高羊茅FaFKF1基因克隆、亞細胞定位及節(jié)律表達分析

舒健虹 王子苑 劉曉霞 王小利

摘要：【目的】克隆高羊茅藍光受體家族基因（FaFKF1），分析其序列特征及亞細胞定位，并檢測其在不同光照處理下的節(jié)律表達特征，為探索其在成花中的調控機制及高羊茅光周期適應性育種提供理論依據?！痉椒ā坎捎肦ACE方法克隆FaFKF1基因cDNA全長序列，對其進行生物信息學分析，并構建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表達載體，通過農桿菌介導轉染煙草表皮細胞，觀察熒光信號以確定蛋白亞細胞定位情況。同時，利用實時熒光定量PCR檢測FaFKF1基因不同光照處理和不同生長階段的節(jié)律表達特征。【結果】克隆獲得FaFKF1基因cDNA全長為2266 bp，開放閱讀框（ORF）為1881 bp，編碼626個氨基酸殘基，蛋白分子量為68.89 kD，理論等電點（pI）為5.76，脂肪系數為80.99，不穩(wěn)定指數為39.81，屬于較穩(wěn)定的親水性蛋白，亞細胞定位于細胞核。FaFKF1蛋白的二級結構包含α-螺旋（24.92%），無規(guī)則卷曲（44.89%）、延伸鏈（23.16%）和β-轉角（7.03%）。FaFKF1蛋白與大豆（NP_001235886.2）、大麥（KAE8795993.1）和二穗短柄草（XP_003577479.1）的氨基酸序列相似性較高，為79.50%～87.68%，且與二穗短柄草FKF1蛋白的親緣關系最近，其次是大麥和小麥。長日照處理下，FaFKF1基因在苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期的葉片中均有表達，相對表達量變化趨勢也較相似，均在ZT8時（即下午16：00）達最高峰，呈現出24 h的晝夜節(jié)律，但在孕穗期和抽穗期的相對表達量明顯較高。在長日照和短日照基礎上施加不同光照處理下，FaFKF1基因均能通過自身調節(jié)來適應環(huán)境的變化，雖然表達峰出現時間不一致，但整體上能維持24 h的晝夜節(jié)律?！窘Y論】FaFKF1基因在細胞核發(fā)揮作用，且在不同光照下均呈現節(jié)律表達，受光周期的誘導調控。

關鍵詞： 高羊茅;FaFKF1基因;克隆;節(jié)律表達;亞細胞定位

中圖分類號： S688.403.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-2941-11

Cloning，subcellular location and rhythmic expression analysis of FaFKF1 gene in Festuca arundinacea

SHU Jian-hong，WANG Zi-yuan，LIU Xiao-xia，WANG Xiao-li*

（Institute of Prataculture，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang? 550006， China）

