(diǎn)可將黃酮類化合物分為黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、查爾酮、二氫查爾酮、異黃酮、二氫異黃酮、高異黃酮、黃烷醇、花色素、雙苯吡酮等。

圖1 黃酮類化合物的基本骨架Fig.1 The structure of flavonoid

這些黃酮類化合物均屬于小分子化合物，而小分子化合物(相對(duì)分子質(zhì)量通常小于1 000 Da)由于分子體積和空間位阻的原因，通常只有一個(gè)T細(xì)胞表位而無(wú)B細(xì)胞表位，故只有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性，即它們只能與機(jī)體中的抗體或致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合而無(wú)法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該小分子的抗體或致敏淋巴細(xì)胞。因此黃酮類化合物需要與大分子結(jié)合變成完全抗原才能產(chǎn)生免疫原性。但大多數(shù)小分子化合物沒(méi)有能與大分子結(jié)合的基團(tuán)，針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，人們普遍將待測(cè)小分子化合物進(jìn)行衍生合成具有一定長(zhǎng)度碳鏈的小分子化合物即人工半抗原，再與載體蛋白結(jié)合成完全抗原，才能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體。

柚皮苷、甘草苷、蘆丁、牡荊素、斯皮諾素、大豆苷等黃酮類化合物本身含有糖基，可以采用高碘酸鈉法將糖環(huán)氧化成雙醛基，再與載體蛋白上的氨基進(jìn)行偶聯(lián)。橙皮素、柚皮素、槲皮素等黃酮類化合物雖然沒(méi)有糖基，但本身含有酚羥基和羰基，可以與琥珀酸酐、溴丁酸乙酯、O-(羧甲基)羥胺等化合物反應(yīng)衍生出含有羧基的半抗原，然后用碳二亞胺法[3]、活潑酯法[4]和混合酸酐法[5]與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)。

與半抗原偶聯(lián)的大分子物質(zhì)被稱為載體，載體與半抗原結(jié)合后就能產(chǎn)生免疫原性，因?yàn)閮烧咝纬傻拇蠓肿踊衔锬軌蛘T導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生新的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，進(jìn)而產(chǎn)生抗體。因此，載體決定了免疫應(yīng)答的特異性、融合的效率、特異性克隆的數(shù)目以及最終得到的抗體效價(jià)。最常用的載體為蛋白類，包括牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、人血清蛋白(human serum albumin，HSA)、兔血清蛋白(rabbit serum albumin，RSA)、卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)以及小鼠血清白蛋白(mouse serum albumin，MSA)、小鼠免疫球蛋白M(mouse immunoglobulin M，MIM)、破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid，TT)等。其他類型的載體還有多聚賴氨酸(poly-lysine，PLL)、羧甲基纖維素、聚乙烯比咯烷酮等。其中，BSA因其理化性質(zhì)穩(wěn)定、自由氨基多且價(jià)廉易得，在不同的pH和離子強(qiáng)度下以及在含某些有機(jī)溶劑的情況下仍保持較大的溶解度，常作為合成完全抗原的載體。而OVA由于其免疫原性較其他蛋白弱，可以作為無(wú)關(guān)的載體蛋白用于抗體的篩選和免疫測(cè)定，常被用作包被原。

