黃芪甲苷對過敏性鼻炎小鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

田瀅，張飛，段傳新

(湖北省婦幼保健院 耳鼻喉科，武漢 430069)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，亦稱為變應(yīng)性鼻炎，是一種由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)疾病，臨床表現(xiàn)為打噴嚏、鼻癢、鼻塞、流涕等癥狀，可導(dǎo)致患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[1-3]。全球受AR影響的人約占40%，其在我國11個(gè)主要城市中的患病率為8.7%～24.1%，而且發(fā)病率近年來呈上升趨勢[4-5]。目前，治療AR的主要臨床藥物為皮質(zhì)類固醇及抗組胺藥，但無法避免激素抵抗、嗜睡等副作用[6-8]，療效不甚理想。AR，又稱“鼻鼽”，主要由于肺氣虛弱，衛(wèi)陽不固，風(fēng)邪趁虛而入所致。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在千百年的臨床實(shí)踐中對于鼻鼽的治療積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。黃芪，性甘溫，歸肺、脾、肝經(jīng)，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑炎、抗應(yīng)激等作用，黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ)是黃芪的主要活性成分之一，研究表明，黃芪甲苷具有抑炎、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[9-10]，是常用中成藥通竅鼻炎片中的主要藥用成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在AR小鼠模型鼻黏膜組織中高遷移率族蛋白B1(high mobi-lity group box 1 protein，HMGB1)和TLR4蛋白表達(dá)水平升高，而抑制HMGB1/TLR4途徑可減輕小鼠AR癥狀[11]。黃芪甲苷對TLR4/NF-κB信號(hào)通路具有較好的抑制效果[12]，但其對AR中HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響卻鮮有報(bào)道。因此，本研究通過使用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)構(gòu)建AR小鼠模型，觀察黃芪甲苷對AR小鼠的治療效果，同時(shí)檢測AR小鼠體內(nèi)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路變化，旨在探討黃芪甲苷對AR小鼠的療效及其免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物20只SPF級C57BL/6小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，于華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司模型動(dòng)物研究院飼養(yǎng)。

1.2 材料黃芪甲苷、羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；OVA、氫氧化鋁[Al(OH)3]，購自Sigma-Aldrich公司；蘇木精、伊紅染液，中性樹脂，小鼠IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IgE、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)ELISA試劑盒，兔抗HMGB1抗體，兔抗TLR4抗體和兔抗GAPDH抗體，購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；PVDF膜和化學(xué)發(fā)光試劑，購自Millipore公司；兔抗NF-κB p65抗體及兔抗p-NF-κB p65抗體，購自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 AR小鼠模型的構(gòu)建[13]將20只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組：正常組，模型組，黃芪甲苷低、中、高劑量組，每組4只。除正常組外，其他4組小鼠均采用OVA誘導(dǎo)AR模型。造模前14 d進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，采用50 μg OVA+5 mg Al(OH)3+1 mL生理鹽水混合液腹腔注射小鼠，隔天1次。第15天給予5% OVA溶液雙側(cè)鼻腔點(diǎn)鼻，每側(cè)20 μL，1次/ d，連續(xù)激發(fā)7 d。同期正常組小鼠使用等量的生理鹽水處理。

1.3.2 模型評分 在最后一次OVA滴注15 min后，記錄小鼠抓鼻、打噴嚏等癥狀發(fā)生情況；根據(jù)已有報(bào)道[14]，采用疊加法記錄總分，總分>5則為造模成功。(表1)

表1 AR小鼠造模評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 給藥處理 黃芪甲苷低、中、高劑量組分別按照12.5、25.0和50.0 mg/kg的劑量于造模成功后第2天進(jìn)行灌胃給藥處理，正常組和模型組小鼠給予等量的1% CMC-Na灌胃，連續(xù)給藥27 d。

1.3.4 樣本采集 藥物干預(yù)結(jié)束后，于小鼠頸動(dòng)脈取血，離心后分離血清用于ELISA檢測。所有小鼠處死后，從鼻腔中迅速剝離鼻黏膜組織，將其分為2份，一份用于觀察病理變化，另一份提取蛋白用于分子檢測。

1.3.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色 取適量鼻黏膜組織進(jìn)行脫水浸蠟處理，切成厚度為4～5 μm的切片，乙醇脫蠟，二甲苯透明，HE染色；脫水透明后，中性樹脂封片。將染色后的切片置于顯微鏡下觀察其組織形態(tài)及炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.3.6 ELISA檢測 實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，采用雙抗體夾心法測定小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IgE、TGF-β1、ICAM-1和VCAM-1的濃度。