Abstract：【Objective】The blue light receptor family gene（FaFKF1） in Festuca arundinacea was cloned， its sequence characteristics and subcellular localization were analyzed， and its rhythmic expression characteristics under diffe-rent light treatments were detected， so as to provide a theoretical basis for exploring its regulatory mechanism in adult flowers and the adaptive breeding of F. arundinacea optoperiood. 【Method】The RACE technology was used to clone the full length cDNA of FaFKF1 gene. Its bioinformatics analysis was conducted. pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP fusion expression vector was constructed， infected tobacco epidermal cells by Agrobacterium mediated transfection to observe the fluorescent signal to determine protein subcellular localization.Meanwhile， the rhythmic expression characteristics of different light treatments and different growth stages of the FaFKF1 gene were detected using real-time? fluorescence quantitative PCR. 【Result】The sequence analysis results showed that the full-length cDNA（2266 bp） was obtained with a 1881 bp open reading frame（ORF），which encoded a small molecular protein containing 626 amino acids，the relative molecular weight of FaFKF1 protein was about 68.89 kD and its theoretical isoelectric point（pI） was 5.76，and the fat coefficient 80.99，instability index 39.81，which was a stable hydrophilic protein. Subcellular localization results showed that FaFKF1 was located in the nucleus. In the secondary structure of FaFKF1 protein， 24.92% of alpha helix，44.98% of random coil，23.61% of extended strand and 7.03% of beta turn were observed. FaFKF1 protein had the high amino acid sequence similarity with FKF1 of Glycine max（NP_001235886.2），Hordeum vulgare（KAE8795993.1）， and Brachypodium dilatatum （XP_003577479.1），reaching more than 85%. And the genetic distance with B. dilatatum was the shortest， followed by H. vulgare and wheat. Under long-day treatment， FaFKF1 gene was expressed in leaves during seedling， tillering， booting and heading stages， and the relative expression trend was similar， all peaked at ZT8 （16：00 PM）， showing a circadian rhythm of 24 h， but the relative expression was high in booting and heading stages. Under different light treatments based on long and short light exposure， the FaFKF1 gene could adapt to the environmental changes through autoregulation. Although the peak expression occurrence time was inconsistent， the overall circadian rhythm was maintained for 24 h. 【Conclusion】FaFKF1 gene may play an important role in the nucleus，and hasa rhythmic expression subcellular location under different lighting conditions，which is induced and regulated by the photoperiod.

Key words： Festuca arundinacea; FaFKF1 gene; cloning; rhythmic expression

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860674）; Special Fund Project of the Guizhou Science and Technology Platform and Talent Team（QKHPTRC〔2018〕5634）; Science and Technology Plan Project of Guizhou （QKHPTRC〔2020〕5005）