1.2 黃酮類化合物抗體的制備

1.2.1 二氫黃酮類

目前已制備出抗體的二氫黃酮類化合物包括柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷和柚皮素等。柚皮苷主要存在于柚、葡萄柚、酸橙等其他常見(jiàn)的柑橘屬水果中，其具有緩解氧化應(yīng)激、炎癥、糖尿病等功效，且對(duì)骨再生、遺傳損傷、心血管疾病和代謝綜合征有多種藥理作用[6]。ZHANG等[7]使用高碘酸鈉法制備了柚皮苷的完全抗原，并通過(guò)免疫小鼠制備出抗柚皮苷單克隆抗體。蕓香柚皮苷主要存在于甜橙、寬皮柑橘和雜柑等柑橘屬水果中，其在治療阿爾茲海默癥方面有一定的潛力[8]。橙皮苷主要存在于甜橙、寬皮柑橘和檸檬等柑橘屬水果中，在薄荷、連翹和丹參等中藥中也能檢出[9]，它能夠保護(hù)肝臟免受炎癥和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的自然和化學(xué)毒素的損傷[10]，具有調(diào)節(jié)多種心血管疾病危險(xiǎn)因素的功效[11]，其與SARS-CoV-2主要細(xì)胞受體結(jié)合的親和力高于已經(jīng)推薦用于臨床試驗(yàn)的藥物[9]，且它與冠狀病毒“刺突”蛋白以及將病毒早期蛋白(pp1a和ppa1b)轉(zhuǎn)化為負(fù)責(zé)病毒復(fù)制復(fù)合物的主要蛋白酶結(jié)合的能量都低于臨床試驗(yàn)藥物，這表明橙皮苷具有有效的抗病毒作用[12]。LIU等[13]利用N,N′-羰基-二咪唑法制備出橙皮苷和蕓香柚皮苷的完全抗原，并通過(guò)免疫小鼠制備出特異性的單克隆抗體。所有柑橘類水果都含有黃烷酮苷配基橙皮素和柚皮素，但它們很少以游離苷元的形式存在于果實(shí)中。甜橙中主要的黃烷酮苷是橙皮苷和蕓香柚皮苷，而在酸橙中主要的兩種黃烷酮苷是新橙皮苷和柚皮苷。橙皮素和橙皮苷都被認(rèn)為與SARS-CoV-2的受體具有極強(qiáng)的結(jié)合能力，并具有顯著的抗炎活性，且能干擾冠狀病毒侵入和復(fù)制周期的不同階段，因此，有預(yù)防和治療新冠肺炎的潛力[2, 9]。柚皮素對(duì)咳嗽、痰和哮喘具有明顯的藥理作用[14]，更重要的是它對(duì)在SARS-CoV-2感染中可能起關(guān)鍵作用的溶酶體內(nèi)雙孔通道家族(two-pore channels，TPCs)有抑制作用，進(jìn)而阻斷SARS-CoV-2的傳播[15]，也有報(bào)道指出柚皮素可能通過(guò)抑制SARS-CoV-2主要蛋白酶、3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease，3CLpro)和降低血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受體活性來(lái)發(fā)揮治療作用[16]。SHINKARUK等[5]合成了橙皮素和柚皮素的8種羧酸半抗原，然后采用混合酸酐法制備出完全抗原，篩選出靈敏度較高的多克隆抗體抗-h4-橙皮素和抗-h4-柚皮素。甘草苷主要存在于中藥甘草中，它具有抗抑郁的功效[17]。FUJII等[18]采用高碘酸鈉法制備甘草苷-HSA和甘草苷-KLH，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)進(jìn)行鑒定和偶聯(lián)比的測(cè)定。其中，甘草苷-KLH作為免疫原免疫小鼠得到抗甘草苷單克隆抗體。

1.2.2 黃酮醇類

目前，黃酮醇類化合物中僅有槲皮素制備出了抗體。槲皮素存在于鐵皮石斛、銀杏等植物中，具有抗登革熱病毒[19]的功效。此外，VC和槲皮素協(xié)同作用能夠預(yù)防SARS-CoV-2感染，因此，可用來(lái)作為治療COVID-19患者的輔助藥物[20]。姜玲等[21]進(jìn)行琥珀酸酐反應(yīng)得到槲皮素中間體，再采用混合酸酐法合成槲皮素完全抗原，使用紅外光譜分析、紫外光譜分析以及薄層色譜分析方法進(jìn)行鑒定，基于成功合成的完全抗原制備出抗槲皮素多克隆抗體。

