親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源運動食品中3種氨基糖苷類抗生素的殘留量

宮明明

（黃淮學(xué)院，河南 駐馬店 463000）

氨基糖苷類抗生素（aminoglycosides，AGs）是一類水溶性堿性抗生素，化學(xué)結(jié)構(gòu)上包含兩個以上氨基糖并由配苷鍵與中心的己糖或戊糖相連[1-2]，是畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域較常使用的獸藥[3-4]。AGs藥物具有耳毒性和腎毒性等毒副作用，人類長期食用其殘留超標(biāo)的食品將會危害人體健康。典型的代表藥物有鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素、潮霉素B、安普霉素等，其中，新霉素、潮霉素B、安普霉素等屬于新型氨基糖苷類抗生素，能同時檢測多種目標(biāo)物的方法標(biāo)準(zhǔn)尚未形成。為了防止通過食物鏈引起人體中毒，特別是以動物性組織為原料制成的動物源性運動食品這類特殊食品，有必要建立一種快速檢測其中這些組分的方法，加強AGs在動物源運動食品中的殘留監(jiān)控。

由于潮霉素B、安普霉素和新霉素屬于強極性化合物，在常規(guī)反相色譜柱上保留性能不佳，強極性和高水溶性也給樣品前處理和色譜分離增加了難度[5-7]。采用溶劑萃取或者固相萃取的前處理方式處理動物源運動食品，目標(biāo)物回收率不理想[8-10]。毛細(xì)管電泳、柱后衍生-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法雖然簡便，但靈敏度不高[11-12]；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法雖靈敏度較色譜方法有所提高，但是流動相中要加入離子對試劑，這會導(dǎo)致系統(tǒng)穩(wěn)定性差以及會出現(xiàn)高離子強度抑制待測物電離的問題[13-14]。然而，親水作用色譜（hydrop interaction liquid chromatography，HILIC）是一種介于正相色譜和反相色譜之間的分離模式，可用于分析強極性和強親水性樣品，以及適用于分離在常規(guī)反相色譜上保留不佳的組分，且易與質(zhì)譜聯(lián)用，可解決多種AGs的分離問題。

本研究通過利用基質(zhì)固相分散（matrix solid phase dispersion，MSPD）技術(shù)對強極性較難分離的3種AGs進(jìn)行提取后，通過優(yōu)化親水交互作用色譜儀器條件以及前處理過程，建立親水交互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（hydrophilic interaction liquid chromatography tandem mass spectrometry，HILIC-MS/MS）法檢測動物源運動食品中3種AGs的殘留量，克服了常規(guī)方法損傷質(zhì)譜的缺陷，提高方法的實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

潮霉素B（純度98.5%）、新霉素（純度99.0%）、安普霉素（純度98.0%）標(biāo)準(zhǔn)品：上海安譜實驗科學(xué)科技有限公司；動物源運動食品（雞胸肉源蛋白棒、牛肉源蛋白棒、乳清蛋白棒、雞胸肉運動代餐粉、牛肉運動代餐粉、蛋白運動能量棒）：市售；乙腈、甲酸（色譜純）：德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

API4000型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Waters公司；Sielc Obelisc R色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）：美國飛諾美公司；InertSustain Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、BEHHILIC色譜柱（2.1mm×100mm，3μm）：日本島津有限公司；TSKgel Amide-80色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）：美國沃特世公司；IKA MS3 basic渦旋混合器：IKA（廣州）儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取2.0 g動物源運動食品、2.0 g二氧化硅填料和2.0 g乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）二鈉鹽混勻，裝入SPE管中，1.0 mL/min的流速下用10.0 mL純水淋洗，再用乙腈-甲酸溶液洗脫，收集洗脫液，定容至2 mL，用0.22 μm濾膜過濾后分析。

