可見光對RPE細(xì)胞自噬及凋亡的影響＊

高園園 李武軍 李娟 黃潔 俞洋②

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是引起世界上老年人視力不可逆性下降和失明的首要原因[1]。AMD是以視網(wǎng)膜色素上皮層的萎縮和光感受器細(xì)胞的壞死為顯著特征，可伴有脈絡(luò)膜新生血管的形成。AMD發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要環(huán)節(jié)是：RPE細(xì)胞極易受到氧化應(yīng)激的損傷，其功能障礙可導(dǎo)致光感受器變性AMD的主要臨床特征是視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）和Bruch膜之間存在玻璃疣，隨著疾病的進(jìn)展RPE發(fā)生變性[2]。由于RPE的主要功能之一是維持感光器的健康，因此RPE變性繼而導(dǎo)致感光器功能障礙引發(fā)AMD相關(guān)的視力障礙[3]。RPE是位于Bruch膜和光感受細(xì)胞器之間的單層色素細(xì)胞，起源于視杯的外層，具有抗氧化、參與視循環(huán)代謝、分泌生長因子、具有特殊的吞噬功能及濾過作用，RPE的頂端微絨毛與光感受器外段共同構(gòu)成光傳導(dǎo)的場所，是血視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分，RPE功能障礙是導(dǎo)致永久性失明的許多遺傳性和后天性疾病的基礎(chǔ)。

自噬是一種只表現(xiàn)在真核細(xì)胞生物的、進(jìn)化上高度保守的、在溶酶體和自噬囊泡的參與下降解胞質(zhì)內(nèi)蛋白或受損細(xì)胞器、回收可利用某些氧基酸和蛋白質(zhì)的過程，對維持RPE內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定特別重要。細(xì)胞凋亡在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用，它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。自噬與細(xì)胞凋亡之間關(guān)系極其復(fù)雜，二者在多細(xì)胞生物的發(fā)育和體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用。自噬和凋亡可以在同一細(xì)胞中同時發(fā)生，并可能相互影響。自噬促進(jìn)凋亡或自噬抑制凋亡，取決于細(xì)胞類型，細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞外營養(yǎng)物質(zhì)的利用和觸發(fā)刺激等[4-6]。目前少有光誘導(dǎo)對RPE細(xì)胞自噬的影響及RPE細(xì)胞在光誘導(dǎo)下自噬與凋亡之間關(guān)系的報道，故本研究重點(diǎn)探討光誘導(dǎo)下的RPE自噬通量的改變及ARPE-19細(xì)胞在光損傷中自噬與凋亡之間的關(guān)系是如何變化的。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及抗體

胎牛血清（以色列Bioind公司）；DMEM/F12（以色列Bioind公司）；青霉素-鏈霉素混合液、含或不含EDTA胰蛋白酶（北京Solarbio生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（美國HyClone公司）；CCK8檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；三甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3MA，美國Apexbio，貨號A8353）；Rapamycin（美國Apexbio，貨號A8167）；LC3A-Specific Antibody（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號18722-1-AP）；LC3B-Specific Antibody（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號18725-1-AP）；P62/SQSTM1 Antibody（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號18420-1-AP）；Rabbit Anti-Beclin 1 antibody（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號bs-1353R）。

1.2 主要儀器

Multiskan酶標(biāo)儀（Thermo公司）；FACSAriaⅡ型流式細(xì)胞檢測儀（美國BD公司）；TES-1332A數(shù)位式照度計（臺北泰仕電子工業(yè)）；H-7650B透射電鏡（日立高新技術(shù)公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（ARPE-19）購于BNCC。ARPE-19放置在37 ℃5%的CO2培養(yǎng)箱中，用已配置新鮮的含10%的胎牛血清及1%雙抗的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，隔1～2 d換液1次，待細(xì)胞成長密度達(dá)到80%～90%時，預(yù)熱的PBS洗滌2次，含或不含EDTA的胰酶消化，顯微鏡下觀察到細(xì)胞變?yōu)榱恋男A點(diǎn)時且開始漂浮時迅速用完全培養(yǎng)基終止消化，用3 ml巴氏無菌吸管輕輕吹打至細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心棄上清后，加入新鮮培養(yǎng)基吹打為細(xì)胞懸液，1∶3進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期3～6代細(xì)胞用以試驗。將制備好的人RPE單細(xì)胞懸液，按1×104個/孔細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μl，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行試驗，所有細(xì)胞于分組前經(jīng)低血清培養(yǎng)基同步化處理。試驗分為四組：體外培養(yǎng)的人ARPE-19細(xì)胞組（對照組）、體外培養(yǎng)的人ARPE-19細(xì)胞+光照射（模型組），體外培養(yǎng)的人ARPE-19細(xì)胞+光照前+自噬抑制劑3-MA組（3MA組），體外培養(yǎng)的人ARPE-19細(xì)胞+光照前+自噬激動劑Rapamycin組（Rapamycin組）。于光照后設(shè)立的3個時間點(diǎn)（依據(jù)光照開始至損傷模型形成所歷經(jīng)時段進(jìn)行劃分）給予指標(biāo)檢測。

