甘蔗黑穗病拮抗細(xì)菌的促生長(zhǎng)特性及其防治效果研究

謝光杰 段振峰 王震 余卓新 邢永秀 李楊瑞

摘要：【目的】篩選具有拮抗甘蔗黑穗病菌（Sporisorium scitamineum）及促進(jìn)植物生長(zhǎng)特性的細(xì)菌，為甘蔗黑穗病的生物防治提供菌株資源和參考依據(jù)?！痉椒ā坎杉霈F(xiàn)黑穗病甘蔗株的根際土壤，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法分離純化獲得拮抗菌株，通過16S rRNA序列分析明確拮抗菌株的分類地位并分析其促生長(zhǎng)特性;采用桶栽試驗(yàn)，研究篩選獲得的優(yōu)良拮抗菌株對(duì)甘蔗黑穗病的防治效果?！窘Y(jié)果】分離純化獲得68株細(xì)菌菌株，其中7株（G1、G10、G12、G14、G20、G21和G23）對(duì)甘蔗黑穗病菌具有抑制效果。7株菌株具有產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、分泌吲哚乙酸（IAA）、產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACC脫氨酶）、嗜鐵能力、溶解有機(jī)磷、產(chǎn)蛋白酶及產(chǎn)氫氰酸（HCN）等不同程度的促進(jìn)植物生長(zhǎng)特性，特別是3株伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）菌株G1、G10和G23的綜合效果更好。用拮抗能力較強(qiáng)的菌株G1、G10、G12和G23防治甘蔗黑穗病的桶栽試驗(yàn)結(jié)果表明，4株拮抗菌株處理均可有效抑制黑穗病的發(fā)生，提高甘蔗的出苗率和生物量，其中以菌株G23處理的綜合效果最好?！窘Y(jié)論】分離獲得7株對(duì)甘蔗黑穗病菌拮抗效果較好的菌株，均具有不同程度的促進(jìn)植物生長(zhǎng)特性，其中以菌株G23的綜合效果最好，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 甘蔗黑穗病;拮抗細(xì)菌;鑒定;防治效果;促植物生長(zhǎng)特性

中圖分類號(hào)： S435.661? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）11-3013-09

Plant growth-promoting characteristics and control effect of antagonistic bacteria against sugarcane smut

TA Quang-kiet1， DUAN Zhen-feng1， WANG Zhen1， YU Zhuo-xin1，

XING Yong-xiu1*， LI Yang-rui2*

（1College of Agriculture， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2 Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/ Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Sugarcane

Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530007， China）

Abstract：【Objective】To screen for bacteria with the characteristics of antagonizing sugarcane smut and promoting plant growth to provide strain resources and reference for the biological control of sugarcane smut. 【Method】The rhizosphere soils of sugarcane with serious incidences of sugarcane smut disease were collected， and antagonistic strains were isolated and purified by gradient dilution and the plate confrontation culture method. The classification of antagonistic strains was determined by 16S rRNA sequence analysis and their different growth promoting characteristics were analyzed. In parallel， their effect on sugarcane smut development was studied by pot experiments. 【Result】A total of 68 bacterial strains were obtained after isolation and purification，of which seven strains （G1， G10， G12， G14， G20， G21 and G23） had inhibitory effects on the fungus Sporisorium scitamineum. The seven strains showed different growth promoting abilities， as indicated by their differing productions of cellulose， chitinase， indole acetic acid （IAA）， 1-aminocyclopropane-1-carboxylic aciddeaminase（ACC deaminase）， siderophores， proteases， hydrocyanic acid production（HCN） production， and their abilities to dissolve organic phosphate. Three strains of Burkholderia spp. （G1， G10 and G23） ranked highest. The pot experiment of sugarcane smut control showed that four antagonistic strains （G1， G10， G12 and G23） effectively inhibited the occurrence of smut and improve the emergence rate and biomass of sugarcane with a significantly increase in biomass. Among all the strains， the strain G3 seemed to be the most performing one. 【Conclusion】The top se-ven strains displaying antagonistic effects on sugarcane smut all show different growth promoting ability. Considering all the data， the antagonistic strain G23 shows the best combined effects of smut control and growth promotion， indicating good application potential.