0 引言

【研究意義】植物不僅利用光作為光合作用的能源，還能感知環(huán)境的變化，并調整其發(fā)育進程以提高其對當地環(huán)境的適應性（Zoltowski and Imaizumi et al.，2014）。開花是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的重要轉變過程，并受內源節(jié)律基因和環(huán)境之間的相互作用調節(jié)。光周期是影響開花的重要環(huán)境因子，植物可通過感知光周期的變化啟動內源相關開花因子來調節(jié)啟動開花（Han et al.，2015;王亞梁等，2020）。高羊茅（Festuca arundinacea）屬禾本科植物，需要長日照才能促進開花，但貴州日照時間短、土壤貧瘠、氣候復雜，不能有效產生大量種子，目前高羊茅種子主要依靠進口。FLAVIN-BINDING KELCHREPEAT F-BOX 1（FKF1）基因對植物開花具有重要調控作用。因此，對高羊茅FKF1基因克隆并進行表達分析，探究FKF1基因在高羊茅光周期中的調控機制，對高羊茅的光周期育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物細胞含有多種不同類別的感光體，可吸收不同光譜的光，主要包括紅/遠紅外光受體植物色素、藍光受體、隱色色素和光蛋白（Chen et al.，2004）。從模式植物擬南芥中發(fā)現新的藍光受體家族蛋白，包含3個成員，即FKF1、LOV KELCH（LKP2）和ZEITLUPE（ZTL），這些蛋白均參與晝夜節(jié)律和開花時間的調節(jié)（David et al.，2000;Takase et al.，2011）。其中，FKF1蛋白不僅是藍光特異性受體，還是SKP-Cullin-Rbx-F-box（SCF） E3連接酶復合體的重要組成部分，首次發(fā)現于擬南芥晚花突變體中，其含有3個結構域，即LOV結構域（吸收藍光）、F-box結構域和Kelch-repeat（Song et al.，2014）。FKF1基因位于開花促進基因（CONSTANS）CO和（Flowe-ring Locus T）FT基因的上游，可被藍光激活呈節(jié)律性表達，表達高峰出現在黃昏時期 （Nelson et al.，2000;Imaizumiet al.，2003）。在光周期調控過程中，FKF1蛋白可誘導CO基因表達，且該過程具有光依賴性，從而說明FKF1基因的調控功能受光調節(jié)（Imaizumi et al.，2003）。在長日照條件下，fkf1突變體的開花明顯延遲。ZTL和LKP2基因的mRNA表達高峰在早上，而FKF1基因的mRNA表達高峰出現在下午，其蛋白表達水平在傍晚達最大值，且具有節(jié)律性（Song et al.，2013）。FKF1基因和節(jié)律調控基因GIGANTEA（GI）的表達受生物鐘控制，FKF1蛋白在調節(jié)CO轉錄時需要GI蛋白的參與（Fowler et al.，1999）。長日照下，FKF1蛋白與GI蛋白相互作用降解循環(huán)自由度因子CYCLING DOF FACTORS（CDF）并激活CO轉錄（Sawa et al.，2007）。FKF1蛋白還可調節(jié)CO基因在轉錄水平和轉錄后水平的穩(wěn)定性（Song et al.，2012）。早上CDF轉錄因子抑制CO和FT基因表達;下午FKF1蛋白的活性被激活，與GI蛋白形成復合物，從而降解CDF并誘導CO和FT基因轉錄致使擬南芥提早開花（Fornara et al.，2009）。但短日照下，光線不足會降低FKF1蛋白對GI蛋白的親和力，CDF升高，且無法誘導CO轉錄（霍軼瓊，2019）。另有研究表明，FKF1蛋白能通過多種反饋機制（包括CO的轉錄調控和翻譯后調控），誘導FT促進開花（Fornara et al.，2009）。大豆GmFKF1基因過表達植株在長日照下表現為晚花，在短日照下有一半植株表現為極早花（李芳，2012），說明GmFKF1基因與擬南芥FKF1基因的作用相反。水稻OsFKF1基因在長日照下能促進水稻開花，可互補擬南芥fkf1突變體的晚花表型（霍軼瓊，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】綜上所述，關于FKF1基因研究對象主要是大豆（李芳，2012）、擬南芥（Yuan et al.，2019）和水稻（霍軼瓊，2019）。FKF1基因在不同類型植物中的功能可能存在差異。高羊茅作為多功能草種，具有較大的應用前景。但目前鮮見高羊茅FKF1基因（FaFKF1）的相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究以黔草1號高羊茅為試驗材料，采用RACE和RT-PCR克隆FaFKF1基因并進行生物信息學分析，通過構建GFP融合表達載體轉化煙草進行亞細胞定位分析，同時運用實時熒光定量PCR分析不同光照處理及不同發(fā)育階段的表達模式，為進一步探討FKF1的生物學功能提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的高羊茅品種為黔草1號，由貴州省草業(yè)研究所培育而成，2005年通過國家牧草新品種審定。TRIzolTM RNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶和SYBR Green I熒光定量染料均購自寶生物工程（大連）有限公司;瓊脂糖DNA回收試劑盒購自OMEGA公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司，RACE試劑盒購自TaKaRa公司;引物合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。主要儀器設備：RXZ型智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）、實時熒光定量PCR儀（Eppeddorf，德國）、DYY-6C型瓊脂糖電泳儀（北京六一儀器廠）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad GelDoc）。

1. 2 材料種植及光照處理

選取飽滿的高羊茅種子，流水清洗后用70%消毒酒精進行表面消毒，離心后棄上清液，用ddH2O沖洗3次，再用0.7%次氯酸鈉溶液消毒15 min，離心棄上清液后用ddH2O沖洗。待種子干后均勻點播在MS培養(yǎng)基上，用封口膜封口后4 ℃進行春化。將營養(yǎng)土與蛭石按1∶1比例混合裝盆，提前用水澆透。待培養(yǎng)基上的幼苗長出3～4片葉子時移栽至小花盆中，花盆中加入少許蛭石。將花盆置入光照培養(yǎng)箱中，其中長日照處理（LD，22 ℃，16 h/8 h）、短日照（SD，22 ℃，8 h/16 h），48 h后調節(jié)光照培養(yǎng)箱至連續(xù)光照（LL）和連續(xù)黑暗（DD）處理48 h，最后給于光照/黑暗（L/D，22 ℃，16 h/8 h）和黑暗/光照（D/L，22 ℃ 16 h/8 h）循環(huán)模式，定期澆營養(yǎng)液管理。待生長一個月后從早上8點（ZT0）開始取樣，每4 h取樣一次，分別表示為ZT4、ZT8、ZT12、ZT16和ZT20，連續(xù)取樣48 h。

