NOS1AP基因非編碼區(qū)位點多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究

胡國芹，呂欽諭，趙 靜，朱明環(huán)，禹順英，易正輝#，陳 健#

1.上海市黃浦區(qū)精神衛(wèi)生中心精神科，上海200011；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心精神科，上海200030；3.上海市浦東新區(qū)精神衛(wèi)生中心精神科，上海200122

精神分裂癥是一種常見的嚴重慢性精神疾病，患病率約1%［1］。研究者們對精神分裂癥的具體病因和潛在的病理生理機制仍然知之甚少。18 歲之前起病的患者，被定義為早發(fā)性精神分裂癥（early onset schizophrenia，EOS），較晚發(fā)精神分裂癥患者具有更多的遺傳學基礎(chǔ)［2］。精神分裂癥患者發(fā)病年齡越早，其親屬患精神分裂癥的比例越高［3］。

來自不同種族人群的大樣本關(guān)聯(lián)研究［4］表明，位于1 號染色體的一氧化氮合成酶1 接頭蛋白（nitric oxide synthase 1 adaptor protein，NOS1AP）基因是與精神分裂癥顯著相關(guān)的基因之一。諸多研究者在精神分裂癥尸腦組織中發(fā)現(xiàn)不同腦區(qū)NOS1AP 蛋白表達水平發(fā)生變化［5］。3 種NOS1AP 蛋 白 亞 型（NOS1AP-L、 NOS1AP-S、NOS1AP-S'）在精神分裂癥患者尸腦組織的背外側(cè)前額葉區(qū)域表達升高，在小腦區(qū)域表達降低［6］。但是關(guān)于NOS1AP 基因變異如何影響蛋白表達的病理機制研究較少。課題組前期關(guān)于EOS 核心家系的研究［7］發(fā)現(xiàn)，NOS1AP 基因rs12742393 位點與EOS 存在顯著相關(guān)趨勢，且通過病例-對照研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥和正常對照相比，外周血NOS1AP mRNA 和蛋白表達明顯增加。本研究擬在中國漢族人群中進一步擴大樣本研究NOS1AP 基因與精神分裂癥的相關(guān)性，并且通過在線預測軟件進一步探討rs12742393位點變異對RNA和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2012年10月—2015年12月期間上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心收治的精神分裂癥住院或門診患者，以及同一時期在上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心的職工和復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院體檢中心的受檢者中招募的健康志愿者作為研究對象，分為EOS組、非早發(fā)性精神分裂癥（non-early onset schizophrenia，non-EOS）組和正常對照（health control，HC）組。

EOS 組納入標準：①漢族，年齡18～65 歲，性別不限。②符合美國《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》（第4 版）（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，4th edition，DSM-Ⅳ）精神分裂癥的診斷標準。③首次確診精神分裂癥的年齡≤18歲。④受教育背景及文化足以理解研究內(nèi)容和知情同意書。EOS組排除標準：①合并符合DSM-Ⅳ其他診斷的精神疾病。②合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性疾病、糖尿病等重大軀體疾病者。non-EOS 組納入標準：首次確診精神分裂癥的年齡＞18歲，其他納入標準同EOS組。non-EOS組排除標準同EOS組。HC組納入標準：①年齡18～65歲。②性別不限。③漢族。HC組排除標準：①符合DSM-Ⅳ中任何精神疾病。②嚴重腦器質(zhì)性疾病或軀體疾病。③精神活性物質(zhì)使用者。④妊娠期及產(chǎn)后1年女性。3組研究對象之間無血緣關(guān)系。研究得到上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心倫理委員會的批準（批件號2012-26R）。所有研究對象均簽署書面的知情同意書，對于精神分裂癥患者，其監(jiān)護人同時簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 診斷工具 入組時至少由2 名副高級職稱以上的精神科醫(yī)師采用DSM-Ⅳ診斷標準對精神癥狀進行評定。

1.2.2 DNA 提取 采集各組研究對象靜脈血各2 mL，2%乙二胺四乙酸抗凝。采用1 mL 血液基因組DNA 小量提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司）提取DNA，測量DNA濃度。提取好的DNA保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 多態(tài)性位點的選擇 在人類基因組序列第37 版（http：//grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index）下載NOS1AP基因染色體位置信息，將位置信息輸入到千人基因 組 數(shù) 據(jù)（http：//www.internationalgenome.org/vcf-pedconverter#online-version）中進行轉(zhuǎn)換；選擇中國北京漢族（Chinese Han origin in Beijing，CHB）人群，chr11：2763301～27699871， 導 出ped 和info 文 件， 導 入Haploview 4.2 單倍型分析軟件，以相對連鎖不平衡系數(shù)r2＞0.8、次等位基因頻率＞20%為標準選擇標簽多態(tài)性位點。結(jié)合既往文獻研究結(jié)果進一步進行篩選，最終選擇NOS1AP 基 因 非 編 碼 區(qū) 的rs12742393、 rs4145621、rs1415263位點（圖1）。

