突觸結合蛋白2基因多態(tài)性與中國漢族精神分裂癥的關聯研究

陽 紅，黃欣欣，劉 超，梁青松，楊 華，張建標，徐 健，王穎怡，吳海蘇，呂欽諭#，易正輝

1.湖南省懷化市第四人民醫(yī)院臨床心理科，懷化418000；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心臨床六科，上海201108；3.江蘇省南通市第四人民醫(yī)院精神二科，南通226000

精神分裂癥是一組常見的病因未明的重性精神疾病，病程多遷延，全球患病率約為1%［1］，約有一半的患者最終發(fā)展為精神殘疾，給社會、家庭以及患者本人帶來了沉重的負擔。精神分裂癥的臨床癥狀錯綜復雜，患者一般無智能與意識障礙，主要以陽性癥狀、陰性癥狀、認知功能損害三大核心癥狀以及情感癥狀等其他癥狀為主要表現。目前的研究［2］認為，精神分裂癥是一種神經發(fā)育障礙的大腦疾病，大腦內的神經發(fā)育障礙導致了腦內的微小病理變化；同時，遺傳因素、生物因素和環(huán)境因素的相互作用在精神分裂癥的發(fā)病過程中起到了重要的作用。

近年來，關于精神分裂癥的神經突觸假說越來越受到廣大學者的關注。神經遞質在調節(jié)和保持正常的精神活動方面起著十分重要的作用，精神分裂癥的發(fā)生可能與神經遞質的釋放改變有關［3］?？扇苄訬-乙基馬來酰胺敏感因子附著蛋白受體（soluble NSF accessory protein receptor，SNARE）蛋白復合體及其相互作用蛋白對于囊泡的募集、對接、膜融合起著關鍵的作用，這種囊泡運輸機制的異?？赡芡ㄟ^觸發(fā)異常的神經胞吐而參與精神分裂癥的發(fā)生［4-5］。突觸結合蛋白（synaptotagmin，SYT） 作為與SNARE蛋白復合體相互作用的蛋白之一，與SNARE蛋白復合體形成的復合物為膜融合的基本分子構件［6］。SYT是囊泡膜融合的Ca2+感受器蛋白，與SNARE 復合體相互作用，對于囊泡膜和質膜的融合起到了重要的調節(jié)作用，并間接影響神經遞質的釋放，主要對認知和學習記憶產生影響［7-8］。目前發(fā)現的SYT 亞型一共有17種［9］，可分為6大類；其中SYT1 和SYT2 是突觸囊泡膜蛋白的主要組成部分，兩者具有類似的作用，主要調節(jié)囊泡的快速胞吐過程［10］。目前已有研究［11］證實SNARE 復合體與多種精神疾病有關，如精神分裂癥、雙相情感障礙、注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD），孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）等。作為與SNARE復合體存在相互作用關系的SYT，有研究［12］發(fā)現癡呆患者的認知功能損害與SYT2的顯著缺失有關；且有報道［13］顯示，SYT2 基因突變與兒童ADHD 的發(fā)生有關，而與成人ADHD無關，考慮可能出現這一矛盾結果的原因與不同年齡階段神經發(fā)育程度的不同有關。SYT2基因主要影響神經遞質的釋放，對于腦部尾核和前腦區(qū)域的突觸傳遞尤為重要；該基因突變會導致突觸傳遞的異常，進而可能會導致突觸結構和功能發(fā)生改變［14］。這種腦區(qū)功能的改變可能對精神分裂癥患者的認知功能產生影響，因此SYT2 基因可作為精神分裂癥的候選基因。目前，尚未有SYT2基因多態(tài)性與精神分裂癥的相關報道?；诖?，為進一步明確SYT2 基因多態(tài)性與精神分裂癥的關系，本研究選 取SYT2 基 因 的rs6427957、 rs907697、 rs12564274、rs10800856 和rs61820945 共5 個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點進行檢測，通過病例對照的關聯分析探討SYT2 基因多態(tài)性與中國漢族人群精神分裂癥發(fā)生的關聯性。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

