氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定瘤胃液中的甲酸和其他6種揮發(fā)性脂肪酸

許麗衛(wèi) 耿梅梅 陳 聞 張麗萍 賀 珍 袁紅朝 彭 燦 李春勇 賀志雄 王久榮

(中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125)

飼糧被反芻動物采食，其碳水化合物在瘤胃微生物發(fā)酵下生成可利用的終產(chǎn)物揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，主要成分是乙酸、丙酸和丁酸，可為反芻動物提供75%以上的代謝能，是最主要的能量來源[1]。碳水化合物在瘤胃的代謝過程中，可以由丙酮酸生成甲酸，而且甲酸在厭氧條件下可以生成二氧化碳和氫，進(jìn)而在產(chǎn)甲烷菌的作用下生成甲烷[2-3]。反芻動物瘤胃甲烷的生成不僅造成動物能量的巨大損失，而且甲烷作為一種重要的溫室氣體，對地球生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生破壞性作用[4-5]。因此，對瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸的檢測，尤其是甲酸的檢測對于深入系統(tǒng)研究反芻動物體內(nèi)碳水化合物的消化代謝及甲烷的生成具有重要的意義。

目前，文獻(xiàn)報道的測定揮發(fā)性脂肪酸的方法主要有離子色譜法[6-8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、氣相色譜法[10-11]、毛細(xì)管電泳法[12]以及微量壓電稱量法[13]。離子色譜法測定甲酸，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點，但是其樣品類型主要有泡菜廢水[6]、河流[7]、生物柴油[8]等，前處理過程復(fù)雜，所需的樣品量大，不適宜瘤胃液這類樣品量少的樣品檢測；氣相色譜-質(zhì)譜法測定水中的有機(jī)酸需要用到有毒的有機(jī)試劑進(jìn)行樣品萃取，不僅操作費時繁瑣，操作過程還會對環(huán)境產(chǎn)生污染[9]，并且甲酸不能在氣相色譜儀的氫火焰離子化檢測器上直接被檢測到，需將其進(jìn)行衍生后才能測定[11]；毛細(xì)管電泳法雖然測定時間短，檢出限低，但僅限于較為干凈的雨水樣品中甲酸和乙酸的測定[12]；微量壓電稱量法電極可循環(huán)，環(huán)保性能好，但其電極制備是難點，且僅限于空氣中甲酸和乙酸的測定[13]。目前，對反芻動物瘤胃碳水化合物代謝及甲烷生成的相關(guān)研究中，所見文獻(xiàn)均涉及到乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸的測定，幾乎未見甲酸的檢測，最主要的原因是缺乏相應(yīng)的檢測瘤胃液中甲酸的方法。

(2)含混，含混又稱之為“晦澀”等，與明晰是相對的。部分文學(xué)作品給讀者一種含混的感覺都不是作者刻意為之，一般構(gòu)成這種含混的原因是語言過于簡短、語序顛倒、多義詞的使用。燕卜遜通過大量的研究和分析表明，讀者對一首詩的解讀可以是多種多樣的，并認(rèn)為含混是優(yōu)秀詩歌的特征。因此他針對文學(xué)作品中出現(xiàn)的含混現(xiàn)象進(jìn)行了歸類總結(jié)，寫成了《含混的七種類型》，后面也會用到其中的一些方法來解讀李商隱的詩歌。

因此，本試驗選用耐水的極性色譜柱，利用25%偏磷酸(m/v)對瘤胃液進(jìn)行處理，低溫高速離心后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行分析，以期建立一種測定瘤胃液中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸的實驗室分析方法，為研究反芻動物瘤胃碳水化合物消化代謝及甲烷的生成提供技術(shù)支撐。