1.2.3 黃酮類

黃酮類化合物中川陳皮素、黃芩苷、蘆丁等已制備出了抗體。川陳皮素主要存在于寬皮柑橘和甜橙的果皮以及中藥陳皮和枳實(shí)中，其能夠抑制結(jié)腸直腸癌病變的幾個(gè)標(biāo)志性特征，主要包括阻止細(xì)胞周期形成、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻止腫瘤形成、減少炎癥作用和限制血管生成[22]。CUI等[4]先合成了川陳皮素的羧基衍生物，然后使用活性酯法偶聯(lián)蛋白得到完全抗原，免疫小鼠制得單克隆抗體。黃芩苷主要存在于中藥黃芩中，據(jù)報(bào)道，黃芩苷具有抗癌、抗菌和抗氧化的作用[23]。最新研究顯示，黃芩苷對(duì)SARS-CoV-2的主要蛋白酶(3CLpro)有明顯的抑制作用，即有抗該病毒的潛力[24]。KIDO等[25]利用碳二亞胺法合成了免疫原黃芩苷-BSA和包被原黃芩苷-人血清白蛋白，并使用MALDI-TOF-MS對(duì)其進(jìn)行鑒定。用免疫原免疫小鼠得到抗黃芩苷單克隆抗體。蘆丁存在于槐米、槐角、蕓香全草、紅旱蓮、蕎麥等植物中[26]。蘆丁在神經(jīng)退行性過(guò)程中有潛在的治療作用[27]，最新研究顯示，SARS-CoV-2主蛋白酶(Mpro)負(fù)責(zé)該病毒的蛋白水解突變，并對(duì)其生命周期至關(guān)重要，因此，抑制這種蛋白酶最終有可能消滅病毒，而蘆丁能夠有效抑制該酶[28]。包小燕等[26]采用高碘酸鈉法合成蘆丁完全抗原，用紫外掃描和SDS-PAGE對(duì)其進(jìn)行鑒定，以此抗原免疫健康雄性新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。牡荊素存在于狼尾草、山楂、木豆、綠豆、苔蘚、西番蓮、竹、含羞草、小麥葉片、蔓荊子中，其具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗痛覺(jué)過(guò)敏和神經(jīng)保護(hù)作用[29]，也具有作為治療阿爾茲海默癥的候選藥物的潛力[30]。馮盛嵐等[31]采用高碘酸鈉氧化法制備出牡荊素-BSA的免疫抗原和牡荊素-OVA的包被原，并用紫外分光光度法和薄層色譜法進(jìn)行鑒定，采用免疫抗原免疫小鼠得到多克隆抗體。木犀草苷主要存在于金銀花中，是金銀花質(zhì)量控制指標(biāo)之一[32]。它被用于治療包括發(fā)燒、關(guān)節(jié)炎和感染等多種疾病[33]，可能參與抑制SARS-CoV-2感染周期的關(guān)鍵蛋白(3CLpro)[34]。張波等[32]以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷為原料，通過(guò)活潑酯法制備出木犀草苷完全抗原并通過(guò)免疫小鼠得到木犀草苷高效價(jià)多克隆抗體。斯皮諾素存在于酸棗仁中，其可通過(guò)調(diào)節(jié)纖溶酶活性，減弱阿爾茲海默癥相關(guān)的突觸功能障礙，有治療阿爾茲海默癥的潛力[35]，也具有催眠和抗焦慮的藥效[36]。章飚等[37]以高碘酸鈉法制備出斯皮諾素完全抗原，通過(guò)免疫小鼠制備出多克隆抗體。

1.2.4 異黃酮類

目前已制備出抗體的異黃酮類化合物包括大豆苷和葛根素等。大豆苷主要存在于豆科植物中，大豆苷屬于大豆異黃酮，具有抗癌、降膽固醇、抗心血管疾病、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、抗骨質(zhì)疏松[38]等功能。QU等[39]采用高碘酸鈉法制備大豆苷完全抗原經(jīng)小鼠免疫得到抗大豆苷單克隆抗體。YUSAKUL等[40]采用曼尼希法制備大豆苷完全抗原，并通過(guò)MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定，用成功制備的完全抗原免疫小鼠得到特異性極好的單克隆抗體。葛根素主要存在于葛根中，具有抗氧化、抗炎、抗癌、降膽固醇、保護(hù)肝臟和神經(jīng)保護(hù)等作用，也是流感病毒神經(jīng)氨酸酶的有效抑制劑[41]。QU等[42]運(yùn)用高碘酸鈉法合成了葛根素完全抗原并免疫小鼠得到單克隆抗體。

2 黃酮類化合物抗體的應(yīng)用

黃酮類化合物的抗體主要應(yīng)用于多種免疫分析方法的建立，如酶聯(lián)免疫分析方法、免疫親和色譜方法、熒光免疫分析方法、免疫層析試紙條和Eastern blotting法等，可實(shí)現(xiàn)特定黃酮類化合物的定性定量檢測(cè)、“一步法”分離及定位等多種功能。