1. 3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

于幼苗期取0.1 g新鮮高羊茅葉片加入液氮研磨，參照TRIzolTM RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。? μg總RNA，1.0 μL oligo（dT）引物，根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書反轉錄合成cDNA第一鏈，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 FaFKF1基因cDNA序列克隆

1. 4. 1 中間片段擴增 采用ClustalX設計FaFKF1基因中間片段的2條簡并性引物FaFKF1-F1/FaFKF1-R1（表1）。以cDNA為模板進行FaFKF1基因中間片段擴增，反應體系50.0 μL：2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，Ex Taq DNA聚合酶1.0 μL，cDNA模板5.0 μL，上、下游引物FaFKF1-F/FaFKF1-R（10μmol/L）各1.5 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)，PCR產物4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?.8%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物，利用膠回收試劑盒回收純化后送至寶生物工程（大連）有限公司測序進行測序。

1. 4. 2 5′RACE 根據中間片段序列，利用Primer Premier 5.0設計3條特異性5′RACE引物。向反應管中加入SuperScript II RT酶和引物GSP1合成cDNA第一鏈，隨后用RNase Mix去除RNA，對純化后cDNA進行末端加上多聚C，從而獲得dC-tailed cDNA模板。將反應管置于冰上進行第一輪PCR擴增：10×PCR Buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，10 μmol/L 引物GSP2和AAP各2.0 μL，dC-tailed cDNA模板5.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加無菌水補足至50.0 μL，擴增程序同上。再用GSP3引物和通用擴增引物AUAP（10 μmol/L）進行第二輪PCR擴增，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，然后切膠回收純化目的條帶，與pMD18-T連接后，挑選陽性克隆進行測序。

1. 4. 3 3′RACE 使用逆轉錄酶SMARTScribeTM Reverse Transcriptase對總RNA進行逆轉錄合成cDNA，利用引物C413-0和UPM進行第一輪PCR擴增：10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，cDNA模板2.5 μL，10 μmol/L C413-0 1.0 μL，10 μmol/L UPM 5.0 μL，PCR-Grade Water補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃ 30 s和72 ℃ 3 min，進行5個循環(huán);94 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s 、72 ℃ 3 min，進行5個循環(huán);94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行27個循環(huán)。將第一輪PCR產物擴增后稀釋50倍加入引物C413-1和UPM進行第二輪PCR，反應體系和程序同第一輪。按照上述方法對PCR產物回收純化后測序。

利用DNAMAN 6.0將以上3個擴增片段的測序結果進行拼接，從而得到目的基因的cDNA全長序列，將其提交至NCBI數據庫進行比對分析并預測其起始密碼子和終止密碼子。

1. 5 生物信息學分析

利用DNAStar 6.0將拼接獲得的cDNA全長序列翻譯成氨基酸序列，BLAST比對后并下載同源性較高的部分序列;利用ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protp-aram.html）預測分析蛋白的理化性;利用ProtScale（https：//web.expas-y.org/cgi-bin/pro-tscale/protscale.pl）進行蛋白的親/疏水性預測分析;利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpredsopma.pl）分析蛋白的二級結構組成;利用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 6 亞細胞定位