Key words： sugarcane smut; antagonistic bacteria; identification; control effect; plant growth promoting characteristic

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31971858，31560352）;Guangxi Science and Technology Base and Talents Special Project （Guike AD17195100）;Guangxi Sugarcane Innovation Team Project of National Modern Agricultural Industrial Technology System （gjnytxgxcxtd-03-01）

0 引言

【研究意義】甘蔗黑穗病為全球性重要真菌病害，對(duì)甘蔗生產(chǎn)危害嚴(yán)重（Schenck et al.，2005;Izadi and Moosawi-Joff，2007;李楊瑞，2010;Li et al.，2016）。廣西是世界十大產(chǎn)糖區(qū)之一，甘蔗種植面積約73.33萬ha（羅含敏等，2020），目前甘蔗生產(chǎn)上最主要的病害是黑穗病，常造成甘蔗產(chǎn)量的巨大損失（Li et al.，2016;韋金菊等，2019）。由于當(dāng)前廣西甘蔗主栽品種桂糖42號(hào)和桂柳05-136均較感黑穗病，且該病的病原菌已廣泛分布于土壤、空氣等蔗田環(huán)境中，采用脫毒健康種苗和化學(xué)藥劑防治效果不佳，因此，探尋有效的甘蔗黑穗病防治手段具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物根際促生細(xì)菌（PGPR）具有溶磷、分泌嗜鐵素和植物激素、產(chǎn)氫氰酸（HCN）及防治病蟲害等作用。研究發(fā)現(xiàn)鐵載體有助于對(duì)植物病原體的生物控制（Solanki et al.，2014），植物可利用微生物鐵載體獲得鐵以提高產(chǎn)量（Etesami and Maheshwari，2018）。已有報(bào)道一些植物根際促生長(zhǎng)細(xì)菌具有強(qiáng)大的生防潛力，可減少化學(xué)肥料和農(nóng)藥的使用（孔慶科和丁愛云，2001;郝曉娟等，2007;曹媛媛等，2019）。Velazhahan等（1999）研究表明，根際內(nèi)生拮抗細(xì)菌熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）對(duì)水稻稻瘟病防治有積極作用，菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶水平與其防治效果有密切關(guān)系。Cui等（2019）研究發(fā)現(xiàn)小麥根際分離的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B9601-Y2對(duì)幾種重要的植物病原具有拮抗作用，能溶解磷酸鹽、鉀等礦物，并能在體外條件下無氮生長(zhǎng);可顯著促進(jìn)玉米幼苗生長(zhǎng)，改善與土壤質(zhì)量相關(guān)的幾種酶，提高葉綠素含量;同時(shí)具有營(yíng)養(yǎng)增溶和病害抑制特性，具有作為生物防治和植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑的潛力。已有學(xué)者開展了甘蔗病害生防拮抗菌研究，并取得了一定成果。Lal等（2009）利用木霉菌（Trichoderma viride）防治甘蔗黑穗病菌的研究結(jié)果表明，木霉菌處理使甘蔗發(fā)芽率提高6.2%，有效莖數(shù)增加15.1%，甘蔗產(chǎn)量提高27.33%。Liu等（2017）分離了1株來自根際的瓜里科州假單胞菌（P. guariconensis）ST4細(xì)菌，該細(xì)菌對(duì)甘蔗黑穗病菌雙極性孢子菌絲的交配具有很強(qiáng)的抑制活性，但需要葡萄糖才能產(chǎn)生拮抗物質(zhì)。Juma等（2018）從甘蔗品種Co421根際中分離得到的微生物AJB9對(duì)甘蔗黑穗病菌具有顯著的拮抗作用。Jayakumar等（2019）從甘蔗節(jié)間、芽和根中分離到8株對(duì)甘蔗黑穗病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，田間試驗(yàn)結(jié)果表明，接種內(nèi)生菌不僅降低了甘蔗黑穗病的發(fā)病率，而且使發(fā)病初期推遲60 d。張旭娜（2020）采用平板對(duì)峙法從甘蔗芽中篩選分離得到1株對(duì)甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株D3和1株對(duì)甘蔗鞭黑粉菌有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株ZC2-4，經(jīng)鑒定，菌株D3為拉氏根瘤菌[Rhizobium larrymoorei （Bouzar and Jones）]，ZC2-4為解淀粉芽孢桿菌[B. amyloliquefaciens （Fukumoto）]。近年來，本課題組在甘蔗黑穗病拮抗細(xì)菌的篩選方面初步開展了一些工作，從甘蔗根中分離獲得20株芽孢桿菌（Bacillus）菌株，其中多株菌株可拮抗1種以上病原真菌，尤其是貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）Y8對(duì)測(cè)試的8種病原真菌均具有拮抗作用，并具有促植物生長(zhǎng)特性（Wang et al.，2019;余卓新，2020）;Guo等（2020）從甘蔗屬5個(gè)種的根中分離獲得175株內(nèi)生細(xì)菌菌株，其中多株菌株對(duì)甘蔗黑穗病菌具有拮抗作用;Singh等（2021a）從甘蔗根中分離得到的內(nèi)生綠膿桿菌（P. aeruginosa）菌株B18對(duì)3種甘蔗病原菌黑穗病菌（Sporisorium scitamineum）、鳳梨病菌（Ceratocystis paradoxa）和輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）均具有較強(qiáng)的拮抗能力并具有顯著的植物促生性能;Singh等（2021b）從甘蔗根際分離得到阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）菌株BY4和分散泛菌（Pantoea dispersa）菌株AA7對(duì)甘蔗黑穗病菌和鳳梨病菌具有拮抗作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】甘蔗根際存在大量的植物促生長(zhǎng)細(xì)菌，但有關(guān)甘蔗黑穗病拮抗菌的分離報(bào)道相對(duì)較少，且尚未見有關(guān)于伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）細(xì)菌拮抗甘蔗黑穗病菌的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在原有工作的基礎(chǔ)上，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法從甘蔗黑穗病發(fā)病嚴(yán)重的土壤中分離具有拮抗甘蔗黑穗病菌及促進(jìn)植物生長(zhǎng)特性的細(xì)菌，為甘蔗黑穗病的生物防治提供菌株資源和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 甘蔗黑穗病菌的分離 從感染黑穗病的甘蔗上采集黑鞭，75%酒精消毒后剝開黑穗鞭，挑取孢子放入裝有20 mL無菌水的小瓷杯中，其中鏈霉素濃度為1500 mg/L，拌勻靜置1 min。取2 mL于另一無菌小瓷杯進(jìn)行10倍稀釋，連續(xù)3次。取稀釋液0.1 mL涂布于馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后挑取單菌落純化。