黨的十七屆六中全會審議通過的《中共中央關(guān)于深化文化體制改革，推動社會主義文化大發(fā)展大繁榮若干問題的決定》指出：“深化文化體制改革、推動社會主義文化大發(fā)展大繁榮，進(jìn)一步興起社會主義文化建設(shè)新高潮，對奪取全面建設(shè)小康社會新勝利、開創(chuàng)中國特色社會主義事業(yè)新局面、實現(xiàn)中華民族偉大復(fù)興具有重大而深遠(yuǎn)的意義?！保?］黨的十八大報告中旗幟鮮明地提出：扎實推進(jìn)社會主義文化強(qiáng)國建設(shè)，讓人民享有健康豐富的精神文化生活，是全面建成小康社會的重要內(nèi)容。因此，呂劇故鄉(xiāng)傳承、宣傳、做大呂劇文化，創(chuàng)出一條“呂劇搭臺，經(jīng)濟(jì)唱戲”的產(chǎn)業(yè)發(fā)展之路，對于推動?xùn)|營“黃藍(lán)”經(jīng)濟(jì)區(qū)建設(shè)，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)騰飛具有重大的現(xiàn)實意義。

空氣儲罐由上下封頭、筒體和附著在空氣儲罐上的若干個接管組成，具體見圖1。筒體和封頭采用焊接方法進(jìn)行連接，上封頭頂部設(shè)有安全閥接口，筒體上部設(shè)一出氣口和壓力表接管、中部設(shè)有人孔或者檢查孔、下部設(shè)進(jìn)氣口，下封頭的底部設(shè)有排污口，下封頭的外壁上設(shè)有支座。其中封頭和筒體用材一般為Q235B，Q245R或Q345R。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

偏磷酸購自國藥集團(tuán)有限公司；乙酸、甲酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純，購自阿拉丁試劑公司；超純水為中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室自制。

分別精確稱取1.027 0 g乙酸、0.388 4 g丙酸、0.091 7 g異丁酸、0.181 0 g丁酸、0.043 3 g異戊酸和0.090 5 g戊酸于100 mL容量瓶中，用超純水定容，其中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸濃度分別為10 270、3 884、917、1 810、433、905 μg/mL，作為儲備液A，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精確稱取0.121 0 g甲酸于10 mL容量瓶中，配制成濃度為12 100 μg/mL的溶液作為儲備液B，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備；以儲備液B為母液，配制成濃度為242.0 μg/mL的溶液作為儲備液C。試驗樣品為中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所畜禽健康養(yǎng)殖研究中心提供的湘東黑山羊和荷斯坦奶牛的瘤胃液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

ZHANG Xiao-xi, ZUO Qiao, LIU Jian-min, HUANG Qing-hai, XU Yi, ZHAO Rui, YANG Peng-fei, HONG Bo

1.3 色譜條件

Agilent DB-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升溫條件：60 ℃，保持2 min，然后以20 ℃/min升至220 ℃，保持0.5 min；進(jìn)樣口：250 ℃；離子源：230 ℃；四級桿：150 ℃；質(zhì)譜接口：220 ℃。流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：50∶1，選擇離子掃描模式，定量離子選擇質(zhì)荷比(m/z)：甲酸46，輔助定量離子45、29；乙酸43，輔助定量離子60、45；丙酸74，輔助定量離子73、75；異丁酸43，輔助定量離子41、73；丁酸60，輔助定量離子73、42；異戊酸60，輔助定量離子43、87；戊酸60，輔助定量離子73、41。

1.4 樣品制備

以S4作為供試品，按照1.3色譜條件測定，重復(fù)測定7次，考察所建立方法的精密性；以山羊和奶牛瘤胃液樣品為供試品，分別平行取樣3份按1.4進(jìn)行樣品處理后，經(jīng)1.3色譜條件測定，考察所建立方法的重復(fù)性；以山羊和奶牛瘤胃液樣品為供試品，分別取瘤胃液樣品0.5 mL，各加入100 μL 25%偏磷酸，然后分別向其中加入乙酸、甲酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的儲備液，即分別向其中加入儲備液A 20 μL，儲備液C 50 μL；儲備液A 40 μL，儲備液C 100 μL；儲備液A 60 μL，儲備液C 200 μL，按1.4處理方法將其制成待測溶液，按1.3色譜條件上機(jī)測定加標(biāo)回收率以及驗證方法的普適性。