1.1.1 病例組 本研究共納入精神分裂癥患者478 例（SZ 組），來源于2015 年9 月—2018 年9 月在湖南省懷化市第四人民醫(yī)院及上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心的住院或門診患者。入組標準：①符合《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊（第5 版）》［Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders （Fifth Edition），DSM-5］關于精神分裂癥的診斷標準。②年齡＜75歲。③漢族。排除標準：①具有明顯的自殺、自殘及危害他人風險。②有嚴重的軀體疾病。③存在物質及藥物濫用。

1.1.2 對照組 通過廣告招募474 位社區(qū)志愿者為正常對照者（HC 組）。入組標準：①年齡＜75 歲。②漢族。③健康者與患者無血緣關系。排除標準：①有精神疾病及精神疾病家族史。②有嚴重的軀體疾病。③處于妊娠期或哺乳期。

研究得到了上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心倫理委員會的批準（批件號：2017-19R）。所有研究對象及其監(jiān)護人在入組前均簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般人口學資料的收集 收集研究對象的一般人口學資料，主要包括年齡、性別、民族等。

1.2.2 SNP 位點的選擇 SYT2 基因數據從千人基因組數據庫（http：//grch37.ensembl.org/index.html）中查詢并下載，使用HaploView 軟件以及SNP 在線網站（http：//gvs.gs.washington.edu/GVS150/）篩選標簽SNP（tag SNP），針 對SYT2 基 因（NC_000001.11， chr1： 202590596～202710454）及基因上游2 000 bp，以連鎖不平衡系數（r2）＞0.8、微小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05的原則進行挑選。

1.2.3 DNA 提取 抽取SZ 組及HC 組人群外周靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用血液基因組DNA 提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）提取全血DNA，并于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2.4 基因型檢測 應用TaqMan 探針基因分型技術對rs6427957、rs907697、rs12564274、rs10800856、rs61820945位點的SNP 進行檢測。TaqMan SNP Genotyping Assays 試劑盒和TaqMan SNP Genotyping Mix 試劑盒采購自美國ABI 公 司。PCR 擴 增用7900 HT 熒 光實 時 定量PCR 儀（ABI 公司，美國）。PCR 擴增反應體系為5 μL，包括2×Taqman Master Mix 試劑2.0 μL、40×Taqman Genotyping Assay 試 劑0.05 μL、DNA （15～20 ng/μL） 2 μL、H2O 0.95 μL。PCR 反應條件：95 ℃10 min 預變性；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共進行50個循環(huán)，每例樣本均重復檢測3次。采用Sequence Detector Software version 2.1（SDS version 2.1）軟件中Allelic Discrimination 程序進行基因分型，通過檢測不同等位基因FAM（6-carboxy-fluorescein）和VIC（4,7,2'-trichloro-7'-phenyl-6-carboxyfluorescein）熒光強度來判斷樣本的基因型，并將結果保存。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 23.0 軟件對SZ 組和HC 組的一般人口學統(tǒng)計資料進行比較。定量資料用x±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行分析；定性資料用n（%）表示，采用χ2檢驗進行分析。應用SHEsis在線軟件（http：//analysis.bio-x.cn/SHEsis Main.htm）進行哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg，H-W）平衡檢驗、單個位點的關聯分析（等位基因、基因型頻率的比較）及位點之間的單倍型分析。采用SNPstats在線軟件（https：//www.snpstats.net/snpstats/start.htm）對不同位點的遺傳模式進行分析。使用Haploview 統(tǒng)計軟件進行兩兩位點之間的連鎖不平衡分析（linkage disequilibrium，LD），用D'值來度量各個位點間的連鎖不平衡程度。關聯分析結果采用Bonferroni進行校正檢驗，即每個SNP 的P 值乘以所分析的遺傳標記數目，若校正后的P值仍小于0.05認為位點與疾病之間的關聯為有顯著性。樣本的統(tǒng)計效能應用Quanto 1.2.4 軟件進行計算。所用統(tǒng)計學檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般人口學資料

