高能飼糧對(duì)育成期蛋雞肝臟miRNA表達(dá)譜的影響

王星果 盧 建,2* 關(guān)樹(shù)勇 曲 亮 孫平江 郭 軍 胡玉萍 竇套存 馬 猛 李永峰 王克華**

(1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095；3.江蘇峪口禽業(yè)有限公司，宿遷 223733)

隨著我國(guó)蛋雞市場(chǎng)日趨飽和，蛋雞業(yè)正在從數(shù)量增長(zhǎng)模式向質(zhì)量提高模式轉(zhuǎn)變，這就需要對(duì)蛋雞的生產(chǎn)性能作進(jìn)一步改善。影響蛋雞生產(chǎn)性能的因素復(fù)雜，其中營(yíng)養(yǎng)水平是一個(gè)很重要的因素，營(yíng)養(yǎng)水平過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響蛋雞的健康，降低蛋雞的生產(chǎn)效益[1]。對(duì)蛋雞的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控可以從能量[2]、蛋白質(zhì)[3]、維生素[4]和礦物質(zhì)[5]水平等方面進(jìn)行，其中能量水平的調(diào)控以往不夠重視，但隨著科學(xué)研究的深入，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到能量水平對(duì)蛋雞的生長(zhǎng)發(fā)育及生產(chǎn)性能有著重要影響[6]。再加上對(duì)節(jié)約飼糧成本的考慮，人們更加重視能量水平對(duì)蛋雞生長(zhǎng)和生產(chǎn)的調(diào)控[7]，其中對(duì)育成期蛋雞能量水平進(jìn)行調(diào)控是其中的一個(gè)方向。

肝臟作為雞物質(zhì)代謝特別是脂質(zhì)代謝的主要器官，攝入的能量物質(zhì)主要在肝臟中進(jìn)行代謝，肝臟對(duì)育成期蛋雞的能量調(diào)控起著關(guān)鍵作用。miRNA是近年來(lái)研究較熱的一類小分子物質(zhì)，其通過(guò)靶向調(diào)控功能基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控各種生物過(guò)程，在肝臟中也發(fā)揮了重要作用，特別是對(duì)肝臟代謝[8-10]。因此，研究雞肝臟miRNA特別是育成期蛋雞能量調(diào)控后肝臟miRNA具有重要意義，且目前尚無(wú)其表達(dá)譜的相關(guān)研究，對(duì)此進(jìn)行研究很有必要。有關(guān)育成期蛋雞能量調(diào)控的研究集中在對(duì)調(diào)控后蛋雞的表觀特征進(jìn)行闡述，如呂秋鳳等[11]用4種不同能量水平的飼糧飼喂育成期蛋雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高能組可顯著提高蛋雞的體重；張李俊等[12]用3種不同能量水平的飼糧飼喂育成期蛋雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中高能組蛋雞的體重顯著高于低能組，產(chǎn)蛋率也高于低能組；李娜等[13]用5種不同能量水平的飼糧飼喂育成期蛋雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)次高能組蛋雞的體重和屠宰性能均顯著高于低能組。研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA在雞肝臟代謝中發(fā)揮了重要作用，如miR-122通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因脂肪酸結(jié)合蛋白5(FABP5)、脯氨酰羥化酶alpha亞基(P4HA1)和泛酰巰基乙胺酶1(VNN1)等對(duì)肝臟代謝起調(diào)控作用[14-16]；miR-33通過(guò)靶向抑制基因脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(FTO)、肉毒堿氧辛基轉(zhuǎn)移酶(CROT)等的表達(dá)進(jìn)而對(duì)肝臟代謝起調(diào)控作用[17-18]。有關(guān)雞miRNA表達(dá)譜的研究很少，如性成熟啟動(dòng)前后下丘腦miRNA表達(dá)譜、皮質(zhì)酮處理的雛雞法氏囊miRNA表達(dá)譜、經(jīng)選育的肉雞胸肌miRNA表達(dá)譜研究[19-21]。