1.4 構(gòu)建人RPE細(xì)胞光損傷模型

將3～6代人ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，光照在培養(yǎng)箱內(nèi)密閉進(jìn)行，無自然光干擾。以自制三基色LED冷光燈作為光源，懸掛于培養(yǎng)箱內(nèi)頂端，采取直落式照射[7-8]。根據(jù)前期試驗結(jié)果，TES-1332A數(shù)位式照度計監(jiān)測光照強(qiáng)度，使被照細(xì)胞同一水平光照強(qiáng)度為（16 500±500）Lux，用上述光照器照射細(xì)胞12、18、24 h。光照時，細(xì)胞平面的溫度變化控制在36.5 ℃～37.5 ℃之間，排除溫度升高引起細(xì)胞光熱損傷的可能。

1.5 CCK8法檢測細(xì)胞存活率

選取試驗所需對數(shù)生長期細(xì)胞，充分消化，接種于96孔板，測算細(xì)胞密度約5×103個/孔。換無血清DMEM/F12，培養(yǎng)箱中孵育過夜，使細(xì)胞同步化。各組于光照結(jié)束后終止培養(yǎng)，每孔加入CCK8溶液10 μl，37 ℃孵育2.5 h。96孔板，每組6個復(fù)孔，同時設(shè)立空白對照，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的OD值。試驗重復(fù)3次。計算數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞存活率圖，細(xì)胞存活率=（加藥細(xì)胞OD-空白OD/對照細(xì)胞OD-空白OD）×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率

取生長狀態(tài)良好，且處于對數(shù)生長期人RPE細(xì)胞用于試驗。各組細(xì)胞于光照處理結(jié)束后，收集舊培養(yǎng)液，溫PBS洗滌2遍，用0.25%不含EDTA胰酶消化細(xì)胞，并將細(xì)胞輕輕吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液，移入相應(yīng)離心管中，1 200 r/min，低速離心5 min，棄上清；預(yù)冷PBS 2 ml洗滌1次，輕輕混勻成單細(xì)胞懸液，1 200 r/min，5 min離心后，棄上清，此步驟重復(fù)2次；將細(xì)胞懸浮于400 μl Annexin-V結(jié)合液中，避光加入5 μl FITC，4 ℃放置15 min；上機(jī)前5 min避光加10μl PI，在1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 透射電鏡觀察自噬小體形成

吸除孔板中的培養(yǎng)液，PBS沖洗1～2遍，收集細(xì)胞。4 ℃下離心5 min；37 ℃下，2.5%戊二醛混合同等體積的固定劑制成細(xì)胞懸液。室溫下保持5 min，冰浴30 min；用冰蒸餾水洗滌3次，每次3 min，將細(xì)胞用2%雙氧鈾醋酸染色，4 ℃條件下過夜；梯度乙醇脫水后嵌在Durcupan樹脂內(nèi)。超?。?0 nm）切片，醋酸鈾和鉛鹽染色后用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察照相。

1.8 Western blot法檢測LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、P62、Beclin1蛋白表達(dá)水平

用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，利用BCA蛋白定量測定試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。通過計算機(jī)調(diào)整后變性，50 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用PVDF轉(zhuǎn)膜，加入一抗，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃封閉過夜，TBST洗滌10 min/次，洗滌3次，加入二抗，37 ℃搖床孵育2 h。暗室中加發(fā)光液并進(jìn)行曝光。X線片顯影和定影后利用Image J2x軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，對蛋白條帶進(jìn)行相對定量分析，定量分析不同蛋白條帶灰度做柱狀圖。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0或Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行分析和處理，計量資料以（±s）表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊性資料比較采用單因素方差分析（one-factor ANOVA），多個樣本均數(shù)間的多重比較采用SNK-q法檢驗；不符合正態(tài)分布且方差不齊的資料采用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗，顯著性水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察光誘導(dǎo)下ARPE-19細(xì)胞凋亡與自噬形態(tài)學(xué)表征

