菊粉對斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率及抗氧化能力的影響

王維康 陳代文 余 冰 黃志清 毛湘冰 鄭 萍 虞 潔 羅鈞秋 羅玉衡 閻 輝 何 軍

(四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，動物抗病營養(yǎng)四川省重點實驗室，成都 611130)

仔豬斷奶后消化系統(tǒng)和免疫器官尚沒有發(fā)育完全，加之斷奶過程中環(huán)境改變和飼糧攝入改變所帶來的應激，斷奶導致仔豬對養(yǎng)分消化吸收下降、抗病能力下降、腹瀉率增加，最終導致仔豬產生“斷奶仔豬應激綜合征”[1-2]。飼糧纖維在小腸內不被消化吸收，但可在大腸被發(fā)酵，可降低血糖、血脂，預防高血壓、高血脂、高血糖及結腸癌等疾病。隨著對飼糧纖維結構和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)飼糧纖維可改善腸道微生物群落結構及其代謝產物，維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而促進營養(yǎng)物質的吸收和改善腸道健康[3-4]。菊粉是一種綠色天然的膳食纖維。菊粉的聚合度一般在2～60，平均聚合度為10[5]。大量水果蔬菜中可以分離出菊粉，如香蕉、蘆筍、韭菜和洋蔥。目前工業(yè)生產菊粉大多數(shù)是從菊苣和菊芋中加工提取[6]。作為一種膳食纖維，菊粉在哺乳動物小腸內不能被消化吸收，但在后腸可以被微生物發(fā)酵分解[7]。研究表明，腸道細菌發(fā)酵膳食纖維會產生大量揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，如乙酸、丙酸和丁酸，可作為腸上皮細胞的能量來源，并可預防各種炎癥[8-9]。此外，菊粉可通過增加有益菌群的數(shù)量和代謝活性來改善斷奶仔豬腸道功能和胃腸道環(huán)境[10]。然而到目前為止，菊粉對畜禽抗氧化的研究應用效果還鮮有報道。本試驗通過在斷奶仔豬基礎飼糧中添加不同水平的菊粉，研究菊粉對斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分消化率和抗氧化能力的影響，以期為斷奶仔豬中菊粉的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗采用單因子設計，選取32頭平均體重為(7.10±0.20)kg的杜長大(DLY)斷奶仔豬，隨機分為4組，每組8個重復，每個重復1頭豬。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組分別在基礎飼糧中添加2.5、5.0和10.0 g/kg的菊粉(等量替代基礎飼糧中的玉米)。試驗期21 d。

1.2 基礎飼糧

玉米-豆粕型基礎飼糧參照NRC(2012)中7～11 kg斷奶仔豬的營養(yǎng)需要進行配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗在四川農業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所試驗場進行。試驗使用的圈舍和代謝籠多次沖洗后，用消毒劑消毒，24 h后再次沖洗，然后用2∶1比例的甲醛與高錳酸鉀熏蒸圈室，熏蒸持續(xù)24 h，全程門窗密閉，結束后通風3 d。試驗期間嚴格按照斷奶仔豬飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)，每日飼喂3次(08:00、14:00和20:00)，每次喂食遵循多次少量原則，自由飲水。圈舍衛(wèi)生每日清掃，每周消毒。試驗期間早晚觀察仔豬精神狀態(tài)，并記錄每日采食量與腹瀉情況。

1.4 樣品采集

1.4.1 飼糧與糞便樣品收集

采用四分法收集飼糧樣品，每個組取500 g左右，裝入樣品袋，記號，放入-20 ℃冰箱保存，用于常規(guī)養(yǎng)分的分析。在試驗第18～21天對所有仔豬采用內源指示劑法進行消化試驗，采用部分收糞法收集糞便。

1.4.2 血清樣品收集

于試驗開始后第21天早上，對空腹仔豬前腔靜脈采血15 mL，置于普通離心管，室溫下放置30 min后，4 ℃、3 000×g離心10 min，分離血清，置于-20 ℃保存，待測血清抗氧化指標。

1.4.3 組織樣品收集

于試驗第21天早上仔豬采血后，立即進行屠宰，取出肝臟、小腸等內臟。采集多份肝臟樣品于凍存管中，用錫箔紙包嚴放入液氮，然后轉至-80 ℃凍存。使用生理鹽水對小腸段進行沖洗，待洗凈殘留在腸段上的食糜后，用載玻片將十二腸、空腸、回腸黏膜刮下來，然后置于無菌EP管中，迅速用錫箔紙包嚴放入液氮，然后轉至-80 ℃凍存。