SZ 組共計478 例，其中男性251 例（52.5%）、女性227 例（47.5%）；年齡13～74 歲，平 均年 齡（41.73±20.06）歲。HC組共計474例，其中男性249例（52.5%）、女性225 例（47.5%）；年齡17～64 歲，平均年齡（36.17±13.08）歲。通過比較該2 組的一般人口學資料發(fā)現，平均年齡（t=5.062，P=0.000）間差異具有統(tǒng)計學意義，而性別（χ2=0.000，P=0.995）間差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 SNP位點的選擇結果

共挑選出5個標簽SNP，即rs6427957［chr1：202593299（GRCh38.p12）］、rs907697［chr1：202599607（GRCh38.p12）］、rs12564274［chr1：202710717（GRCh38.p12）］、rs10800856［chr1：202710926（GRCh38.p12）］、rs61820945［chr1：202712006（GRCh38.p12）］。其中，rs12564274和rs10800856 位于啟動子區(qū)域，rs907697 位于內含子區(qū)域，rs6427957位于3'端非翻譯區(qū)，rs61820945位于轉錄因子結合區(qū)域。

2.3 H-W平衡檢驗

5 個 位 點 （rs6427957、 rs907697、 rs12564274、rs10800856、rs61820945）在HC 組中均符合H-W 平衡，可以被納入后續(xù)的分析。

2.4 樣本量計算

應用Quanto 1.2.4 軟件進行計算，將計算條件設置為：MAF=0.2，OR=1.5，加性模式，疾病一般人群患病率為1%，統(tǒng)計效能為80%。結果顯示共需SZ 組269 例、HC組269名。

2.5 統(tǒng)計效能檢驗

5 個SNP 中rs61820945 的MAF 最小，為0.214。應用Quanto 1.2.4 軟件對統(tǒng)計效能進行計算，設置條件為：MAF=0.214，OR=1.5，加性模式，疾病一般人群患病率為1%，SZ組478例、HC組474名，計算結果顯示統(tǒng)計效能為0.97。

2.6 SYT2基因5個位點等位基因和基因型分布的比較

比較結果見表1。SZ 組與HC 組rs10800856 等位基因及基因型分布差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.003，P=0.012），經Bonferroni 校正檢驗后，rs10800856 等位基因頻率分布差異仍有統(tǒng)計學意義（P=0.015）；提示SZ 組等位基因A頻率明顯低于HC 組，等位基因T 頻率明顯高于HC 組，基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學意義。

2.7 不同遺傳模式下的基因型分布比較

SZ 組和HC 組比較，rs10800856 位點在共顯性及隱性遺傳模式下基因型分布組間差異無統(tǒng)計學意義；在顯性及加性遺傳模式下，基因型分布組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004，P=0.005），經Bonferroni 校正后差異仍具有統(tǒng)計學意義（P=0.020，P=0.026）；提示在顯性遺傳模式下A/A 基因型在SZ 組及HC 組之間比較差異有統(tǒng)計學意義，HC 組A/A 基因型顯著多于SZ組（表2）。

表1 SZ組與HC組等位基因頻率和基因型頻率的比較Tab 1 Comparison of allele frequencies and genotype frequencies between the SZ group and HC group

表2 SZ組與HC組不同遺傳模式下基因型的比較Tab 2 Comparison of genotype distribution in different models between the SZ group and HC group