對照組，正常細(xì)胞形態(tài)：細(xì)胞器形態(tài)清晰，線粒體嵴（黑色箭頭）清晰可見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（粗白色箭頭）尚未擴(kuò)張，高爾基體（細(xì)白色箭頭）可見，見圖1。3MA組，細(xì)胞凋亡形態(tài)：細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞、凝聚、邊緣出現(xiàn)許多空泡結(jié)構(gòu)（灰色箭頭），該細(xì)胞處于細(xì)胞凋亡的Ⅰ-Ⅱa期，若是細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體，見圖2。模型組細(xì)胞形態(tài)：透射電鏡下可觀察到雙膜狀吞噬小體（細(xì)黑色箭頭）大量存在且線粒體嵴斷裂（粗黑色箭頭），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、斷裂，可見部分溶酶體（白色箭頭），細(xì)胞中自噬泡的數(shù)量增加，可觀察到大量空泡，見圖3。Rapamycin組，典型的雙膜狀自噬小體（黑色箭頭），見圖4。

圖1 對照組正常細(xì)胞形態(tài)（×10 000）

圖2 3MA組細(xì)胞凋亡形態(tài)（×3 000）

圖3 模型組細(xì)胞形態(tài)（×5 000）

圖4 Rapamycin組細(xì)胞形態(tài)（×30 000）

2.2 光誘導(dǎo)對各組ARPE-19細(xì)胞存活率的影響

對照組細(xì)胞存活率接近100%，模型組隨著光照時間延長，細(xì)胞存活率呈下降趨勢（P＜0.01）；3MA組在12、18、24 h細(xì)胞存活率呈下降趨勢且低于模型組（P＜0.01）；Rapaymcin組在12、18、24 h細(xì)胞存活率高于模型組（P＜0.05），見圖5、表1。

圖5 ARPE-19細(xì)胞接受12、18、24 h光照，不同組別細(xì)胞存活率

表1 光誘導(dǎo)各組A-RPR細(xì)胞存活率比較 [%，（±s）]

表1 光誘導(dǎo)各組A-RPR細(xì)胞存活率比較 [%，（±s）]

*與對照組比較，P＜0.01；#與模型組比較，P＜0.05。

組別 光照12 h 光照18 h 光照24 h對照組（n=6） 99.99±5.06 99.99±10.05 100.03±1.92模型組（n=6） 63.15±5.99* 56.34±2.78* 48.29±2.89*3MA 組（n=6） 62.75±5.27# 46.27±4.72# 33.64±3.53#Rapamycin組（n=6） 68.66±4.63# 63.82±2.51# 51.99±0.85#F值 68.374 350.30 787.99 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 光誘導(dǎo)對各組ARPE-19細(xì)胞凋亡率的影響

相同條件下重復(fù)3次實驗，對照組與模型組比較，在光照12～18 h A-RPE細(xì)胞凋亡率呈緩慢上升趨勢（P＜0.05），在18～24 h A-RPE細(xì)胞凋亡率隨著光照時間延長而明顯升高（P＜0.01）。3MA組在12、18、24 h細(xì)胞凋亡率均高于模型組（P＜0.01）。Rapaymcin組在12、18、24 h細(xì)胞凋亡率低于模型組（P＜0.05），見圖 6、圖 7、表 2。

圖6 各組18 h細(xì)胞凋亡率

圖7 各組細(xì)胞12、18、24 h凋亡率比較

表2 各組細(xì)胞光照12、18、24 h凋亡率比較 [%，（±s）]

表2 各組細(xì)胞光照12、18、24 h凋亡率比較 [%，（±s）]