1. 1. 2 甘蔗黑穗病病原菌的PCR鑒定 利用真菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.ATM HP Fungal DNA Kit，壹棵松生物公司提供）提取甘蔗黑穗病病原菌DNA，采用黑穗病菌檢測(cè)引物bE4（5'-CGCTCTGGTTCAT CAAGC-3'）和bE8（5'-TGCTGTCGATGGAAGGTG T-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系25.0 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2 μL，上、下游引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，加滅菌超純水補(bǔ)足至25.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1. 2 甘蔗黑穗病拮抗細(xì)菌的分離、篩選和鑒定

1. 2. 1 甘蔗黑穗病拮抗細(xì)菌的分離和篩選 于甘蔗生長(zhǎng)期在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院甘蔗黑穗病研究溫室采集出現(xiàn)黑穗病甘蔗株的根際土壤。采用五點(diǎn)采樣法采樣，鏟去2 cm表土，小心挖出根系，抖動(dòng)去土，保留附著在根上的少量土，置于塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室。剪取根系5 g，置于裝有45 mL無菌水的滅菌三角瓶，振蕩2～3 min，靜置2 h，取土壤浸提液1 mL至試管中，依次稀釋成10-2、10-3和10-4倍稀釋液進(jìn)行分離。

分離方法：各濃度取0.1 mL懸液分別涂布于LB培養(yǎng)基平板上，設(shè)3個(gè)重復(fù)，28～30 ℃下培養(yǎng)1～3 d，待菌落形成后，挑取形態(tài)、大小、色澤不同菌落劃線純化，經(jīng)2次純化培養(yǎng)后的單菌落移至LB斜面培養(yǎng)基上，編號(hào)后在28 ℃培養(yǎng)1～2 d，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，在PDA培養(yǎng)基中心放入黑穗病菌單菌落，28 ℃下恒溫培養(yǎng)2～4 d后，形成直徑為3 mm的黑穗病菌菌落，將分離獲得的細(xì)菌接種于培養(yǎng)基中心間距18 mm處，繼續(xù)培養(yǎng)10～15 d。以細(xì)菌接種點(diǎn)至甘蔗黑穗病菌菌落外緣的間距確定拮抗程度。

