HPLC法測定不同煎劑中鉤藤堿和異鉤藤堿煎出效率

卓韋杰，侯擁铓，丁 悅，阿娜爾，付 磊，張語含，竇志榕，王 柳，孫 瑤，虞 梅

(烏魯木齊市中醫(yī)院南門醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000)

鉤藤，性甘涼，歸肝、心包經(jīng)[1]。具有息風定驚，清熱平肝的功效。目前，臨床對于鉤藤飲片的應(yīng)用主要為由高血壓引起的風眩以及神經(jīng)性頭痛，是一味常用的中藥材。多見于配方使用，單味藥也可做茶飲[2]。鉤藤與它藥配伍成方后能夠增強息風止痙的作用從而發(fā)揮更好的療效，故臨床應(yīng)用單味藥較少見，常見于方劑天麻鉤藤飲或半夏鉤藤湯中使用。2020年版《中國藥典》中明確規(guī)定，鉤藤入煎劑時應(yīng)當“后下”煎煮，不可與它藥同煎太久或久煎[3]?，F(xiàn)代藥理學研究證明鉤藤主要有效成分鉤藤堿與異鉤藤堿結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，久煎易被破環(huán)[6]。需要后下煎煮保證其有效成分能夠最大煎出并保留[4]。因此本文挑選了兩種臨床最常用的方劑(天麻鉤藤湯、半夏白術(shù)鉤藤飲)[5]進行鉤藤堿和異鉤藤堿的煎出效率研究，實驗結(jié)果報告如下。

1 實驗儀器及試藥

1.1 實驗儀器

美國Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀；電子分析天平(英衡C型號，浙江英衡實驗儀器有限公司)；超聲波提取器(CR-040S型，深圳春霖實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗用藥

鉤藤堿標準品(四川省維克奇生物科技有限公司；批號：wkq20060810 CAS：76-66-4)，異鉤藤堿標準品(四川省維克奇生物科技有限公司；批號：wkq21022607 CAS：6859-01-4)。分析純甲醇、色譜純甲醇、三乙胺水溶液。所有實驗用水均為滅菌注射用水，天麻鉤藤飲與半夏白術(shù)鉤藤方劑原藥材飲片(所有原藥材飲片均由烏魯木齊市中醫(yī)院藥學部鑒定合格)。

2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(4.6mm×200mm，5μm)；流動相：甲醇(色譜純)-水=68∶32(含0.2%三乙胺水溶液，冰乙酸調(diào)pH=7.0)，流速為0.8mL/min，檢測波長254nm，柱溫30℃。

3 實驗方法

3.1 對照品溶液的制備

精密稱定鉤藤堿對照品11.2mg、異鉤藤堿標準品3.2mg，分別置于兩只10mL的棕色容量瓶中，加入75%的分析純甲醇溶液定容至刻度線，搖勻，即得1.12mg/mL鉤藤堿標準品儲備液與0.32mg/mL得異鉤藤堿標準品儲備液，放置于低溫2～6℃下冷藏避光保存。

3.2 供試品溶液的制備

將稱取好的藥材用紗布包裹后加入5倍量水進行煎煮，至方中其他藥沸騰時將鉤藤后下煎煮，后下煎煮5分鐘時取為第一組，10分鐘時為第二組，此后每分鐘取為一組直至15分鐘。每種方劑共計7組。取得的煎劑經(jīng)過濾補足后，取10mL用75%甲醇溶液定容至25mL容量瓶，常溫條件下超聲(功率300W)提取40min后用75%甲醇溶液再定容至刻度線，濾過后取續(xù)濾液，即得。

3.3 模型制劑的制備

模擬日常藥房調(diào)劑，按處方稱取天麻鉤藤飲與半夏白術(shù)鉤藤湯方組中各藥材7日用量，鉤藤單獨稱取，陰涼干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 陰性模型的制備

按照上述方法稱取天麻鉤藤飲與半夏白術(shù)鉤藤湯方劑中各藥材飲片一日用量，不稱取鉤藤飲片，陰涼干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.5 線性關(guān)系與系統(tǒng)專屬性的考察