*與對照組比較，P＜0.01，#與模型組比較，P＜0.05。

組別 光照12 h 光照18 h 光照24 h對照組（n=3） 3.67±0.12 4.87±0.31 5.57±0.12模型組（n=3） 12.47±0.57* 15.23±0.86* 39.40±1.64*3MA 組（n=3） 17.77±1.34# 22.47±3.68# 56.47±3.33#Rapamycin組（n=3） 10.50±0.26# 11.53±0.40# 35.13±1.17#F值 184.48 44.38 354.27 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 光損傷誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞自噬通量的改變

相同條件下重復(fù)3次實驗，3MA組P62蛋白表達(dá)量在12～24 h高于對照組（P＜0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及 Beclin1蛋白表達(dá)量在12～24 h低于對照組（P＜0.05）；Rapaymcin組P62蛋白表達(dá)量在12～24 h呈下降趨勢（P＜0.01），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)量在12～24 h呈上升趨勢（P＜0.01）；Rapaymcin組P62蛋白表達(dá)量在 12～24 h低于模型組（P＜0.01），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)量在12～24 h均高于模型組（P＜0.01）。對照組與模型組比較，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1在12～18 h呈上升趨勢，18～24 h呈下降趨勢（P＜0.01）；P62在12～18 h呈下降趨勢，在18～24 h呈上升趨勢（P＜0.01），見圖 8、圖 9、表 3、圖 10。

圖8 對照組與模型組自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖9 Rapaymcin和3MA對光誘導(dǎo)下ARPE-19自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

圖10 光損傷誘導(dǎo)各組ARPE-19細(xì)胞自噬通量的表達(dá)

表3 光損傷誘導(dǎo)各組ARPE-19細(xì)胞自噬通量表達(dá)的比較 [%，（±s）]

表3 光損傷誘導(dǎo)各組ARPE-19細(xì)胞自噬通量表達(dá)的比較 [%，（±s）]

組別 P62-12 h P62-18 h P62-24 h LC3Ⅱ/LC3Ⅰ-12 h LC3Ⅱ/LC3Ⅰ-18 h對照組（n=3） 45.95±0.60 46.92±0.70 41.34±14.23 155.42±5.70 155.05±4.67模型組（n=3） 69.86±1.05* 61.44±0.39* 68.17±12.16* 172.99±18.39* 195.57±32.59*3MA 組（n=3） 76.01±1.98# 62.21±5.25# 47.77±0.43# 148.10±0.72# 146.37±2.21#Rapamycin組（n=3） 42.94±12.41△ 38.97±14.10△ 54.03±0.53△ 181.33±0.44△ 197.14±1.00△

表3 （續(xù)）

3 討論

自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)降解過程[5]。在基礎(chǔ)水平下，自噬的發(fā)生的主要功能是維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及器官相互周轉(zhuǎn)的平衡。在各種病理生理條件下，自噬活性能夠被上調(diào)以供應(yīng)細(xì)胞內(nèi)相對更多的營養(yǎng)物質(zhì)或能量的需求，滿足發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)重塑，以及消化細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊蛋白，多余的或損傷的細(xì)胞器，以及入侵到細(xì)胞內(nèi)的微生物，它充當(dāng)代謝應(yīng)激期間能量產(chǎn)生的替代機(jī)制[6]。有研究證明自噬在AMD等衰老性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[9-11]。自噬是一個分解代謝的過程，在維持RPE細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中起著基礎(chǔ)作用。當(dāng)RPE細(xì)胞暴露于持續(xù)的氧化應(yīng)激時，自噬可以作為一種細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)被激活。自噬的損傷可能導(dǎo)致受損細(xì)胞器和有毒蛋白質(zhì)的積累，從而導(dǎo)致RPE細(xì)胞功能障礙或死亡[12]。相反，不受控制和過度的自噬激活可促使RPE細(xì)胞走向與自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡，自噬在視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞中是極其活躍的，其功能障礙誘導(dǎo)RPE細(xì)胞的凋亡[13]。自噬還有助于清除RPE細(xì)胞中的堆積物[14]。視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞及光感受器細(xì)胞中，自噬是被高度激活的，自噬功能的損害可導(dǎo)致RPE細(xì)胞早期退化變性[15]。RPE的生理功能將自噬與視網(wǎng)膜衰老性疾病及光損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜退行性疾病緊密關(guān)聯(lián)。這使得自噬與視網(wǎng)膜疾病的研究熱點(diǎn)集中在例如AMD等退行性病變中[16]。