1.3.2 色譜條件的優(yōu)化

固定色譜條件：進(jìn)樣量3μL；柱溫35℃；流速0.3mL/min。

色譜柱的選擇：考察色譜柱種類（鍵合相為硅膠的BEH HILIC色譜柱、鍵合相為酰胺基的InertSustain Amide色譜柱、鍵合相為酰胺基的TSKgel Amide-80色譜柱以及鍵合相為含電荷的極性和非極性混合基團的Sielc Obelisc R色譜柱）對3種氨基糖苷類抗生素的分離效果，4種色譜柱中InertSustain Amide色譜柱以10 mmol/L乙酸銨-乙腈（10∶90，V/V）為流動相進(jìn)行等度洗脫，其余3種色譜柱都以1.0%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）為流動相進(jìn)行等度洗脫。

流動相的選擇：考察了水-乙腈（10∶90，V/V）、1.0%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）以及10 mmol/L乙酸銨-乙腈（10∶90，V/V）等溶液的等度洗脫效果，并對甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）流動相體系中不同甲酸含量（0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%）進(jìn)行比較，以樣品的加標(biāo)回收率考察提取效果。

基質(zhì)效應(yīng)的影響：為減少基質(zhì)效應(yīng)，盡量除去動物源運動食品中的干擾物質(zhì)，在上述流動相等度洗脫的基礎(chǔ)上，收集每段淋洗液進(jìn)樣檢測，最終確梯度洗脫程序[15-17]。

1.3.3 質(zhì)譜條件

選用質(zhì)譜檢測器的電噴霧離子源（electrosprayion source，ESI+）模式，離子源電壓為4 200 V，離子源溫度為380 ℃，掃描模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM），其他質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 3種氨基糖苷類抗生素質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Mass spectrometry detection parameters of 3 aminoglycoside antibiotics

1.3.4 方法學(xué)驗證

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：配制不同質(zhì)量濃度（5ng/mL、10ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化好的色譜條件下檢測，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)強度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以信噪比（S/N）=3計算檢出限（limit of detection，LOD），以信噪比（S/N）=10計算定量限（limit of quantitation，LOQ）。

穩(wěn)定性及重復(fù)性實驗：在最優(yōu)條件下，對潮霉素B、安普霉素和新霉素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）進(jìn)行HILICMS/MS檢測分析，連續(xù)測定7 d，每天進(jìn)樣3次，測得3種化合物組分保留時間和峰面積的日間和日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

加標(biāo)回收實驗：在空白樣品中分別添加低（100 μg/kg）、中（250 μg/kg）和高（500 μg/kg）三個水平混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照所建立的方法進(jìn)行樣品前處理及測定，計算加標(biāo)回收率及RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

不同色譜柱對3種氨基糖苷類抗生素的分離效果見圖1。不同鍵合固定相的色譜柱在分離目標(biāo)物組分的過程中保留機制迥異[18-20]，這4款親水作用色譜柱（BEH HILIC色譜柱、Sielc Obelisc R色譜柱、TSKgel Amide-80色譜柱以及InertSustain Amide色譜柱）對3種AGs的分離效果也相差較大，其中BEH-HILIC柱分離3種目標(biāo)物不出峰，其余3種色譜柱可以對目標(biāo)物實現(xiàn)分離。

圖1 3種色譜柱對3種氨基糖苷類抗生素的分離效果Fig. 1 Effect of 3 chromatographic columns on the separation of 3 aminoglycoside antibiotics

由圖1可知，InertSustain Amide色譜柱在以10 mmol/L乙酸銨-乙腈（10∶90，V/V）為流動相等度洗脫模式下，可以實現(xiàn)3種氨基糖胺類抗生素的分離，但潮霉素B、新霉素會出現(xiàn)色譜峰分叉等現(xiàn)象，且目標(biāo)物響應(yīng)強度相應(yīng)較弱；而Sielc Obelisc R色譜柱和TSKgel Amide-80色譜柱在以1%甲酸-乙腈（10∶90，V/V）為流動相等度洗脫模式下，也可實現(xiàn)3種氨基糖苷類抗生素的分離。但以TSKgel Amide-80色譜柱分離的色譜圖不理想，目標(biāo)物峰形有展寬和拖尾現(xiàn)象；而以陽離子極性與非極性混合作用機理模式的Sielc Obelisc R色譜柱上目標(biāo)組分的分離色譜圖效果較好，各組分有較好的分離度，故最終采用Sielc Obelisc R色譜柱。