1.5 指標測定

1.5.1 生長性能測定

在試驗第1天和第21天08:00對仔豬進行空腹稱重，統(tǒng)計仔豬每日采食量，分別計算平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)。

1.5.2 養(yǎng)分表觀消化率測定

消化試驗采用內源指示劑法，利用鹽酸不溶灰分(AIA)為指示劑。飼糧養(yǎng)分表觀消化率計算公式為：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-(A1×F2/A2×F1)×100。

式中：F1是飼糧中該養(yǎng)分含量(%)；F2是糞中該養(yǎng)分含量(%)；A1是飼糧中AIA含量(%)；A2是糞中AIA含量(%)。

1.5.3 血清、肝臟和腸道抗氧化指標測定

使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定仔豬血清、肝臟和腸道中總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及丙二醛(MDA)含量，嚴格按照說明書操作。

1.5.4 肝臟和腸道抗氧化相關基因表達測定

總RNA的提取：按照RNA提取試劑盒(Trizol Reagent TaKaRa，日本)嚴格操作，得到總RNA后，在核酸蛋白儀上取RNA樣品測出相應的吸光度(OD)260 nm和OD280 nm，樣品檢測數(shù)值處在1.8≤OD260 nm/OD280 nm≤2.0，用1%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的質量和完整性。

反轉錄：利用反轉錄得到cDNA，所有步驟嚴格按照反轉錄試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]說明書進行。反轉錄所用儀器是PCR儀(Bio-Rad DNA Engine，美國)，反應共有2步，分別為：反轉錄反應37 ℃，15 min；反轉錄酶失活反應85 ℃，5 s。

引物設計：肝臟和腸道抗氧化相關基因[核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)和血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)]引物序列見表2。

表2 肝臟和腸道抗氧化相關基因引物序列

實時熒光定量PCR：使用染料為SYBR Green PCR Mix[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，使用儀器是實時熒光定量PCR儀(CFX-96 Real-Time PCR System，Bio-Rad公司，美國)。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因。用2-ΔΔCt法[11]計算目的基因的mRNA相對表達量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

所有試驗數(shù)據(jù)經Excel 2016初步分析后，使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對4組的試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，差異顯著時進行Duncan氏多重比較，所有試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P≤0.10為有趨勢。

2 結果與分析

2.1 菊粉對斷奶仔豬生長性能的影響

由表3可見，與對照組相比，飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉對斷奶仔豬ADFI和ADG無顯著影響(P>0.05)，但飼糧添加2.5 g/kg菊粉后斷奶仔豬ADFI和ADG分別提高了12.2%和20.1%。

表3 菊粉對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 菊粉對斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表4可見，與對照組相比，飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉可顯著提高斷奶仔豬粗灰分表觀消化率(P<0.05)，飼糧添加2.5和5.0 g/kg菊粉可顯著提高斷奶仔豬粗蛋白質表觀消化率(P<0.05)，飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉對斷奶仔豬干物質、粗脂肪和能量表觀消化率無顯著影響(P>0.05)。

表4 菊粉對斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 菊粉對斷奶仔豬血清、肝臟和腸道抗氧化指標的影響

由表5可見，與對照組相比，飼糧添加2.5 g/kg菊粉可顯著提高血清中T-SOD活性(P<0.05)，但飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉對血清中CAT和GSH-Px活性、T-AOC及MDA含量無顯著影響(P>0.05)；飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉可顯著降低肝臟中MDA含量(P<0.05)，但飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉對肝臟中T-AOC及CAT、T-SOD和GSH-Px活性無顯著影響(P>0.05)；飼糧添加2.5和5.0 g/kg菊粉可顯著提高空腸中CAT活性(P<0.05)，飼糧添加2.5和5.0 g/kg菊粉可顯著降低回腸中MDA含量(P<0.05)，飼糧添加2.5 g/kg菊粉可顯著提高十二指腸中CAT活性(P<0.05)，但飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉對十二指腸、空腸和回腸中T-AOC及T-SOD和GSH-Px活性無顯著影響(P>0.05)。

表5 菊粉對斷奶仔豬血清、肝臟和腸道抗氧化指標的影響

2.4 菊粉對斷奶仔豬肝臟抗氧化相關基因表達的影響

由表6可見，與對照組相比，飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉可顯著提高肝臟中Nrf2的mRNA相對表達量(P<0.05)，飼糧添加5.0和10.0 g/kg菊粉可顯著提高肝臟中HO-1的mRNA相對表達量(P<0.05)，飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉對肝臟中Keap1的mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)。