1.3.7 Western blotting檢測 剪碎鼻黏膜組織，將20 mg組織加入200 μL裂解液中，勻漿直至完全裂解。裂解后，4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清液。采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，取20 μg樣本進(jìn)行SDS-PAGE。濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，并用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h。加入稀釋后的一抗(HMGB1，1∶1 000；TLR4，1∶1 000；NF-κB，1∶1 000；p-NF-κB，1∶5 000)，室溫孵育1 h后，PBST漂洗3次。加入抗IgG-HRP二抗，室溫孵育1 h，PBST漂洗3次。加入化學(xué)發(fā)光試劑，充分作用后將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對小鼠鼻部癥狀的影響正常組小鼠基本無抓鼻、打噴嚏、流涕癥狀，而模型組小鼠出現(xiàn)頻繁抓鼻，鼻頭紅腫甚至輕微出血，流清水涕的癥狀，評分為6.25±0.50，提示實(shí)驗(yàn)造模成功。經(jīng)過黃芪甲苷治療后，小鼠癥狀得到緩解，低劑量組的評分為4.00±1.15，中劑量組為3.00±0.00，高劑量組為1.00±0.00。

2.2 黃芪甲苷對鼻黏膜病理變化的影響與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中出現(xiàn)大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、組織水腫等現(xiàn)象，經(jīng)過不同劑量的黃芪甲苷干預(yù)后，組織中的嗜酸性粒細(xì)胞減少，組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)完整，其中，高劑量組的治療效果最佳。(圖1)

圖1 黃芪甲苷對小鼠鼻黏膜組織病理變化的影響(×400)

2.3 黃芪甲苷對血清中相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響與正常組比較，模型組小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-1β、IgE、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1濃度顯著升高(P<0.05)，而IL-10濃度顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，經(jīng)過黃芪甲苷干預(yù)的小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-1β、IgE、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1濃度降低，IL-10濃度升高，特別是中、高劑量組的效果更顯著(P<0.05)。(表2)

表2 黃芪甲苷對小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

2.4 黃芪甲苷對HMGB1/TLR4/NF-κB表達(dá)的影響Western blotting檢測HMGB1、TLR4、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中HMGB1、TLR4及p-NF-κB蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與模型組和低劑量組比較，中、高劑量組的HMGB1、TLR4及p-NF-κB蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。(圖2、圖3)

圖2 Western blotting檢測HMGB1、TLR4和p-NF-κB的表達(dá)

注：A.HMGB1相對表達(dá)量比較；B.TLR4相對表達(dá)量比較；C.p-NF-κB相對表達(dá)量比較。與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05。圖3 黃芪甲苷對小鼠HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白表達(dá)的影響

3 討論

HMGB1是一種高度保守的DNA結(jié)合蛋白，正常生理狀態(tài)下存在于細(xì)胞核內(nèi)，而當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，被釋放到細(xì)胞外，不僅可以刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生多種促炎因子引起炎癥反應(yīng)，還參與了細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在AR患兒的鼻腔沖洗液中水平較高，并與AR的嚴(yán)重程度相關(guān)，推測HMGB1是AR的潛在治療靶點(diǎn)，可通過降低其表達(dá)緩解AR[15]。Shimizu等[17]的研究結(jié)果也證實(shí)，在AR患者的鼻腔分泌物中HMGB1的濃度明顯升高，其通過TLR4上調(diào)細(xì)胞分泌IL-6和IL-8的能力，參與了AR的發(fā)病。有研究報(bào)道，HMGB1可與TLR4結(jié)合，相互作用促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)促炎因子的產(chǎn)生和分泌[18]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，可觸發(fā)TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的上調(diào)，從而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[19]。本研究結(jié)果顯示，AR模型小鼠抓鼻、打噴嚏等癥狀明顯，鼻黏膜組織炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，血清中促炎因子濃度明顯升高，而鼻黏膜組織中HMGB1、TLR4及p-NF-κB蛋白表達(dá)升高，提示在OVA的刺激下，小鼠體內(nèi)HMGB1/TLR4/NF-κB通路被激活和上調(diào)，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

黃芪是一種常用中藥，黃芪甲苷是黃芪的主要成分。Zhou等[12]研究結(jié)果表明，黃芪甲苷可通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制促炎因子的釋放，從而抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，改善腎間質(zhì)纖維化。Leng等[20]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減少IL-6、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的分泌，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮功能障礙的作用(圖4)。因此推測，黃芪甲苷可通過抑制TLR4/NF-κB通路治療AR小鼠。在本研究中，中、高劑量黃芪甲苷干預(yù)可緩解AR小鼠癥狀，減少鼻黏膜組織中炎癥細(xì)胞的浸潤，同時(shí)也降低了血清中IL-4、IL-6、IL-1β、IgE、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的濃度，并使IL-10濃度升高。進(jìn)一步研究其治療相關(guān)作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)小鼠鼻黏膜組織中HMGB1、TLR4及p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著減少。

圖4 黃芪甲苷作用機(jī)制[20]

本研究通過OVA誘導(dǎo)AR小鼠模型，黃芪甲苷對其具有較好的治療效果，改善了AR小鼠癥狀及鼻黏膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤，作用機(jī)制可能與其抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路從而減少促炎因子產(chǎn)生有關(guān)，該研究結(jié)果將為AR的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。但本研究尚存在樣本量小的缺點(diǎn)，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。