2.1.2 流動相的選擇

采用Sielc Obelisc R色譜柱分離，不同流動相等度洗脫對3種氨基糖苷類抗生素回收率的影響見圖2。

圖2 3種流動相對3種氨基糖苷類抗生素回收率的影響Fig. 2 Effect of 3 kinds of mobile phase on recovery of 3 aminoglycoside antibiotics

由圖2可知，3種流動相中1.0%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）洗脫效果最好，3種AGs均能被洗脫，這是由于AGs包含多個氨基結(jié)構(gòu)，屬于堿性糖苷，酸性洗脫液易與氨基糖苷類結(jié)合，所以1.0%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）洗脫得到的各分析物回收率高于水-乙腈（10∶90，V/V）洗脫。進(jìn)一步優(yōu)化甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）流動相體系中甲酸含量對洗脫效率的影響，分別用0.05%～1.00%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）進(jìn)行洗脫，計算3種氨基糖苷類抗生素的回收率，結(jié)果見圖3。

圖3 流動相中甲酸含量對3種氨基糖苷類抗生素回收率的影響Fig. 3 Effect of formic acid content in mobile phase on recovery of 3 aminoglycoside antibiotics

由圖3可知，流動相采用0.10%甲酸水溶液-乙腈（10∶90，V/V）洗脫時，各分析物的回收效果最好，回收率范圍為79.1%～92.6%。因此，確定最優(yōu)的流動相為0.10%甲酸水溶液-乙腈。

2.1.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

為了減少質(zhì)譜分析時的基質(zhì)效應(yīng)，盡量除去動物源運動食品中的干擾物質(zhì)，方法采用乙腈-甲酸溶液梯度淋洗以去除干擾物質(zhì)[21-25]。收集每段淋洗液進(jìn)樣檢測，最終確定最優(yōu)流動相及其梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of mobile phase

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在最優(yōu)色譜條件下檢測3種氨基酸糖苷類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定檢出限及定量限，結(jié)果見表3。

表3 3種氨基糖苷類抗生素的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 3 Retention time, standard curve, correlation coefficient, limit of detection and quantification of 3 aminoglycoside antibiotics

由表3可知，3種AGs線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.999 5～0.999 9之間，方法的檢出限均為15 μg/kg，定量限均為50 μg/kg。

2.2.2 穩(wěn)定性與重復(fù)性

在最優(yōu)條件下，潮霉素B、安普霉素和新霉素保留時間的日間和日內(nèi)RSD分別為3.5%～7.9%和3.5%～4.1%；峰面積的日間和日內(nèi)RSD分別為3.6%～7.4%和3.2%～3.9%，說明該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好。

2.2.3 加標(biāo)回收率實驗

在最優(yōu)條件下，潮霉素B、安普霉素和新霉素的加標(biāo)回收率實驗結(jié)果見表4。

表4 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 4 Recoveries and relative standard deviation of the method (n=5)

由表4可知，3種AGs平均加標(biāo)回收率在85.7%～93.6%，回收率實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.1%～5.2%，可以滿足檢測方法的要求。

2.3 實際樣品的檢測

將本方法應(yīng)用于從超市中隨機抽取的5種品牌共10份動物源運動食品樣品，檢測3種AGs的殘留。結(jié)果顯示樣品中3種AGs的含量均低于50μg/kg，均滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中的限量要求。

3 結(jié)論

本研究通過對4種HILIC色譜柱比較和MSPD條件的優(yōu)化，建立了親水交互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源運動食品中3種AGs殘留的分析方法，即樣品經(jīng)Sielc Obelisc R柱分離，采用0.10%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脫。采用該方法3種化合物組分在5～500 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5～0.999 9，檢出限均為15 μg/kg，定量限均為50 μg/kg，保留時間的日間和日內(nèi)RSD分別為3.5%～7.9%和3.5%～4.1%，峰面積的日間和日內(nèi)RSD分別為3.6%～7.4%和3.2%～3.9%，說明該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好。加標(biāo)回收率為85.7%～93.6%，回收率試驗結(jié)果的RSD為3.1%～5.2%。本方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，有效解決了檢測氨基糖苷類抗生素時反相色譜柱上保留性能不佳、回收率低的分析難點，可為動物源運動食品中3種AGs殘留的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。