將FaFKF1基因連接至pCAMBIA1300-GFP載體上，以構建pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表達載體，將其轉化GV3101農桿菌感受態(tài)細胞，在含硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基過夜，隨機挑選1個單菌落進行菌落PCR鑒定。加入的乙酰丁香酮（AS）和嗎啉乙磺酸（MES），28 ℃搖床培養(yǎng)OD值約1.0左右。常溫下4000 r/min離心10 min，15 min收集菌體，用含MgCl2重懸菌體至OD值為1.0，加入AS，靜置3 h以上，然后用注射器吸取侵染液注射到葉片內作為處理組，以空載體pCAMBIA1300-GFP的煙草葉片為對照組，72 h后取樣通過激光共聚焦熒光顯微鏡檢測熒光信號。GFP激發(fā)光為488 nm，DAPI激發(fā)光為405 nm。

1. 7 基因表達分析

分別稱取長日照轉連續(xù)光照（LD-LL）和連續(xù)黑暗（LD-DD）、短日照轉連續(xù)光照（SD-LL）和連續(xù)黑暗（SD-DD）、光照和黑暗循環(huán)（L/D和D/L）處理下幼苗期的葉片及長日照處理下不同生長階段（苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期）的高羊茅葉片各0.1 g，提取總RNA，并反轉錄合成cDNA第一鏈，具體方法與1.3相同。將合成的cDNA稀釋20倍作為模板，以FaFKF1-F2/FaFKF1-R2為引物，GAPDH（GA）為內參基因，實時熒光定量PCR檢測不同處理下高羊茅葉片FaFKF1基因的表達情況（羅維等，2020）。

1. 8 數據統(tǒng)計

利用2-△△Ct法計算FaFKF1基因的相對表達量，試驗數據分析和圖表繪制采用Excel 2010。

2 結果與分析

2. 1 高羊茅FaFKF1基因擴增

分別對FaFKF1基因的中間片段（673 bp）、5′端（406 bp）和3′端（1390 bp）序列進行PCR擴增，結果如圖1所示。將三者進行拼接得到FaFKF1基因的cDNA全長序列，大小為2266 bp，開放閱讀框（ORF）為1881 bp，編碼626個氨基酸殘基（圖2）。

2. 2 生物信息學分析結果

將FaFKF1基因編碼的氨基酸序列與其他物種的FKF蛋白進行BLAST對比，結果如圖3所示。該序列與大豆（Glycine max，NP_001235886.2）、大麥（Hordeum vulgare，KAE8795993.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003577479.1）、高粱（Sorghum bicolor，XP_021317207.1）的FKF1蛋白氨基酸序列相似性較高，分別為79.5%、86.5%、87.68%和83.44%。

ProtParam分析結果顯示，FaFK1蛋白分子式為C3037H4740N864O905S33，相對分子量為68.89 kD，等電點（pI）5.76，不穩(wěn)定指數為39.81，酸性氨基酸殘基總數（Asp+Glu）為76，堿性氨基酸殘基總數（Arg+Lys）為61，平均親水系數（GRAVY）為-0.247，脂肪系數為80.99，說明該蛋白為較穩(wěn)定的親水性蛋白。ProtScale預測蛋白親/疏水性結果顯示，蛋白親水性氨基酸均占70%，疏水性氨基酸均占30%，說明FaFKF1蛋白為親水性蛋白（圖4）。SOPMA二級結構分析結果顯示，二級結構包含無規(guī)則卷曲（占44.89%）、α-螺旋結構（占24.92%）、延伸鏈（占23.16%）和β-轉角（占7.03%）（圖5）。

將FaFKF1蛋白的氨基酸序列提交到NCBI數據庫進行BLASTp比對分析，搜索下載不同物種的同源序列，采用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果如圖6所示。FaFKF1蛋白與二穗短柄草、大麥和小麥的FKF1蛋白處于同一小分支，說明三者的親緣關系較近，其中，與二穗短柄草FKF1的親緣關系最近，與大豆、舞草和高粱FKF1的親緣關系較遠。