2.1 酶聯(lián)免疫分析方法

酶聯(lián)免疫分析方法是將抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)與酶的高效催化作用相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原或抗體的定性定量檢測(cè)，黃酮類化合物主要采用的是間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA)，ic-ELISA中包被的抗原先與非酶標(biāo)一抗結(jié)合，再引入酶標(biāo)二抗與一抗特異性結(jié)合，最后加入底物顯色。此外，也有學(xué)者開(kāi)發(fā)出雙抗夾心酶聯(lián)免疫分析方法，通過(guò)篩選出兩種不同的單克隆抗體同時(shí)結(jié)合在抗原的兩個(gè)不同表位，由于兩個(gè)表位之間的距離較大，不會(huì)影響抗原抗體之間的結(jié)合。ZHANG等[7]利用制備出的柚皮苷單克隆抗體建立ic-ELISA方法，在3.91～250 ng/mL能夠檢測(cè)到唾液中的柚皮苷，IC50值為52.25 ng/mL，最低檢測(cè)限為5.04 ng/mL。參考該抗體的制備方法，該課題組制備了兩種亞型的抗體[43]mAb1和mAb2，建立了雙抗夾心酶聯(lián)免疫分析方法，與ic-ELISA方法相比，靈敏度更高，最低檢測(cè)限達(dá)到了6.78 ng/mL。SHINKARUK等[5]利用制備的多克隆抗體抗-h4-橙皮素和抗-h4-柚皮素建立ic-ELISA，柚皮素抗體的IC50值和最低檢測(cè)限分別為0.98 ng/mL和0.12 ng/mL，橙皮素抗體的IC50值和最低檢測(cè)限分別為1.96 ng/mL和0.24 ng/mL。之后，制備添加有0.02%、0.05%和0.1%的橙皮素和柚皮素半合成食物來(lái)喂養(yǎng)小鼠，用建立的酶聯(lián)免疫分析方法測(cè)定飲食后對(duì)小鼠血漿和尿液中橙皮素和柚皮素的含量進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，其測(cè)定結(jié)果和高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果相吻合。FUJII等[18]利用抗甘草苷單克隆抗體，開(kāi)發(fā)出ic-ELISA方法，檢測(cè)限為0.39～25 μg/mL，加標(biāo)回收率為100.9%～103.7%，并對(duì)13種甘草制品中甘草苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果與HPLC一致。

CUI等[4]利用川陳皮素單克隆抗體，建立了ic-ELISA方法，線性范圍為0.52～12.3 ng/mL，IC50值為2.43 ng/mL，并對(duì)13種柑橘及4種柑橘屬中藥中的川陳皮素含量進(jìn)行了測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果與UPLC-MS/MS的測(cè)定結(jié)果相一致。KIDO等[25]利用抗黃芩苷單克隆抗體建立ic-ELISA方法,檢測(cè)限為200 ng/mL～2 μg/mL，平均加標(biāo)回收率為98.0%，對(duì)11種中藥中黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果與HPLC的測(cè)定結(jié)果相吻合。蘇歆等[3]利用黃芩苷單克隆抗體，建立ic-ELISA方法，在2.67～1 029.00 ng/mL能檢測(cè)到精制清開(kāi)靈注射液中的黃芩苷含量。包小燕等[26]制備的蘆丁多克隆抗體，特異性較好，基于該抗體建立競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法，經(jīng)方法學(xué)考察，靈敏度IC50值為5.37 mg/mL，最低檢測(cè)限為1 mg/mL，平均添加回收率為102%，但未進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)。馮盛嵐等[31]制備出牡荊素多克隆抗體，并建立ic-ELISA方法，線性檢測(cè)范圍為0.028 8～18 μg/mL，但未進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)。張波等[32]利用木犀草苷多克隆抗體，建立ic-ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，靈敏度IC50值為298.7 μg/mL，線性范圍為18.4～4 852.4 μg/L，雖未檢測(cè)實(shí)際樣品，但由于木犀草苷是金銀花質(zhì)量控制指標(biāo)之一，為金銀花的質(zhì)量控制提供了一種新方法。SAKAMOTO等[44]利用制備的大豆苷單克隆抗體建立ic-ELISA方法，檢測(cè)范圍為1.56～100 ng/mL，加標(biāo)回收率為98.99%～104.94%，并測(cè)定了幾種富含大豆黃酮的中草藥及大豆制品，測(cè)定結(jié)果與HPLC相吻合。QU等[39]基于抗大豆苷單克隆抗體建立ic-ELISA方法，IC50值為780.7 ng/mL，在10～10 000 ng/mL能夠檢測(cè)大豆苷的含量。QU等[42]基于抗葛根素單克隆抗體，建立了ic-ELISA方法，平均加標(biāo)回收率為101.4%，在10 ng/mL～1 μg/mL測(cè)定了8種中成藥中葛根素的含量，并使用HPLC進(jìn)行確證，結(jié)果具有一致性。基于該單克隆抗體，該課題組還建立了ic-ELISA方法進(jìn)行人唾液中葛根素的藥代動(dòng)力學(xué)研究[45]。