表6 菊粉對斷奶仔豬肝臟抗氧化相關基因表達的影響

2.5 菊粉對斷奶仔豬腸道抗氧化相關基因表達的影響

由表7可見，與對照組相比，飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉可顯著提高十二指腸中HO-1的mRNA相對表達量和空腸中Nrf2的mRNA相對表達量(P<0.05)，飼糧添加2.5和5.0 g/kg菊粉可顯著提高回腸中HO-1和Nrf2的mRNA相對表達量(P<0.05)，飼糧添加2.5 g/kg菊粉可顯著提高空腸中Keap1的mRNA相對表達量(P<0.05)，飼糧添加10.0 g/kg菊粉可顯著提高空腸中HO-1和Keap1的mRNA相對表達量(P<0.05)。

表7 菊粉對斷奶仔豬小腸抗氧化相關基因表達的影響

3 討 論

菊粉是一種從菊苣和菊芋等天然植物中提取的可溶性膳食纖維，是一種潛在的綠色飼料添加劑，可用來提高動物的生長性能腸道健康。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加10.0、15.0和20.0 g/kg菊粉均可顯著斷奶仔豬ADG[12]。周錫紅等[13]將含有5%菊粉的飼糧喂給仔豬，結果發(fā)現(xiàn)，菊粉可顯著提高ADG，并顯著降低料重比。在本試驗中，飼糧添加不同水平菊粉對斷奶仔豬ADFI和ADG無顯著影響。與前人試驗相比，本試驗飼糧中添加菊粉水平較低可能是造成斷奶仔豬ADFI和ADG無顯著變化的原因。本試驗中，飼糧添加菊粉可提高粗蛋白質和粗灰分表觀消化率，與前人研究結果[14-16]一致。

通常情況下機體內自身產生的活性氧(ROS)可以被自身酶類清除，因此對機體并無太大影響。但機體受到刺激后產生的活性氧數(shù)量會遠遠超過機體酶類清除能力，機體會出現(xiàn)應激狀態(tài)[17-19]，最終對機體造成不可逆的傷害[20]。斷奶仔豬早期斷奶破壞了仔豬的機體抗氧化防御系統(tǒng)，導致機體進入應激狀態(tài)[21]。機體產生的超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px、CAT等抗氧化酶能夠有效清除機體內的自由基[22]。機體自身產生的這些抗氧化酶的活性高低直接反映出機體的抗氧化能力，也關系到機體的健康狀況[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬飼糧中添加菊粉可以提高血清SOD活性[24]。尚紅梅[25]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加菊粉可顯著提高血清中SOD活性，顯著降低血清中MDA含量。魏軼男等[26]研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞飼糧中添加菊粉可以顯著提高肉仔雞肝臟和血清中SOD、GSH-Px活性，并顯著降低肉仔雞肝臟和血清中MDA含量。本試驗中，飼糧添加2.5 g/kg菊粉可顯著提高血清中T-SOD活性和十二指腸CAT活性；飼糧添加2.5、5.0和10.0 g/kg菊粉可顯著降低肝臟中MDA含量；飼糧添加2.5和5.0 g/kg菊粉可顯著提高空腸中CAT活性，降低回腸中MDA含量。這表明飼糧添加菊粉可增加斷奶仔豬血清、肝臟和腸道黏膜系統(tǒng)抗氧化酶活性，從而提高斷奶仔豬的抗氧化能力。

Nrf2/Keap1是機體細胞內維持氧化還原平衡的重要信號通路之一，同時Nrf2作為一種應激基本表達的關鍵轉錄因子，存在于機體多個器官，Nrf2的缺失或激活障礙直接導致細胞對應激源的敏感性變化[27-28]。應激可以損壞細胞內氧化還原平衡，進而激活或抑制一些信號通路和許多信號介導分子，例如Nrf2/Keap1信號通路[29]。HO-1作為Nrf2信號通路下游的重要因子[30]，是反映細胞應激狀態(tài)敏感性的關鍵指標[31]。前人的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2的mRNA表達水平上升，可以提高機體抗氧化酶的活性[32]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加菊粉可提高肝臟HO-1和Nrf2、十二指腸HO-1和空腸Nrf2的mRNA相對表達量。這表明飼糧添加菊粉可以通過活化Nrf2通路增強斷奶仔豬抗氧化酶活性，進而提高斷奶仔豬的抗氧化能力。

4 結 論

飼糧添加菊粉對斷奶仔豬生長性能無顯著影響，但可改善養(yǎng)分表觀消化率，提高抗氧化能力。本試驗條件下，斷奶仔豬飼糧中菊粉適宜添加水平為2.5 g/kg。