1.5 試驗條件優(yōu)化

大港油田主體位于濱海新區(qū)和渤海新區(qū)，真正具備油田征地條件的陸地面積不足4000平方千米。如何實現(xiàn)與地方共同、協(xié)調(diào)和綠色發(fā)展？大港油田探索出了一條地質(zhì)工程一體化開展平臺式井叢場節(jié)約用地鉆井建產(chǎn)的道路。

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent，美國)，配備有電子轟擊(EI)離子源和四級桿質(zhì)量分析儀，自動進(jìn)樣器；CR22 GⅡ冷凍離心機(jī)(日立，日本)；Classic DI超純水系統(tǒng)(ELGA，英國)；0.22 μm濾膜(希波氏，中國)。

1.5.1 樣品與25%偏磷酸體積比的選擇

以瘤胃液樣品為試驗樣品，充分混勻，18 000 r/min離心10 min，取上層清液。將上層清液與25%偏磷酸分別按照體積比為6∶1、7∶1、8∶1、9∶1和10∶1的比例混合均勻，靜置30 min后，4 ℃條件下18 000 r/min離心10 min，取上層清液過0.22 μm濾膜后，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。以上層清液與25%偏磷酸的體積比為橫坐標(biāo)，各對應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)作圖。

以瘤胃液樣品為試驗樣品，分別對樣品與25%偏磷酸的體積比以及25%偏磷酸的處理時間進(jìn)行優(yōu)化。

1.5.2 25%偏磷酸處理時間的選擇

由圖2可知，25%偏磷酸處理時間在0.5～12.0 h內(nèi)，不同處理時間對目標(biāo)物峰面積幾乎無影響，因此處理時間在0.5 h以上即可。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

將儲備液A和儲備液B混合稀釋，并按照樣品與25%偏磷酸體積比為9∶1混合均勻，配制成各目標(biāo)物濃度(表1)的S1、S2、S3、S4、S5、S6系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)(X)，目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)作圖，得線性回歸方程；以目標(biāo)物3倍信噪比的濃度為其檢出限，10倍信噪比的濃度為其定量限。

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度

1.7 方法的精密性、重復(fù)性和回收率考察

將瘤胃液樣品4 ℃解凍，充分混勻，18 000 r/min離心10 min，取上層清液。將上層清液與25%的偏磷酸按照9∶1(v∶v)比例混合均勻，靜置0.5 h后，4 ℃條件下18 000 r/min離心10 min，取上層清液過0.22 μm濾膜，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品與25%偏磷酸體積比的選擇

由表1可知，甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸分別在0.8～121.0 μg/mL、0.3～3 081.0 μg/mL、0.4～1 165.2 μg/mL、0.4～275.1 μg/mL、0.2～543.0 μg/mL、0.5～129.9 μg/mL和 0.4～271.5 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.998以上，檢出限(3倍信噪比)分別為0.252、0.098、0.105、0.124、0.069、0.148和0.116 μg/mL，結(jié)果見表2。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中甲酸和其他6種揮發(fā)性脂肪酸的總離子流圖見圖3。圖3樣品中甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的濃度分別為28.4、1 715.5、894.2、35.1、154.8、22.6和34.3 μg/mL。

圖1 樣品與25%偏磷酸體積比的選擇對目標(biāo)物的影響

2.2 25%偏磷酸處理時間的選擇

以瘤胃液樣品為試驗樣品，充分混勻，18 000 r/min離心10 min，取上層清液。將上層清液與25%偏磷酸按照體積比9∶1的比例混合均勻后，分別靜置0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0和12.0 h后，4 ℃條件下18 000 r/min離心10 min，取上層清液過0.22 μm濾膜后，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。以25%偏磷酸處理時間為橫坐標(biāo)，各對應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)作圖。

圖2 25%偏磷酸處理時間對目標(biāo)物的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

由圖1可知，當(dāng)樣品與25%偏磷酸的體積比在6∶1～10∶1時，各個目標(biāo)物的峰面積基本保持不變，為了操作方便，選擇樣品與25%偏磷酸的體積比為9∶1。