圖1 NOS1AP基因中多態(tài)性位點Fig 1 Location of polymorphism loci in NOS1AP gene

1.2.4 等位基因和基因型檢測及頻率分析 采用美國Applied Biosystems TaqMan 檢測試劑盒對NOS1AP 基因rs12742393、rs4145621 和rs1415263 位點進行分型。通過SHEsis在線軟件［8］對EOS組、non-EOS組和HC組3個多態(tài)性位點進行哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg，H-W）平衡檢驗以及等位基因和基因型頻率分析。確定等位基因和基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學意義的多態(tài)性位點（陽性位點）。

1.2.5 遺傳模型的分析 利用SNPstats 在線工具進行最優(yōu)遺傳模型的分析，采用似然比檢驗（likelihood ratio test，LRT）評估不同模型間的擬合優(yōu)度。利用SNPstats在線網(wǎng)站將相對復雜的模型（顯性、隱性、超顯性遺傳模型）與一個簡單的模型（共顯性模型）進行比較，根據(jù)P＜0.05 的情況下阿凱克信息準則（Akaike information criteria，AIC）值進行最優(yōu)遺傳模型判斷；AIC 值越小，模型越精確，可視為最優(yōu)遺傳模型。

1.2.6 陽性位點變異引起編碼RNA 和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的預測 采用RNAfold 在線軟件預測陽性位點變異對NOS1AP基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的影響，分別對不同等位基因的RNA 空間結(jié)構(gòu)進行模擬和比對及自由能計算。利用DNAstar軟件預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，主要對α螺旋、β 折疊、β 轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲所占比例進行預測。由于NOS1AP蛋白與免疫功能相關(guān)，為進一步探究NOS1AP基因的功能，利用軟件預測的方法來研究NOS1AP 基因多態(tài)性對T 細胞抗原表位的影響。細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）抗原表位通過CTLpred在線軟件預測，輔助T 細胞（helper T cell，Th）表位利用ProPred在線軟件預測。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析；定性資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。等位基因和基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學意義的進一步采用Bonferroni 法進行校正。納入樣本的統(tǒng)計效能通過Quanto 1.2.4 軟件計算，本研究統(tǒng)計效能＞0.8。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般人口學資料

研究共入組333 例EOS 患者、491 例non-EOS 患者和901 例HC 樣本。各組對象性別和年齡的分布均符合正態(tài)分布，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示3 組對象的性別和年齡均匹配（P＞0.05，表1）。

表1 EOS組、non-EOS組與HC組一般人口學資料的比較Tab 1 Comparison of general demographic data among EOS group，non-EOS group and HC group

2.2 H-W平衡檢驗

使用SHEsis在線軟件對EOS組、non-EOS組和HC組的3 個位點基因型頻率分布進行H-W 平衡檢驗，結(jié)果顯示EOS 組、non-EOS 組和HC 組3 個位點基因型頻率分布均符合H-W 平衡檢驗（P＞0.05），故將3 個位點的基因型和等位基因數(shù)據(jù)納入后續(xù)分析。

2.3 NOS1AP基因型和等位基因頻率分布的比較

使用SHEsis在線軟件對符合H-W平衡的3個多態(tài)性位點的等位基因和基因型頻率進行病例-對照關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示：EOS 組與HC 組rs12742393 位點等位基因及基因型頻率分布差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=8.22，df=1，P=0.004；χ2=8.66，df=2，P=0.013）；EOS 組與non-EOS 組，non-EOS 組與HC 組3 個位點等位基因及基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。詳見表2～4。經(jīng)Bonferroni校正后，EOS 組與HC 組rs12742393 位點等位基因及基因型頻率分布差異仍有統(tǒng)計學意義（χ2=8.22，df=1，P=0.012；χ2=8.66，df=2，P=0.039），說 明NOS1AP 基 因rs12742393位點與EOS的發(fā)病顯著相關(guān)。

表2 EOS組、non-EOS組和HC組rs12742393位點等位基因和基因型的頻率分布Tab 2 Frequency distribution of alleles and genotypes of rs12742393 in EOS group，non-EOS group and HC group