本課題組前期研究了育成期能量攝入量對(duì)蛋雞體重和產(chǎn)蛋性能的影響，使用4種不同能量水平飼糧飼喂育成期蛋雞，發(fā)現(xiàn)12～21周齡時(shí)不同能量組之間蛋雞的體重始終保持極顯著差異，高能組>中高能組>中低能組>低能組；能量水平越高，開(kāi)產(chǎn)日齡越早，低能組、中低能組和中高能組集中在22周齡開(kāi)產(chǎn)，高能組在21周齡開(kāi)產(chǎn)，且高能組的開(kāi)產(chǎn)日齡極顯著早于其他各組；不同能量組43周齡時(shí)的產(chǎn)蛋數(shù)也有差異，高能組顯著高于其他各組；但尚未進(jìn)行miRNA相關(guān)研究。本研究選取高能組和低能組飼糧飼喂育成期蛋雞，并對(duì)其肝臟miRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，分析其表達(dá)譜，對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能研究，為探明肝臟miRNA在高能飼糧對(duì)蛋雞生產(chǎn)性狀的調(diào)控中所起的作用，進(jìn)而為改善蛋雞生產(chǎn)性狀打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

以江蘇省家禽科學(xué)研究所選育的如皋黃雞蛋雞為試驗(yàn)動(dòng)物。選取體重相近的9周齡母雞160只，隨機(jī)分成2個(gè)組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，分別定量飼喂代謝能水平為10.88(低能組)和12.14 MJ/kg(高能組)的飼糧。前8周常規(guī)飼養(yǎng)，18周齡后自由采食相同營(yíng)養(yǎng)水平的標(biāo)準(zhǔn)飼糧，試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，以粉料形式分9～18周齡和19～20周齡2個(gè)階段配制及飼喂。蛋雞的采食量、能量攝入量及體重見(jiàn)表2，以平均值表示，使用SPSS 19.0軟件中的t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。9～16周齡在育成雞舍4層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)(5只/籠)，17周齡起在產(chǎn)蛋雞舍3層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)(1只/籠)。整個(gè)試驗(yàn)期間，所有雞只自由飲水，常規(guī)光照和免疫。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 蛋雞的采食量、能量攝入量及體重

1.2 樣品采集與small RNA測(cè)序

于20周齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只蛋雞，稱重后每組選取最接近平均體重的3只，屠宰后取肝臟組織，放入液氮保存。

采用TRIzol提取肝臟組織總RNA，使用Agilent 2100毛細(xì)管電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，采用Illumina的Truseq small RNA樣品準(zhǔn)備試劑盒構(gòu)建small RNA文庫(kù)，PCR擴(kuò)增富集，加上測(cè)序接頭和Index部分，并通過(guò)凝膠電泳純化，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，Illumina Hiseq平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。

1.3 miRNA序列分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)去除接頭后進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，得到純凈序列，對(duì)序列長(zhǎng)度在18 nt以上的純凈序列進(jìn)行去重處理后，得到唯一序列，使用Bowtie程序?qū)⒓儍粜蛄泻臀ㄒ恍蛄信c雞基因組比對(duì)，能比對(duì)上的序列進(jìn)行后續(xù)分析。

將后續(xù)分析序列與miRBase中的已知miRNA成熟序列和前體序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)比對(duì)上的序列進(jìn)行注釋并以各相應(yīng)成熟miRNA為單位統(tǒng)計(jì)表達(dá)量。剩余序列與雞基因組中其余非編碼RNA(rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA)進(jìn)行比對(duì)并注釋。

對(duì)注釋到已知miRNA的序列表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用DESeq分析表達(dá)差異miRNA，按照表達(dá)量倍數(shù)差異(fold change)>2.0或<0.5和表達(dá)差異顯著性P<0.05篩選出差異表達(dá)miRNA。根據(jù)前期鑒定的高能組和低能組肝臟差異表達(dá)基因，以高能組上調(diào)miRNA對(duì)應(yīng)下調(diào)基因，下調(diào)miRNA對(duì)應(yīng)上調(diào)基因，以差異表達(dá)基因mRNA的3′UTR序列為目標(biāo)序列，應(yīng)用miRanda軟件對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因和靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)。采用超幾何分布對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 蛋雞肝臟small RNA測(cè)序質(zhì)量分析

2組蛋雞肝臟small RNA經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序，得到原始序列，結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出，6個(gè)樣品測(cè)得的原始序列均在千萬(wàn)以上，而純凈序列/原始序列很高，集中在83%～89%，說(shuō)明低質(zhì)量的序列較少，測(cè)序效果較好。高能組與低能組相比，原始序列和純凈序列的數(shù)量均相當(dāng)，說(shuō)明2組測(cè)序質(zhì)量相近。