Continued Tab

2.8 連鎖不平衡分析及單倍型遺傳關聯分析

2.8.1 連鎖不平衡分析 不同基因座位的各等位基因在人群中以一定的頻率出現。在某一群體中，不同座位某2個等位基因出現在同一條染色體上的頻率高于預期的隨機頻率的現象，稱為連鎖不平衡。應用HaploView 4.2 軟件對SYT2 基因5 個SNP 位點進行連鎖不平衡分析，單倍型頻率＜3.0%將不被納入后續(xù)分析。以D'值來衡量各位點之間的連鎖不平衡程度，D'值＞0.8 可以構成一個單倍型區(qū)塊。分析結果顯示：SYT2 基因的rs6427957、rs907697這 2 個 SNP 位 點 以 及 rs12564274、 rs10800856、rs61820945 這3 個SNP 位點分別可以構成一個單倍型區(qū)塊（圖1）。

圖1 5個SNP的連鎖不平衡分析結果Fig 1 Results of linkage disequilibrium analysis of 5 SNPs

2.8.2 SZ 組與HC 組單倍型分析 應用SHEsis 在線軟件對SZ 組及HC 組間單倍型進行分析，發(fā)現由rs6427957 和rs907697 位點構成的單倍型A-C、A-T、G-T 頻率＞3%，繼續(xù)分析發(fā)現3 個單倍型在2 組間分布差異無統(tǒng)計學意義（表3）。由rs12564274-rs10800856-rs61820945 位點組成的單倍型C-A-A、C-T-C、G-A-C、G-A-G 頻率＞3%，后續(xù)分析發(fā)現單倍型C-T-C頻率分布在SZ組與HC組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009），經Bonferroni校正后，差異仍具有統(tǒng)計學意義（P=0.036，表4）。

表3 SZ組與HC組單倍型分布的比較（rs6427957和rs907697）Tab 3 Comparison of haplotype distribution between the SZ group and HC group（rs6427957 and rs907697）

表4 SZ組與HC組單倍型分布的比較（rs12564274、rs10800856和rs61820945）Tab 4 Comparison of haplotype distribution between the SZ group and HC group（rs12564274，rs10800856 and rs61820945）

3 討論

神經發(fā)育假說是當前精神分裂癥病因學解釋的主要觀點。該假說認為在胚胎期大腦內神經元及神經通路發(fā)育和成熟過程中出現紊亂，同時在外界的異常環(huán)境誘導下出現精神分裂癥癥狀［15］。鈣信號轉導在調節(jié)神經元的多種生物學過程中起著核心作用，許多神經精神疾病的發(fā)生都與鈣通道活性異常有關；越來越多的證據［16-17］表明，精神分裂癥的發(fā)生與鈣離子信號轉導通路的失調有關。SYT2 主要調節(jié)Ca2+的釋放，觸發(fā)和調節(jié)囊泡與靶膜的融合過程，調節(jié)神經遞質和激素的快速吞吐，在神經遞質傳遞過程中扮演著重要的角色，因此SYT2 基因可作為精神分裂癥遺傳學研究的候選基因之一。