細(xì)菌抑制黑穗病菌生長(zhǎng)的抑菌率按下式計(jì)算：I（%）=d/D×100。式中，I為細(xì)菌抑制黑穗病菌生長(zhǎng)的抑菌率（%）;D為對(duì)照黑穗病菌菌落直徑（mm）;d為細(xì)菌接種點(diǎn)至甘蔗黑穗病菌菌落外緣的間距（mm）。

1. 2. 2 甘蔗黑穗病拮抗細(xì)菌鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司）提取細(xì)菌DNA，按試劑盒使用說明進(jìn)行操作。

參照Lane（1991）的方法，采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和1942R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增細(xì)菌菌株的16S rRNA基因片段。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：Master Mix 25.0 μL，DNA模板（30 ng/μL）1.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 20.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 55 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

以細(xì)菌菌株的16S rRNA序列及其在NCBI網(wǎng)站下載的相關(guān)參考菌株的基因序列，用MEGA-X中的非加權(quán)組平均法（UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 3 甘蔗黑穗病拮抗細(xì)菌的促生長(zhǎng)特性檢測(cè)

1. 3. 1 菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和纖維素酶能力檢測(cè) 將分離獲得的拮抗細(xì)菌接種于幾丁質(zhì)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng) 7 d，觀察透明圈產(chǎn)生情況。采用羧甲基纖維素鈉平板法和剛果紅染色法篩選具有纖維素分解能力的菌株，并測(cè)量菌落直徑（D）和水解圈直徑（d）。

1. 3. 2 菌株的嗜鐵能力檢測(cè) 參考Schwyn和Neiland（1987）的方法進(jìn)行。拮抗細(xì)菌在CAS培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)3 d（或5 d），觀察菌落周圍是否形成黃色暈圈，以黃色暈圈的大小代表菌株的嗜鐵能力。

1. 3. 3 菌株溶解有機(jī)磷能力檢測(cè) 在Pikovaskai’s培養(yǎng)基上接種拮抗細(xì)菌，于30 ℃下培養(yǎng)5 d，以菌落周圍的暈圈區(qū)有無和大小代表細(xì)菌的溶解磷能力。

1. 3. 4 菌株產(chǎn)蛋白酶能力檢測(cè) 參照Ghorbel等（2003）的方法進(jìn)行。自能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生長(zhǎng)后，其菌落周圍可形成明顯的蛋白水解圈。水解圈與菌落直徑的比值常被作為判斷該菌株蛋白酶產(chǎn)生能力的篩選依據(jù)。

1. 3. 5 菌株分泌吲哚乙酸（IAA）能力測(cè)定 參照Glick等（1997）的方法進(jìn)行。

1. 3. 6 菌株1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACC脫氨酶）活性檢測(cè) PYG培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母粉3.0 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0;A#培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g，ACC 1.0 g，無機(jī)鹽溶液1000 mL（KH2PO4 100.0 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.13 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.013 g，pH 7.0）。B#培養(yǎng)基：不加ACC，其余同A#。

菌株純化后接種于3 mL PYG液體培養(yǎng)基中，30 ℃下200 r/min搖床培養(yǎng)40 h，離心收集菌體，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）洗2次，然后用無菌水制成菌懸液，分別取10 μL接種于1.5 mL A#和B#培養(yǎng)基中，30 ℃下200 r/min搖床培養(yǎng)，測(cè)定660 nm處的OD值。

1. 3. 7 菌株產(chǎn)氫氰酸（HCN）能力測(cè)定 參考陳慶河等（1998）的方法進(jìn)行。將細(xì)菌接種于加有4.4 g/L甘氨酸的NB培養(yǎng)基上，蓋上培養(yǎng)皿蓋（頂蓋內(nèi)側(cè)貼有浸過苦味酸溶液的無菌濾紙;苦味酸溶液配制：苦味酸2.5 g，Na2CO3 12.5 g，水1000 mL），培養(yǎng)皿用Parafilm封口膜密封，28 ℃下培養(yǎng)48 h后確定各菌株產(chǎn)HCN能力。每處理3個(gè)重復(fù)。

1. 4 拮抗菌株對(duì)甘蔗黑穗病發(fā)病率及甘蔗出苗率和生物量的影響

1. 4. 1 菌株的培養(yǎng) 從-80 ℃冰箱中取出拮抗能力較強(qiáng)的菌株于LB固體培養(yǎng)基上活化，長(zhǎng)出單菌落后用消毒牙簽挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，測(cè)定600 nm下菌液的吸光值為0.8左右，進(jìn)行離心（4 ℃下4000 r/min離心10 min），收集菌體，隨后用無菌蒸餾水稀釋至108 CFU/mL備用。