2. 3 亞細胞定位

將構建的融合表達載體pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP通過農桿菌介導轉染煙草表皮細胞，然后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，結果顯示，對照組細胞核和細胞質可見明顯的綠色熒光，處理組僅在煙草表皮細胞的細胞核檢測到綠色熒光信號，即FaFKF1蛋白定位于細胞核中（圖7）。

2. 4 FaFKF1基因的表達分析結果

2. 4. 1 長日照處理下FaFKF1基因在不同發(fā)育階段的表達情況 利用實時熒光定量PCR檢測長日照處理下FaFKF1基因在高羊茅苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期葉片中的表達情況，結果如圖8所示。FaFKF1基因在不同生長階段的葉片均有表達，整體呈現先上升后下降的趨勢，且4個時期的相對表達量變化趨勢也較相似，均在ZT8時（即下午16：00）達最高峰，呈現出24 h的晝夜節(jié)律。不同的是，FaFKF1基因在孕穗期和抽穗期的相對表達量明顯增加。表明FaFKF1基因主要在抽穗前發(fā)揮調控作用。

2. 4. 2 FaFKF1基因在長日照和短日照分別轉入連續(xù)光照和連續(xù)黑暗下的表達情況 采用實時熒光定量PCR檢測在長日照和短日照分別轉入連續(xù)光照和連續(xù)黑暗處理下高羊茅葉片中FaFKF1基因表達情況，如圖9所示。LD-LL處理下，FaFKF1基因在第1個光周期內ZT0時相對表達量最大，隨著光照時間增加其相對表達量逐漸降低;在第2個光周期也是ZT0處出現一個小的表達峰，在ZT8時相對表達量最大。LD-DD處理下，FaFKF1基因在2個光周期的表達規(guī)律基本一致，且表達峰均出現在ZT0。SD-LL處理下，FaFKF1基因的相對表達量比LD-LL處理下的相對表達量高，在第1個光周期內ZT12處有1個小的表達峰，隨后ZT20時相對表達量達最大值;在第2個光周期的表達峰提前，在ZT4時相對表達量達最大。SD-DD處理下，FaFKF1基因在第1個光周期的相對表達量高于第2個光周期，兩個光周期的表達峰分別出現在ZT4和ZT8。綜上所述，連續(xù)光周期處理后，FaFKF1的表達高峰出現的時間有所改變 ，說明FaFKF1基因能自我調節(jié)從而最大程度適應光照的改變。

2. 4. 3 FaFKF1基因在光照和黑暗循環(huán)處理下的表達情況 FaFKF1基因在L/D處理下的相對表達量最大，在光照ZT8時出現表達峰，第2個光周期ZT20即凌晨相對表達量最大（圖10-A）。L/D-D/L處理下，FaFKF1基因的表達量較L/D處理急劇下降，表達峰都出現在ZT20（圖10-B）。在D/L處理下，FaFKF1基因在第1個光周期開始相對表達量基本無變化，直到ZT16時開始增加，ZT20時達最大，并在第2個光周期內ZT4和ZT12有2個次級表達峰，最高峰仍出現在ZT20（圖10-C）。L/D-L/D處理下，第1個光周期內相對表達量高于第2個光周期，且表達峰均出現在ZT12（圖10-D）。綜上所述，FaFKF1基因在光照時的表達水平高于黑暗時的表達水平。