2.2 免疫親和色譜方法

免疫親和色譜方法(immunoaffinity chromatography，IAC)是基于免疫親和層析柱進(jìn)行天然產(chǎn)物分離和純化的方法，其與傳統(tǒng)的色譜方法相比，可大大簡(jiǎn)化預(yù)處理和分離過(guò)程。QU等[46]制備了柚皮苷免疫親和層析柱用于枳實(shí)中柚皮苷的選擇性提取和檢測(cè)，該柱子親和性良好，最多能結(jié)合250 μg的柚皮苷，而對(duì)其他化合物基本不吸附。LIU等[13]基于橙皮苷和蕓香柚皮苷的特異性單克隆抗體制備出免疫親和層析柱進(jìn)行中藥陳皮及其制劑的純化前處理，制備的免疫親和柱結(jié)合能力較好，橙皮苷和蕓香柚皮苷的結(jié)合能力分別為16 μg/mL和27 μg/mL，兩者提取的加標(biāo)回收率為94.05%～109.15%。QU等[39]使用抗大豆苷單克隆抗體制備了免疫親和層析柱，結(jié)果表明，該免疫親和柱能高效、特異地從豆科植物中分離與大豆苷結(jié)構(gòu)類似的大豆異黃酮。QU等[42]對(duì)抗葛根素單克隆抗體在免疫親和層析柱中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。最后，開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了將葛根素完全從其母體藥物中特異性剔除的方法，即knock-out提取物制備方法。

2.3 熒光免疫分析方法

熒光免疫分析方法是基于熒光素標(biāo)記的抗體建立的免疫分析方法，與常規(guī)的酶聯(lián)免疫分析方法相比，其反應(yīng)時(shí)間較短，縮短了反應(yīng)體系暴露于反應(yīng)溫度的時(shí)間降低了邊緣效應(yīng)導(dǎo)致的誤差。SHAN等[47]將異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記在抗黃芩苷單克隆抗體上建立了間接競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫分析方法，檢測(cè)限為6.4 ng/mL～500 μg/mL，相較于ic-ELISA方法的檢測(cè)限16～1 280 ng/mL，靈敏度顯著提高，并對(duì)中藥黃芩和柴胡中的黃芩苷含量進(jìn)行測(cè)定。

2.4 免疫層析試紙條

免疫層析試紙條即基于膜的橫向流動(dòng)免疫色譜條，常見(jiàn)的有膠體金試紙條和量子點(diǎn)試紙條，其二者的優(yōu)點(diǎn)均是大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序，避免了長(zhǎng)時(shí)間孵育和復(fù)雜的操作步驟，且方便易攜帶能夠?qū)崿F(xiàn)常規(guī)監(jiān)測(cè)大量樣品的目的。PAUDEL等[48]將膠體金標(biāo)記在抗黃芩苷抗體上，開(kāi)發(fā)出免疫層析試紙條聯(lián)合ic-ELISA快速一步檢測(cè)黃芩苷的方法，檢測(cè)限為200 ng/mL～2 μg/mL，檢測(cè)時(shí)間僅需15 min，但未進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)。QU等[49]采用量子點(diǎn)(qunrrtum dots,QDs)偶聯(lián)抗葛根素單克隆抗體形成探針建立了一種快速定量的側(cè)流免疫分析方法，其中，二抗固定在硝化纖維素膜的一端(質(zhì)控線)，而葛根素-BSA固定在另一端(檢測(cè)線)，在10 min內(nèi)能夠測(cè)定水中和生物樣品中的葛根素含量。該方法的檢測(cè)限為1～10 μg/mL，IC50值為75.58 ng/mL，定量限為5.8 ng/mL，加標(biāo)回收率為97.38%～116.56%。