本研究在中國漢族人群中對SYT2 基因的5 個SNP 位點 rs10800856、 rs12564274、 rs61820945、 rs6427957、rs907697進行基因型、等位基因及單倍型頻率的比較，研究結果發(fā)現rs10800856 等位基因及基因型頻率分布在中國漢族人群精神分裂癥患者和健康人群之間差異有統(tǒng)計學意義，經Bonferroni 校正后，rs10800856 位點基因型頻率分布在組間的差異無統(tǒng)計學意義，等位基因頻率間差異仍有統(tǒng)計學意義。rs10800856位點在顯性及加性遺傳模式下，基因型分布在SZ 組與HC 組之間比較差異有統(tǒng)計學意義，Bonferroni 校正后差異仍有統(tǒng)計學意義。由rs12564274-rs10800856-rs61820945 組成的單倍型C-T-C 頻率分布在SZ 組與HC 組間差異有統(tǒng)計學意義，經Bonferroni 校正后，差異仍具有統(tǒng)計學意義。雖然rs10800856 位點基因型頻率經Bonferroni 校正后無統(tǒng)計學意義，但Bonferroni校正可能會因過度保守而增加假陰性率，且rs10800856 等位基因頻率經Bonferroni校正后在組間分布仍具有統(tǒng)計學意義，并且該位點在顯性及加性遺傳模式下，組間比較亦有統(tǒng)計學意義，表明rs10800856位點等位基因T 可能是精神分裂癥的風險等位基因。因此，本研究認為rs10800856 位點基因的多態(tài)性可能與中國漢族人群精神分裂癥的發(fā)生有一定關聯。同時，本研究還發(fā)現由rs12564274-rs10800856-rs61820945 位點組成的單倍型C-T-C 在SZ 組和HC 組之間差異有統(tǒng)計學意義，其OR=1.359，表明C-T-C 單倍型可能會增加精神分裂癥的患病風險；但本研究并沒有發(fā)現除rs10800856 以外其他位點（rs12564274、rs61820945）與精神分裂癥之間存在關聯，考慮這可能是由于單倍型加強了各位點之間的聯系所致。另外，本研究雖然在平均年齡間差異具有統(tǒng)計學意義，但由于基因具有相對穩(wěn)定性的特點，因此認為年齡差異對結果的影響較小。綜上所述，我們認為SYT2基因的多態(tài)性可能與精神分裂癥的發(fā)病風險有關聯，rs10800856可能是精神分裂癥發(fā)病的風險位點。但有關該位點突變后是通過哪種方式對精神分裂癥發(fā)病風險產生影響，目前還不明確，還需要進行進一步的研究。rs10800856 位點位于SYT2 基因上游啟動子區(qū)域，該位點的突變可能會導致啟動子結構的改變，進而影響它與RNA 聚合酶的親和力，從而影響基因水平的表達。Wu等［18］在精神分裂癥相關的轉錄多樣性的研究中發(fā)現了12個與編碼SNARE 復合物相關蛋白有關的基因，這些基因均來自突觸小泡運輸簇，因此他們認為SNARE 復合物可能在精神分裂癥的突觸前功能障礙中具有重要作用。在這12 個基因中，SYT2 基因便是其中一個，并且該研究還在與SYT2基因功能相似的SYT1基因中進一步檢測到了替代啟動子的使用。基于此，我們猜測，rs10800856位點的突變可能會對突觸前功能產生一定影響，進而影響神經遞質的釋放，使精神分裂癥的發(fā)病風險增加。

本研究選取的SYT2 的5 個SNP 位點在精神分裂癥中均未見報道，同時還發(fā)現SYT2 基因rs10800856 位點多態(tài)性與rs12564274-rs10800856-rs61820945 位點組成的單倍型C-T-C 可能與精神分裂癥的發(fā)生有關，證實了SYT2 基因可能為精神分裂癥的易感基因，具有一定的創(chuàng)新性。但本研究仍存在一定的局限性。首先，精神分裂癥的發(fā)生并不是單個基因決定的，而是由多個基因及其他因素共同作用的結果，因此，其他基因與SYT2 相互作用對于精神分裂癥的發(fā)生仍是未來研究的一個重點；其次，本研究的樣本量較小，在今后的研究中應進一步擴大樣本量再次進行重復驗證，同時本研究僅選取了SYT2 基因的5 個SNP 位點進行關聯分析，雖然這5 個位點是經過篩選得到的，但反映的信息仍較少，不足以反映SYT2 基因的全部信息；再次，關于樣本的一致性，不同的臨床表型可能會對研究結果產生一定的影響，本研究在選取樣本時缺少同質性，可能會對結果產生一定的影響，因此，在今后的實驗中需盡可能地選取臨床表型一致的個體進行研究，使研究更加嚴謹可信；最后，本研究僅為探討SYT2 基因多態(tài)性與精神分裂癥相關性的初步研究，對于該基因多態(tài)性導致的精神分裂癥相關蛋白的變化及其所引起的病理生理的改變，仍需要進行進一步的探討。在未來的研究中，我們仍需要設計更加嚴謹的實驗方案，通過大樣本量進行重復研究，對SYT2 基因的多態(tài)性與精神分裂癥的關聯性做進一步驗證。