黑穗病菌菌液制備參考黃家雍等（2001）的方法。

1. 4. 2 甘蔗種植及處理 試驗(yàn)在廣西大學(xué)甘蔗研究所進(jìn)行。供試土壤為種植甘蔗的大田土壤并進(jìn)行蒸汽滅菌處理，土壤有機(jī)質(zhì)含量21.47 g/kg。栽培用桶規(guī)格上口徑約32 cm，高度約20 cm，每桶裝土約17 kg。

試驗(yàn)設(shè)CK1（清水浸泡）、CK2（黑穗病菌菌懸液浸泡）及黑穗病菌 + 拮抗菌株菌懸液浸泡處理。將甘蔗品種ROC22砍成單芽，分別在不同處理的溶液中浸泡。對(duì)于黑穗病菌 + 拮抗菌株共接種處理的甘蔗，先在濃度為5×106孢子/mL的黑穗病菌菌懸液中浸泡6 h，取出遮蔭干燥后再放入濃度為108 CFU/mL的拮抗菌菌懸液中浸泡30 min;CK1處理用清水浸泡6 h;CK2處理用濃度為5×106孢子/mL的黑穗病菌菌懸液浸泡6 h。每桶種植3株，3次重復(fù)。甘蔗生長(zhǎng)期間不施肥，只進(jìn)行正常澆水除草管理。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理和作圖，運(yùn)用DPS v15.10進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 甘蔗黑穗病菌的分離、培養(yǎng)和鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，甘蔗黑穗病菌菌絲呈純白色，密生，形成的菌落圓形，培養(yǎng)3 d觀察到明顯的菌落，5 d時(shí)菌落直徑10 mm左右，培養(yǎng)10 d菌落直徑22 mm，培養(yǎng)15 d菌落直徑達(dá)35 mm（圖1）。提取分離純化的2個(gè)黑穗病菌單菌落Z1和Z2的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，黑穗病病原菌Z1出現(xiàn)461 bp的條帶，Z2出現(xiàn)468 bp的條帶（圖2）。所得序列經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，確定分離的菌株屬于甘蔗黑穗病菌屬（Sporisorium）。

2. 2 甘蔗黑穗病拮抗細(xì)菌的分離、篩選和鑒定

2. 2. 1 拮抗細(xì)菌的分離和篩選 采集出現(xiàn)黑穗病甘蔗株的根際土壤，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法從LB培養(yǎng)基上共分離純化獲得68株細(xì)菌菌株，發(fā)現(xiàn)7株對(duì)黑穗病菌有抑制效果（圖3），其中拮抗能力較強(qiáng)的菌株為G1、G12、G10和G23，抑菌率分別為51.43%、62.86%、71.43%和80.00%，拮抗能力較弱的菌株為G14、G20和G21，抑菌率分別為14.29%、14.29%和17.14%。

2. 2. 2 拮抗細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析 以拮抗細(xì)菌的16S rRNA序列與相近的參考標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列通過MEGA-X軟件的UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖4可看出，7株拮抗細(xì)菌菌株可分為2大類群，其中伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）（G1、G10、G23）與其他菌株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，獨(dú)立為一個(gè)簇菌;沙雷氏菌屬（Serratia） （G12）、腸桿菌屬（Enterobacter）（G14）和窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）（G20、G21）為一個(gè)簇菌。

2. 2. 3 拮抗細(xì)菌的促生長(zhǎng)特性 從產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、產(chǎn)纖維素酶、嗜鐵能力、溶解有機(jī)磷、產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)生IAA和產(chǎn)生HCN等方面評(píng)價(jià)7株拮抗菌株的促甘蔗生長(zhǎng)特性。結(jié)果（表1和表2）顯示，7株菌株均具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和纖維素酶能力，其中G20、G21和G23能力較強(qiáng)，G1和G10中等，G14和G12較弱。7株菌株均具有嗜鐵能力，以G1和G10最強(qiáng)，G23中等，G12、G14、G20和G21較弱。溶磷能力以G1、G10和G12較強(qiáng)，G23中等，G14、G20和G21無溶磷能力。除G14表現(xiàn)較弱的產(chǎn)蛋白酶能力外，其余菌株產(chǎn)蛋白酶的能力均較強(qiáng)。菌株G1、G10、G14和G23具有產(chǎn)HCN能力。