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)初步分析

2.2 蛋雞肝臟miRNA鑒定

將各樣品純凈序列去重后的唯一序列與雞參考基因組比對(duì)，比對(duì)上的序列再與miRBase中的miRNA及前體作比對(duì)，對(duì)其進(jìn)行注釋，得到每個(gè)樣品注釋到的miRNA及前體，結(jié)果見(jiàn)表4。從表中可以看出，6個(gè)樣品能注釋到的miRNA均超過(guò)300個(gè)，占miRBase中已鑒定的雞miRNA的近1/3。從前體結(jié)果可見(jiàn)每個(gè)樣品鑒定出的miRNA有少部分定位在同一個(gè)前體上。各樣品注釋到miRNA的純凈序列占全部純凈序列的比例都在50%左右。表5顯示了注釋到各非編碼RNA的純凈序列情況，幾種主要的非編碼RNA中，miRNA比其他非編碼RNA多1～3個(gè)數(shù)量級(jí)。以上結(jié)果表明，miRNA在雞肝臟中數(shù)量及含量都很多，說(shuō)明其具有重要的作用。

表4 miRNA數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表5 非編碼RNA純凈序列統(tǒng)計(jì)

2.3 高能飼糧對(duì)蛋雞肝臟miRNA表達(dá)量的影響

將高能組和低能組樣品中鑒定出的miRNA表達(dá)量進(jìn)行比較分析，篩選出差異表達(dá)miRNA，結(jié)果見(jiàn)表6。從表中可以看出，與低能組相比，高能組有2個(gè)上調(diào)miRNA(miR-1684a-3p和miR-1682)，6個(gè)下調(diào)miRNA(miR-15a、miR-203a、miR-144-5p、miR-19b-3p、miR-29c-3p和miR-29a-3p)。其中miR-1684a-3p差異最明顯，相差了200多倍，而miR-1682在低能組中未檢測(cè)出，其可能在高能組具有特殊作用。

表6 差異表達(dá)miRNA

2.4 肝臟差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)

課題組前期鑒定出高能組和低能組肝臟差異表達(dá)基因188個(gè)，其中高能組上調(diào)82個(gè)，下調(diào)106個(gè)，對(duì)高能組和低能組差異表達(dá)的8個(gè)miRNA運(yùn)用miRanda進(jìn)行差異表達(dá)基因的靶基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)出41個(gè)潛在靶基因，結(jié)果見(jiàn)表7。由表可以看出，其中miR-15a預(yù)測(cè)出的靶基因最多，為26個(gè)，而miR-1682預(yù)測(cè)出的靶基因最少，為3個(gè)。miR-29c-3p與miR-29a-3p由于只有末尾差1個(gè)堿基，其種子序列相同，故其預(yù)測(cè)靶基因也相同。

表7 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)

2.5 肝臟差異表達(dá)miRNA靶基因功能分析

2.5.1 GO功能富集分析

對(duì)高能組和低能組差異表達(dá)miRNA的預(yù)測(cè)差異表達(dá)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)有192個(gè)顯著富集的GO功能，其中147個(gè)富集在生物過(guò)程(biological process, BP)，11個(gè)富集在細(xì)胞組分(cellular component, CC)，36個(gè)富集在分子功能(molecular function, MF)。圖1顯示了富集最顯著的20個(gè)GO功能，其中富集較多的是免疫系統(tǒng)過(guò)程正調(diào)控和分子功能正調(diào)控，涉及的基因有整合素亞基beta3(ITGB3)、RAB7B RAS癌基因家族成員(RAB7B)、甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)、淋巴細(xì)胞抗原96(LY96)(免疫系統(tǒng)過(guò)程正調(diào)控)和RAB7B、鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶激活物1A(GUCA1A)、RasGEF結(jié)構(gòu)域家族成員1C(RASGEF1C)、G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子6(RGS6)、印度hedgehog信號(hào)分子(IHH)、ARFGEF家族成員3(ARFGEF3)、高遷移率組核小體結(jié)合結(jié)構(gòu)域3(HMGN3)、谷氧還蛋白(GLRX)(分子功能正調(diào)控)，分別是5和8個(gè)，占總差異表達(dá)基因的12.2%和19.5%，說(shuō)明它們是較為重要的GO功能。

圖1 差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)差異表達(dá)靶基因GO富集分析：富集最顯著的20個(gè)功能