3 討論

自2000年FKF1基因被克隆以來，其功能不斷被發(fā)掘（Nelson et al.，2000）。FKF1、ZTL和LKP2蛋白的結構相似，同屬于ZTL家族，但三者在光周期調控植物開花途徑中有所不同，其中，ZTL基因在短日照下對開花作用不明顯，而LKP2基因無論長日照還是短日照均能增強擬南芥ztl突變體表型（Somers et al.，2004）。Takase等（2011）通過二級結構預測和三級結構建模確定FKF1蛋白含有LOV結構域，可形成穩(wěn)定的二聚體，表明FKF1蛋白較穩(wěn)定。本研究利用ProtParam預測發(fā)現，FaFKF1蛋白的不穩(wěn)定系數為39.84（<40.00），推測其為穩(wěn)定蛋白，與Takase等（2011）的研究結果一致。利用NCBI數據庫將FaFKF1蛋白與其他物種同源蛋白進行BLAST對比分析，結果發(fā)現其與禾本科植物FKF1蛋白的氨基酸序列相似性較高，且系統(tǒng)發(fā)育進化樹也顯示FaFKF1蛋白與禾本科植物二穗短柄草、大麥和小麥的FKF1蛋白親緣關系較近，進一步說明FaFKF1蛋白的進化關系穩(wěn)定，具有一定的保守性。本研究將構建的融合表達載體pCAMBIA1300-FaFKF1-GFP通過農桿菌介導轉染煙草表皮細胞，然后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，結果顯示，FaFKF1蛋白定位于細胞核，與擬南芥（Tomoyuki et al.，2011）、大豆（李芳，2012）和玉米（劉玲，2014）的FKF1蛋白定位一致。

擬南芥AtFKF1基因在長日照處理下可促進開花，且表達峰出現在早上10點左右，在短日照下促進作用不明顯（Imaizumi et al.，2003），其表達峰較長日照提前3 h。大豆GmFKF1轉基因植株在長日照處理下表現大部分晚花，短日照處理下有一半表現為極早花。大豆GmFKF1基因在長日照下中午12點達表達峰，短日照下早上10點達最大（Li et al.，2013）。水稻OsFKF1基因在長日照下的表達峰時間與野生型（WT）相似，但比fkf1-2突變體要早。洋蔥AcFKF1無論長日照還是短日照表達峰都出現在早上7～8點左右（Taylor et al.，2010）。關于FKF1基因表達的調控研究對象以大豆、水稻等植物居多，鮮見以高羊茅為材料的相關研究報道，其原因可能是高羊茅為六倍體，基因組信息了解較少，大多研究只停留在長日照和短日照光照處理方面。本研究在長日照和短日照基礎上施加不同光照處理，結果發(fā)現無論給予何種光照處理，FaFKF1基因均能通過自身調節(jié)來適應環(huán)境的變化，雖然表達峰出現時間不一致，但整體上能維持24 h的晝夜節(jié)律。目前，研究發(fā)現擬南芥（Yuan et al.，2019）、水稻（霍軼瓊，2019）等FKF1基因在不同組織中均有表達，且均在葉片中的表達水平最高。霍軼瓊（2019）研究證實了FaFKF1基因在水稻中的表達量隨著發(fā)育時期總體呈現先上升后下降的趨勢。本研究對長日照處理下FaFKF1基因的表達模式進行分析，結果發(fā)現FaFKF1基因從早上8：00開始總體呈先升后降的趨勢，該結果與水稻不同發(fā)育時期的表達相似（霍軼瓊，2019）。在苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期其表達峰均出現在ZT8時，即下午16：00，后續(xù)可通過構建超表達載體和基因敲除等方法來進一步驗證高羊茅FaFKF1基因的調控功能。

4 結論

FaFKF1基因在細胞核發(fā)揮作用，且在不同光照下均呈現節(jié)律表達，受光周期的誘導調控。

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收稿日期：2020-10-26

基金項目：國家自然科學基金項目（31860674）;貴州省高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)項目（黔科合平臺人才〔2018〕5634）;貴州省科技計劃項目（黔科合平臺人才〔2020〕5005）

通訊作者：王小利（1977-），https：//orcid.org/0000-0002-2868-9386，研究員，主要從事牧草分子生物學研究工作，E-mail：wangxiao-lizhenyuan@126.com

第一作者：舒健虹，（1972-），https：//orcid.org/0000-0002-7899-3167，高級農藝師，主要從事牧草育種與生物技術研究工作，E-mail： gzsjhong@126.com