精密吸取前文所述的配置完成的對照品溶液各2mL，均勻混合，得到鉤藤堿及異鉤藤堿對照品儲備液。按照0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL精密吸取6組儲備液，用75%甲醇稀釋定容至5mL即得。分別吸取上述6組稀釋液高效液相進樣10μL，色譜條件遵循色譜條件中規(guī)定的各項指標，測定峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標進行線性回歸，得出線性回歸方程Y鉤藤堿=0.9947X+4.2085(r2=0.9997)，證明鉤藤堿在0.0021～0.05mg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。Y異鉤藤堿=0.9897X+0.2217(r2=0.9998)，證明異鉤藤堿在0.0023～0.0872mg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。專屬性考察部分見圖1，混合標準品溶液、兩種方劑煎劑溶液的高效液相色譜圖證明峰形良好，兩種陰性模型煎劑高效液相色譜圖則說明在無鉤藤時，鉤藤堿及異鉤藤堿出峰處無其它雜質(zhì)峰干擾結(jié)果，說明該色譜條件對兩種鉤藤堿的專屬性好，異鉤藤堿與鉤藤堿分離度均≥1.5，說明該色譜條件下得出的結(jié)果真實可靠。

4 方法學考察

4.1 精密度測定

精密吸取混合標準品儲備液10μL，按照色譜條件高效液相連續(xù)進樣6次，測定峰面積。計算RSD值為1.13%。

4.2 穩(wěn)定性測定

取各供試品溶液在0h、2h、3h、4h、5h、6h分別測定鉤藤堿與異鉤藤堿峰面積，計算RSD值。天麻鉤藤飲中RSD鉤藤堿=2.11%，RSD異鉤藤堿=2.14%。半夏白術(shù)鉤藤湯中RSD鉤藤堿=2.71%，RSD異鉤藤堿=2.54%說明兩種方劑的供試品溶液在6h內(nèi)均穩(wěn)定。

4.3 含量測定

選取上文所述(3.2供試品溶液的配置)的各組配置完成的供試品溶液，按照色譜條件精密吸取10μL按照HPLC法進樣，通過峰面積與所得出的標準曲線方程(3.5線性關(guān)系與系統(tǒng)專屬性考察)計算兩種方劑中各不同時間的組份中鉤藤堿與異鉤藤堿含量。結(jié)果見圖2天麻鉤藤飲煎出效率時間規(guī)律圖、圖3半夏白術(shù)鉤藤湯煎出效率時間規(guī)律圖。

圖2 天麻鉤藤飲煎出效率時間規(guī)律圖

圖3 半夏白術(shù)鉤藤湯煎出效率時間規(guī)律圖

5 結(jié)果與討論

根據(jù)圖2天麻鉤藤飲煎出效率時間規(guī)律圖、圖3半夏白術(shù)鉤藤湯煎出效率時間規(guī)律圖?？梢悦黠@看出，天麻鉤藤飲與半夏白術(shù)鉤藤湯在對鉤藤后下煎煮時，最佳煎煮時間并不一致，天麻鉤藤飲中鉤藤在11分鐘時，其中的鉤藤堿與異鉤藤堿的煎出效率最高，在之后開始下降，而在半夏天麻鉤藤飲中，鉤藤堿與異鉤藤堿的煎出效率在13分鐘時達到了最高，之后開始下降。這說明不同的方劑中，鉤藤飲片的煎煮時間并不一致。應(yīng)當具體方劑具體對待，使中藥材鉤藤在臨床上獲得更好的療效。

在HPLC法對鉤藤堿和異鉤藤堿的考察中，曾經(jīng)考察了以純水與甲醇的流動相適用性，分別考察了甲醇∶水=(67∶33、70∶30、65∶35、55∶45)，最終發(fā)現(xiàn)在68∶32時為鉤藤堿與異鉤藤堿的最小分離閾值，小于此比例者均未有效分離。即使如此，純水與甲醇流動相對于鉤藤堿與異鉤藤堿的分離度仍然小于1.5。因此，三乙胺水溶液在分離鉤藤堿與異鉤藤堿時至關(guān)重要，能夠有效分離二者的同時有效改善拖尾，使色譜條件穩(wěn)定。而純水甲醇流動相不穩(wěn)定，且易出現(xiàn)拖尾，粘連的現(xiàn)象。

本次實驗以兩種不同方組的方劑入手，具體以異鉤藤堿與鉤藤堿的煎出效率作為指標，得出了兩種不同的方劑的最佳煎煮時間。其中天麻鉤藤飲在鉤藤后下煎煮11分鐘時鉤藤堿與異鉤藤堿的煎出效率最高，半夏白術(shù)鉤藤湯中，鉤藤的最佳后下煎煮時間則為13分鐘，對臨床合理煎藥提供了參考。