2.5.2 KEGG信號(hào)通路富集分析

對(duì)高能組和低能組差異表達(dá)miRNA的預(yù)測(cè)差異表達(dá)靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)顯著富集的KEGG信號(hào)通路。表8顯示了顯著富集的KEGG信號(hào)通路及其涉及的基因，其中脂肪酸延長(zhǎng)、非不飽和脂肪酸生物合成與脂質(zhì)代謝相關(guān)，吞噬體與免疫相關(guān)，光轉(zhuǎn)導(dǎo)與視覺(jué)相關(guān)，提示差異表達(dá)miRNA可能影響這幾個(gè)信號(hào)通路。

表8 差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)差異表達(dá)靶基因KEGG富集分析

3 討 論

測(cè)序是現(xiàn)今運(yùn)用廣泛的組學(xué)技術(shù)，且隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，數(shù)據(jù)的容量和質(zhì)量都有了很大提高，現(xiàn)在常用的small RNA測(cè)序數(shù)據(jù)量一般都在一千萬(wàn)以上原始序列[19,22]，本研究small RNA測(cè)序所得原始序列就在10 000 000以上。同時(shí)本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，能比對(duì)上miRNA的序列比例較高，且比其他非編碼RNA所占比例多1～3個(gè)數(shù)量級(jí)。結(jié)果表明，本研究miRNA測(cè)序所得數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，后期分析結(jié)果較準(zhǔn)確，置信度更高。

在對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行分析的過(guò)程中，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上調(diào)的2個(gè)miRNA(miR-1682和miR-1684a-3p)在低能組無(wú)表達(dá)或痕量表達(dá)，提示它們?cè)谀芰繑z入量對(duì)肝臟的影響中發(fā)揮了很重要的作用，而這2個(gè)miRNA暫無(wú)功能研究報(bào)道，因此有必要進(jìn)行更深入的研究。

使用本課題組前期鑒定的低能組和高能組肝臟差異表達(dá)基因作為候選基因進(jìn)行差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)，可將有效靶基因的范圍大大縮小，陽(yáng)性率也更高，其他研究者也有運(yùn)用此方法的良好例子(差異表達(dá)miRNA與差異表達(dá)基因聯(lián)合分析)[23-26]。miR-15a的預(yù)測(cè)靶基因數(shù)最多，提示其可能在能量攝入量對(duì)肝臟的影響中作用更明顯。

在GO功能富集分析中，富集較多的主要是與免疫和分子功能調(diào)控相關(guān)的功能，說(shuō)明miRNA是通過(guò)調(diào)控免疫和分子功能相關(guān)的基因進(jìn)而調(diào)控這些過(guò)程的。之前本課題組分析育成期高能和低能飼糧飼喂的蛋雞肝臟中差異表達(dá)基因的GO功能，也發(fā)現(xiàn)富集較多的有免疫相關(guān)功能，提示免疫相關(guān)過(guò)程受miRNA調(diào)控更多。由此表明，能量攝入量能直接或間接影響蛋雞的免疫功能。

在KEGG信號(hào)通路富集分析中，也發(fā)現(xiàn)了與免疫相關(guān)的信號(hào)通路顯著富集——吞噬體，吞噬體在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)起到抗原呈遞、降解以及激活免疫的作用，是免疫過(guò)程中十分重要的環(huán)節(jié)[27-28]。吞噬體也能受到外界環(huán)境的影響，如洋蔥伯克氏菌感染能延遲吞噬體成熟[29]。推測(cè)能量攝入量的差異通過(guò)影響miRNA的表達(dá)進(jìn)而影響蛋雞肝臟的吞噬體等免疫相關(guān)信號(hào)通路。除免疫相關(guān)信號(hào)通路，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路顯著富集，這與Agrawal等[30]使用高能飼糧飼喂奶牛，KEGG分析發(fā)現(xiàn)血液白細(xì)胞中差異表達(dá)基因顯著富集在不飽和脂肪酸氧化磷酸化以及Toll樣受體信號(hào)通路的結(jié)果類似。這提示miRNA主要影響免疫和脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路。

4 結(jié) 論

綜上所述，對(duì)育成期蛋雞進(jìn)行高能飼糧飼喂可通過(guò)調(diào)控miR-15a等幾個(gè)miRNA上調(diào)或下調(diào)肝臟中免疫和脂質(zhì)代謝相關(guān)靶基因的表達(dá)，最終調(diào)控蛋雞的免疫和脂質(zhì)代謝，并影響生產(chǎn)性能。