7株菌株中只有3株菌株檢測(cè)到產(chǎn)IAA能力，其中G14產(chǎn)IAA產(chǎn)能力最強(qiáng)（129.20 mg/L），G1和G21產(chǎn)IAA能力較弱（分別為10.22和13.39 mg/L），G14產(chǎn)IAA能力顯著高于G1和G21（P<0.05，下同）。菌株G23分解1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）效果最明顯，菌株G12、G14、G20和G21居中，G1和G10分解ACC效果不明顯。

2. 3 拮抗菌株對(duì)甘蔗黑穗病發(fā)病率及甘蔗出苗率和生物量的影響

2. 3. 1 不同接菌處理對(duì)甘蔗黑穗病發(fā)病率和出苗率的影響 選取拮抗能力較強(qiáng)的菌株G1、G10、G12和G23進(jìn)行拮抗菌株對(duì)甘蔗黑穗病發(fā)病率及甘蔗出苗率和生物量的影響測(cè)定。由表3可知，4株拮抗甘蔗黑穗病菌菌株處理均可有效抑制甘蔗黑穗病的發(fā)生，各處理的發(fā)病率均顯著低于CK2處理，其中CK2+G10和CK2+G23處理未發(fā)生黑穗病，CK2+G1和CK2+G12處理的發(fā)病率較CK2處理分別降低70.46%和77.27%;同時(shí)觀察到拮抗菌株處理可延緩黑穗病的發(fā)生，其中CK2+G1和CK2+G12處理的發(fā)病時(shí)間較CK2處理分別推遲25和40 d。與CK2處理相比，CK2+G1、CK2+G10、CK2+G12和CK2+G23處理均不同程度地提高了甘蔗的出苗率，分別較CK2處理提高27.76%、13.23%、11.02%和17.18%，但均低于CK1處理。

2. 3. 2 不同拮抗菌株處理對(duì)甘蔗生物量的影響

由表4可知，與CK2處理相比，除CK2+G1處理甘蔗根的鮮重、CK2+G1和CK2+G10處理甘蔗根的干重差異不顯著外（P>0.05），不同拮抗菌處理均顯著提高了甘蔗莖、根的干重和鮮重，而CK1處理甘蔗莖的鮮重和干重較CK2處理分別增加85.16%和134.12%。黑穗病菌+拮抗菌各處理間莖的鮮重和干重均達(dá)顯著差異水平，生物量大小排序?yàn)镃K2+G23>CK2+G12>CK2+G1>CK2+G10，其中CK2+G23處理甘蔗莖的鮮重和干重較CK1處理分別提高8.29%和10.32%。各處理對(duì)甘蔗根鮮重影響以CK2+G23處理最高，其次是CK1和CK2+G12處理;對(duì)甘蔗根干重的影響以CK2+G23、CK1和CK2+G12處理最高，且與CK2處理達(dá)顯著差異水平。

3 討論

微生物生物防治具有對(duì)環(huán)境無化學(xué)污染、低成本、自然資源豐富的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒ㄖ唬ê聲跃甑龋?007;程歡歡等，2019）。從甘蔗根際土壤分離的枯草芽孢桿菌HAS對(duì)黑穗病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)甘蔗黑穗病的防效可達(dá)100%，表明HAS是一株在防治甘蔗黑穗病上具有潛在意義的生防菌株（熊國(guó)如等，2013a，2013b）。Liu等（2017）從甘蔗體內(nèi)分離獲得119株拮抗甘蔗黑穗病的細(xì)菌分離物，其中ST4對(duì)甘蔗黑穗病防治效果明顯，特別是進(jìn)行細(xì)菌接種時(shí)添加2%葡萄糖可顯著提高ST4對(duì)甘蔗黑穗病的生物防治效率。本課題組前期的研究也證實(shí)從甘蔗不同部位及根際獲得的促生長(zhǎng)菌株具有多種生防潛能（Wang et al.，2019;余卓新，2020;Guo et al.，2020;Singh et al.，2021a，2021b）。本研究采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法從甘蔗根際土壤中分離獲得68株細(xì)菌菌株，進(jìn)一步篩選獲得7株甘蔗黑穗病生防拮抗細(xì)菌，其中有4株菌株對(duì)黑穗病的抑菌率在50.00%以上，而其中的G1、G10和G23均屬于伯克霍爾德氏菌屬，首次揭示了伯克霍爾氏菌屬在甘蔗生物防治中的應(yīng)用潛能。