表3 EOS組、non-EOS組和HC組rs4145621位點等位基因和基因型的頻率分布Tab 3 Frequency distribution of alleles and genotypes of rs4145621 in EOS group，non-EOS group and HC group

表4 EOS組、non-EOS組和HC組rs1415263位點等位基因和基因型的頻率分布Tab 4 Frequency distribution of alleles and genotypes of rs1415263 in EOS group，non-EOS group and HC group

2.4 最優(yōu)遺傳模型的預測

分析rs12742393位點在顯性、隱性、超顯性和共顯性4 個不同遺傳模型下所得的P 值和AIC 值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共顯性和顯性遺傳模型AIC 值最小，其值為1 290.10，但是同等情況下顯性遺傳模型P 值為0.004，共顯性遺傳模型P值為0.014，說明顯性遺傳模型為最優(yōu)遺傳模型（表5）。

表5 rs12742393位點最優(yōu)遺傳模型的預測Tab 5 Prediction of rs12742393 locus optimal genetic model

2.5 NOS1AP基因編碼RNA和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預測

利用RNAfold在線軟件對NOS1AP基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOS1AP基因rs12742393位點為C 堿基（RNA 上為G）時，較A 堿基（RNA 上為U）具有更大的自由能，同時在多態(tài)性位點附近的空間結(jié)構(gòu)也發(fā)生一些改變，包括位點在內(nèi)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)由1個小環(huán)變成了1個大環(huán)，下游的2個大環(huán)變成了2個小環(huán)（圖2）。表明野生型與突變型RNA 二級結(jié)構(gòu)明顯不同，突變型所需自由能更大，更不穩(wěn)定。因此rs12742393位點C危險等位基因會影響NOS1AP基因RNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖2 RNAfold在線軟件對NOS1AP基因編碼RNA二級結(jié)構(gòu)的預測示意圖Fig 2 Schematic diagram of the secondary structure of RNA of NOS1AP gene predicted by RNAfold online software

NOS1AP 蛋白、主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ復合物和MHC-Ⅱ復合物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。NOS1AP 蛋白對于MHC 分子結(jié)合配體發(fā)揮重要銜接作用。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測軟件發(fā)現(xiàn)rs12742393位點為A堿基時，其編碼的MHC-Ⅰ復合物和MHC-Ⅱ復合物配體結(jié)合區(qū)域α1 結(jié)合NOS1AP 蛋白第50 位氨基酸為色氨酸；當為C 堿基時，MHC-Ⅰ復合物和MHC-Ⅱ復合物配體結(jié)合區(qū)域α1 結(jié)合NOS1AP 蛋白第50 位氨基酸為丙氨酸（表6）。氨基酸的不同可能會影響MHC 復合物與受體結(jié)合的親和力。二級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象的組成比例：A 堿基時，α螺旋17.02%，β折疊28.72%，β轉(zhuǎn)角88.51%，無規(guī)卷曲45.74%；C 堿基時，α 螺旋15.96%，β 折疊30.85%，β 轉(zhuǎn)角8.51%，無規(guī)卷曲44.68%。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的空間構(gòu)象主要依靠α 螺旋的氫鍵的作用力。當NOS1AP 基因rs12742393 位點為C 堿基時，α 螺旋比例下降，從而導致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降。因此，軟件預測發(fā)現(xiàn)NOS1AP 位點多態(tài)性會影響其RNA 和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及MHC復合物與配體結(jié)合的親和力。

表6 DNAstar在線軟件對NOS1AP基因翻譯的氨基酸序列的預測Tab 6 Translated amino acid sequence of NOS1AP gene predicted by DNAstar online software