當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，微管相關(guān)蛋白1輕鏈（LC3Ⅰ）的胞漿形式被轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合形式的LC3Ⅱ，LC3Ⅰ是游離成熟的而LC3Ⅱ是脂化形式存在的，所以通常認(rèn)為LC3Ⅱ的增加標(biāo)志著自噬體的形成。p62蛋白與LC3和泛素化底物結(jié)合，隨后被吞入完整的自噬體進(jìn)行降解，這意味著p62降解的增加與自噬激活有關(guān)。Beclin 1信號通路作為經(jīng)典自噬通路之一，正向調(diào)控自噬。本研究發(fā)現(xiàn)模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1蛋白水平高于對照組，證明光誘導(dǎo)下ARPE細(xì)胞發(fā)生自噬；且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1在12～18 h呈上升趨勢，18～24 h呈下降趨勢（P＜0.01）；P62在12～18 h呈下降趨勢，在 18～24 h呈上升趨勢（P＜0.01），提示模型組在12～18 h自噬增強(qiáng)在18～24 h自噬減弱。加入自噬抑制劑3MA后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1及P62蛋白水平在三個時間段比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），3MA組P62蛋白表達(dá)量在 12～24 h高于對照組（P＜0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及 Beclin1蛋白表達(dá)量在12～24 h低于對照組（P＜0.05），證實3MA抑制ARPE自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。Rapaymcin組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白水平在12～24 h均高于模型組（P＜0.01），P62蛋白水平低于模型組（P＜0.01），證實Rapaymcin激活A(yù)RPE細(xì)胞自噬，同時Rapaymcin組P62蛋白表達(dá)量在12～24 h呈下降趨勢（P＜0.01），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋 白 表 達(dá) 量 在 12～24 h呈 上 升 趨 勢（P＜0.01）；提示在12～24 h Rapaymcin組ARPE自噬水平與時間呈正相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是多種因素控制的復(fù)雜的一種細(xì)胞程序性死亡過程[11]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組12、18、24 h細(xì)胞凋亡率高于對照組（P＜0.01），證實光照對ARPE細(xì)胞的損傷。模型組細(xì)胞凋亡率在三個時間段均低于3MA組（P＜0.01），均高于Rapaymcin組（P＜0.01），同時模型組在光照12～18 h細(xì)胞凋亡率呈緩慢上升趨勢（P＜0.05），在18～24 h細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），提示在12～18 h細(xì)胞RPE細(xì)胞通過上調(diào)自噬應(yīng)對光損傷以減少細(xì)胞的凋亡率，在18～24 h，自噬降低，損傷加重，自噬的降低可能是細(xì)胞耐受性下降，無法靠自身力量應(yīng)對光損傷而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高。

本課題組前期試驗證明視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷過程中RPE的改變最先發(fā)生，長期接受光照刺激，易遭受氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致RPE細(xì)胞凋亡。本試驗利用PI3K抑制劑（3MA即3-甲基腺嘌呤）與mTOR抑制劑-rapamycin（自噬激動劑）結(jié)合Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白水平，及Annexin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3MA組降低光誘導(dǎo)下RPE自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，自噬激動劑Rapaymcin組加強(qiáng)光誘導(dǎo)下RPE自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)Rapamycin通過上調(diào)自噬活性保護(hù)RPE應(yīng)對光損傷。模型組細(xì)胞在12～18 h通過提高自噬來應(yīng)對光損傷，然而在18～24 h，自噬降低，損傷加重，我們推測18～24 h自噬的降低可能是細(xì)胞耐受性下降，無法靠自身力量應(yīng)對光損傷。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞在特定強(qiáng)度光照下，在12～18 h中自噬抑制凋亡，提高細(xì)胞生存率，在18～24 h自噬降低，細(xì)胞凋亡率升高，但是自噬究竟是從何途徑影響凋亡，以及在其他時間段兩者之間又是何關(guān)系，是接下來要研究的。本文為自噬與AMD疾病的關(guān)系及光損傷誘導(dǎo)ARPE細(xì)胞自噬與凋亡之間的關(guān)系提供了更完整的理解，為自噬可能成為AMD治療靶點(diǎn)提供了新觀點(diǎn)。進(jìn)一步以自噬為靶點(diǎn)的相關(guān)臨床試驗仍需施行，從而為臨床治療提供指導(dǎo)。