2.5 Eastern blotting

Eastern blotting法是基于薄層色譜法和固相免疫技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的免疫染色分析方法。首先將目標(biāo)物通過(guò)薄層色譜法進(jìn)行分離，然后加入染料通過(guò)加熱的方法將薄層色譜法分離的化合物轉(zhuǎn)染至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜或聚醚砜濾(polyether sulfone，PES)膜上，加入與小分子偶聯(lián)的蛋白，在PVDF膜或PES膜上實(shí)現(xiàn)完全抗原的制備與包被，接下來(lái)加入目標(biāo)化合物的單克隆抗體及酶標(biāo)二抗通過(guò)抗原抗體的結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的可視化檢測(cè)。FUJII等[50]利用抗甘草苷單克隆抗體，開(kāi)發(fā)出Eastern blotting法，通過(guò)免疫染色，能夠在PES薄膜上顯示出樣品中甘草苷的含量，結(jié)合免疫組織化學(xué)定位技術(shù)實(shí)現(xiàn)了甘草苷在鮮甘草根中含量分布的可視化定位檢測(cè)。

3 結(jié)論與展望

在預(yù)防COVID-19的許多措施中，植物來(lái)源的黃酮類化合物的作用也被重視，一直以來(lái)，從植物中提取的活性化合物被稱為病毒抑制劑，且由于黃酮類化合物具有多效性和無(wú)全身毒性的優(yōu)勢(shì)，在未來(lái)的臨床試驗(yàn)中可能成為豐富抗新型冠狀病毒感染藥物庫(kù)的目標(biāo)化合物。因此，加快富含黃酮類化合物植物的篩選刻不容緩，免疫分析方法在常規(guī)檢測(cè)大量樣品中凸顯優(yōu)勢(shì)，值得大量開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要采用高碘酸鈉法、活潑酯法、碳二亞胺法制備黃酮類化合物的完全抗原，并通過(guò)免疫新西蘭大白兔和小鼠制備多克隆抗體和單克隆抗體。基于制備的抗體建立免疫分析方法，其中建立的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法能夠快速準(zhǔn)確地定量分析生物樣本或植物粗提取物中有效成分的含量并應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制和中藥藥代動(dòng)力學(xué)的研究。其次，可將單克隆抗體與固相載體相偶聯(lián)，制成免疫親和柱，應(yīng)用于復(fù)雜樣品的前處理以及knock-out提取物的制備。已制備出的黃酮類化合物的抗體為建立我國(guó)自己的黃酮類化合物單克隆抗體細(xì)胞庫(kù)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也使研制多種成分并行檢測(cè)抗體芯片成為可能。試紙條的研發(fā)可應(yīng)用于田間地頭、流通市場(chǎng)實(shí)現(xiàn)中藥材的現(xiàn)場(chǎng)真?zhèn)舞b別和快速分級(jí)，也可實(shí)現(xiàn)新資源考察時(shí)的野外作業(yè)現(xiàn)場(chǎng)初篩。

然而，植物中黃酮類化合物的免疫分析還存在諸多空白，大多數(shù)黃酮類化合物未制備出多克隆或單克隆抗體。有些化合物已制備出抗體但未建立免疫分析方法，有些雖然建立了免疫分析方法，但存在靈敏度低、特異性差、基質(zhì)干擾大等問(wèn)題，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。因此，未來(lái)我們可以從以下方面做出努力：

(1)擴(kuò)大黃酮類化合物的抗體數(shù)量，完善基于免疫芯片技術(shù)的中藥制劑致敏成分篩查體系。

(2)根據(jù)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)差異，設(shè)計(jì)合成新型半抗原，制備出靈敏度高、特異性強(qiáng)的抗體，降低基質(zhì)干擾，提高實(shí)際樣品檢測(cè)準(zhǔn)確度。

(3)開(kāi)發(fā)免疫傳感器，提高靈敏度，加大樣品測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù)，從而達(dá)到降低基質(zhì)效應(yīng)的目的。

(4)目前還未發(fā)現(xiàn)植物來(lái)源的黃酮類化合物基因工程抗體的報(bào)道，黃酮類化合物抗體在遺傳育種、抗體治療和代謝組學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用尚待研究。

總之，隨著人們對(duì)植物源黃酮類化合物越來(lái)越重視，黃酮類化合物的抗體必將在食品和醫(yī)療等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

表1 黃酮類化合物的抗體及免疫分析方法Table 1 Antibodies and immunoassay methods of flavonoids

續(xù)表1

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