3 討論

NOS1AP 基因位于1 號染色體，包含10 個外顯子［9］。既往研究［10］發(fā)現(xiàn)精神分裂癥在神經(jīng)發(fā)育過程中存在各種障礙，包括樹突分支的變化、樹突回縮或缺失、棘的數(shù)量或形態(tài)的變化。而NOS1AP 蛋白對神經(jīng)元發(fā)育過程中樹突的生長和棘的發(fā)育起著重要的作用［11］。因此，NOS1AP基因多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究值得關(guān)注。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EOS 組和HC 組之間NOS1AP 基因rs12742393 位點的等位基因和基因型頻率分布存在差異，表明NOS1AP 基因rs12742393 位點與EOS 存在顯著關(guān)聯(lián)，但是與non-EOS關(guān)聯(lián)性不明顯；而rs4145621和rs1415263位點與EOS 和non-EOS 的發(fā)病均無顯著關(guān)聯(lián)。同時SNPstats在線軟件分析發(fā)現(xiàn)rs12742393位點最優(yōu)遺傳模型為顯性遺傳模型，說明A/A 基因型患者較A/C、C/C 基因型患者EOS 發(fā)病風險降低（OR=0.67，95%CI=0.51～0.87）。本研究與國內(nèi)外諸多研究結(jié)果存在異同。Wratten等［12］的研究納入24 個歐裔加拿大精神分裂癥家系，檢測NOS1AP 基因60 個多態(tài)性位點與精神分裂癥的連鎖不平衡的后驗概率 （posterior probability of linkage disequilibrium，PPLD），結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個多態(tài)性位點PPLD＞40% （rs12742393 為 41.90%， rs4145621 為 44.50%，rs1415263 為49.70%）。Ramirez 等［13］在22 個凱爾特人和1 個德國人中進行NOS1AP 基因與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)rs12742393 位點及另外4 個多態(tài)性位點（rs4557949、rs11584803、rs4145621、rs12084492）的單倍型的連鎖不平衡與精神分裂癥的發(fā)病顯著相關(guān)。Brzustowicz 等［14］在24 個加拿大家族精神分裂癥家系樣本中檢查了1q22 染色體最強連鎖的區(qū)域，以尋找連鎖不平衡的證據(jù)。該研究通過D1S1653 和D1S1677 之間5.4 Mbp 區(qū)域的14 個微衛(wèi)星和15 個多態(tài)性位點與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)精神分裂癥與2 個微衛(wèi)星和6 個多態(tài)性位點之間存在連鎖不平衡（P＜0.05）；與精神分裂癥具有顯著連鎖不平衡的多態(tài)性位點均屬于NOS1AP 基因，使NOS1AP 基因成為1q22 上與精神分裂癥易感性顯著相關(guān)的基因，但未發(fā)現(xiàn)任何精神分裂癥相關(guān)變異存在于NOS1AP 基因外顯子，均存在于非編碼區(qū)。Puri 等［15］選擇英國450 例精神分裂癥和450 例對照樣本檢測NOS1AP基因與精神分裂癥的相關(guān)性，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)與精神分裂癥相關(guān)的等位基因或單倍型的證據(jù)。分析Puri等［15］的研究與國內(nèi)外其他研究的不同，原因可能為：①不同種族的人群等位基因的頻率存在差異。rs12742393 A等位基因的頻率在高加索地區(qū)的人群中約為40%，在亞洲人群中約為70%，而在非洲人群中約為80%［16］。rs1415263、rs4145621位點在不同種族的人群中頻率也存在顯著差異。②精神分裂癥可能是多基因遺傳性疾病，單個基因的作用比較微弱，多個基因的微效作用共同作用導致疾病的發(fā)生［17］。

通過二級結(jié)構(gòu)預測軟件發(fā)現(xiàn)，rs12742393位點的多態(tài)性可能影響NOS1AP 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)軟件預測發(fā)現(xiàn)rs12742393 位點堿基變異會改變氨基酸序列，可能導致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性或MHC 復合物配體與受體結(jié)合的親和力受到影響。經(jīng)預測，NOS1AP基因上的rs12742393位點多態(tài)性可能會影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的空間穩(wěn)定性，進而影響基因的表達。本研究與國外某項研究有共同之處。Wratten等［12］用包含每個NOS1AP 多態(tài)性位點的等位基因變異體、NOS1AP 啟動子的熒光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染2 種人類神經(jīng)細胞系（SK-N-MC 和PFSK-1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2 種細胞中攜帶rs12742393 A 等位基因的質(zhì)粒表達水平顯著高于攜帶C 等位基因的質(zhì)粒表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義。該多態(tài)性位點等位基因的變異改變了核蛋白結(jié)合區(qū)域的DNA，從而改變了轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合區(qū)域的親和力，進而影響蛋白的表達水平。細胞學實驗也證明，轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合區(qū)域的親和力改變會影響基因的表達水平。

綜上所述，本研究支持NOS1AP 基因作為漢族人群EOS 的易感基因，且rs12742393 位點多態(tài)性可能會影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。然而研究仍存在一些局限性：①未包括NOS1AP 基因所有標簽多態(tài)性位點，在今后的研究中可適當增加位點，在漢族人群中更加全面地評估NOS1AP 基因與精神分裂癥的相關(guān)性。②僅采用二級結(jié)構(gòu)預測軟件來分析rs12742393 位點變異對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的影響，未來需繼續(xù)深入開展細胞學或動物學研究以驗證預測結(jié)果，并進一步探索NOS1AP基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在精神分裂癥發(fā)生過程中的病理生理機制。