由于根際或植物內(nèi)生促生細(xì)菌與植物有相似的生態(tài)位，是適宜的生物防治劑，其除了具有拮抗特性外，還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)特性（Wang et al.，2019;Guo et al.，2020）。用幾丁質(zhì)培養(yǎng)基篩選拮抗細(xì)菌，獲得對(duì)甘蔗黑穗病有拮抗特性細(xì)菌的機(jī)會(huì)較大。據(jù)報(bào)道，裂解真菌的細(xì)菌一般都產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，該酶可降解真菌菌絲，因此可控制土傳病害（孔慶科和丁愛云，2001）。本研究中分離篩選獲得的7株黑穗病拮抗細(xì)菌均具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和纖維素酶能力，PGPR特性的嗜鐵、溶解有機(jī)磷、產(chǎn)蛋白酶能力也較強(qiáng)。蛋白酶可抑制許多病原真菌生長(zhǎng)，是生防菌發(fā)揮拮抗作用的基礎(chǔ)（Ghorbel et al.，2003）。Wei等（1991）曾對(duì)6株誘導(dǎo)抗病性菌株進(jìn)行產(chǎn)HCN試驗(yàn)，其中有4株產(chǎn)HCN，認(rèn)為HCN可能與細(xì)菌生防作用有關(guān)。HCN因其對(duì)植物病原體的毒性而被公認(rèn)為是一種生物防治劑（Toma? and Ale?，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)伯克霍爾氏菌屬菌株均具有產(chǎn)HCN能力，但這些細(xì)菌產(chǎn)生的氰化物是否對(duì)植病生防產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性仍需繼續(xù)研究。有些土壤微生物在以ACC為唯一氨源的培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶，把乙烯生物合成的關(guān)鍵中間前體ACC分解為α丁酮酸和氨，從而抑制乙烯合成，減少乙烯排放有利于維持植物旺盛生長(zhǎng)，延緩衰老。有些促植物生長(zhǎng)的根際細(xì)菌定殖到植物組織后，可產(chǎn)生IAA，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)（劉曉瑞，2017）。本研究篩選獲得的黑穗病拮抗細(xì)菌菌株G23表現(xiàn)出較強(qiáng)的ACC脫氨酶活性，但不產(chǎn)生IAA;而G14產(chǎn)IAA能力特別強(qiáng)，但ACC脫氨酶活性中等?？梢姡煌母收岷谒氩∞卓辜?xì)菌菌株的促植物生長(zhǎng)特性有明顯差異，各有所長(zhǎng)。本研究中，以G23的綜合表現(xiàn)最好，不僅具有較強(qiáng)的拮抗甘蔗黑穗病菌能力，而且具有優(yōu)良的促植物生長(zhǎng)特性，接種甘蔗后防治黑穗病和增加甘蔗生物量均表現(xiàn)最好，表現(xiàn)出良好的潛在應(yīng)用價(jià)值，但正如Subedi等（2020）指出，生防細(xì)菌在室內(nèi)試驗(yàn)所表現(xiàn)的拮抗作用不一定與田間防效成正相關(guān)。因此，本研究中篩選出的黑穗病拮抗菌株的防治效果還需在田間自然環(huán)境下進(jìn)一步系統(tǒng)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

從甘蔗根際土壤中分離獲得7株對(duì)黑穗病菌拮抗效果較好的菌株，均具有不同程度的促植物生長(zhǎng)特性，其中以菌株G23對(duì)甘蔗黑穗病的防治效果和促進(jìn)植物生長(zhǎng)能力最突出，表現(xiàn)出良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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收稿日期：2021-05-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31971858，31560352）;廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD17195100）;國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西甘蔗創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（gjnytxgxcxtd-03-01）

通訊作者：邢永秀（1972-），https：//orcid.org/0000-0001-7062-0342，博士，副教授，主要從事甘蔗生理與分子生物學(xué)及甘蔗生物固氮研究工作，E-mail：document126@126.com;李楊瑞（1957-），https：//orcid.org/0000-0002-7559-9244，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事甘蔗栽培及育種研究工作，E-mail：liyr@gxaas.net

第一作者：謝光杰（1994-），https：//orcid.org/0000-0001-8054-1007，研究方向?yàn)楦收岷谒氩∞卓辜?xì)菌，E-mail：2788853256@qq.com