1：乙酸；2：甲酸；3：丙酸；4：異丁酸；5：丁酸；6：異戊酸；7：戊酸。

表2 甲酸和其他6種揮發(fā)性脂肪酸的線性方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)以及檢出限

2.4 方法的精密性、重復(fù)性和回收率考察

方法精密性檢測結(jié)果表明，各色譜峰保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過0.5%，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過5.0%，說明本方法精密性良好；方法的重復(fù)性檢測結(jié)果表明，各色譜峰保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過0.5%，各色譜峰的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過5.0%；回收率檢測結(jié)果表明，山羊瘤胃液樣品的加標(biāo)回收率為91.8%～103.8%，結(jié)果見表3；奶牛瘤胃液樣品的加標(biāo)回收率為78.7%～95.2%，結(jié)果見表4。加標(biāo)回收率結(jié)果表明該方法對反芻動物瘤胃液樣品中揮發(fā)性脂肪酸的測定具有普適性。

表3 山羊瘤胃液樣品中甲酸和其他6種揮發(fā)性脂肪酸的加標(biāo)回收率

表4 奶牛瘤胃液樣品中甲酸和其他6種揮發(fā)性脂肪酸的加標(biāo)回收率

3 討 論

瘤胃液中含有大量的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及微生物等雜質(zhì)，如果不能去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，加上微生物的活動，將導(dǎo)致瘤胃液樣品即使當(dāng)天過濾澄清以后，不僅很快又會變得渾濁，阻塞測樣系統(tǒng)如進(jìn)樣針等，而且還會造成揮發(fā)性脂肪酸的損失。加入25%偏磷酸，既可以去除大部分蛋白質(zhì)和脂質(zhì)物質(zhì)，同時還可以固定揮發(fā)性脂肪酸，抑制揮發(fā)性脂肪酸的揮發(fā)。

證明 (1)由τCSI?τ,clX{x}?clCSI(X){x},下證clCSI(X){x}?clX{x},只需證XclX{x}?XclCSI(X){x}。注意到XclCSI(X){x}=intCSI(X)(X{x})及XclX{x}?X{x},于是又只需證XclX{x}∈τCSI即可。

正常情況下，甲酸在瘤胃液內(nèi)為中間產(chǎn)物，濃度較低，一般在0～46 μg/mL，很快被瘤胃壁吸收或微生物利用。與甲酸相比，瘤胃液中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸等揮發(fā)性脂肪酸的濃度要高很多，易于檢測。因此，在提升甲酸檢測靈敏度的同時，還要兼顧其他揮發(fā)性脂肪酸檢測的準(zhǔn)確性，以及它們的濃度對色譜柱造成的損傷。甲酸的揮發(fā)性較強(qiáng)，即使其濃度較低，仍不能通過常規(guī)的濃縮方法來增加樣品量進(jìn)行富集，因為處理過程中會造成目標(biāo)物的極大損失，難于檢測其準(zhǔn)確濃度甚至不能檢測出。本方法中甲酸的線性范圍最高為121.0 μg/mL，完全可以滿足反芻動物瘤胃液樣品的檢測。

本試驗建立的方法利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的選擇離子模式，減少了其他非目標(biāo)離子的干擾，提高了檢測的靈敏度，而且所需樣品量較少，1 mL的樣品即能滿足測定需求，且在反芻動物瘤胃液樣品中具有普適性。因此，本方法的實驗室可操作性強(qiáng)，實驗室人員易于上手，利于檢測方法的推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

本試驗建立了一種采用外標(biāo)法測定瘤胃液中甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。這7種組分色譜峰保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5%，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，線性相關(guān)系數(shù)均在0.998以上，檢出限(3倍信噪比)在0.069～0.252 μg/mL；山羊和奶牛瘤胃液樣品的加標(biāo)回收率分別為91.8%～103.8%和78.7%～95.2%。該方法前處理簡單，樣品用量少，靈敏度高，易于實驗室中檢測瘤胃液中甲酸及其他揮發(fā)性脂肪酸，可為系統(tǒng)研究反芻動物瘤胃碳水化合物代謝及甲烷生成提供技術(shù)支撐。