艾司洛爾對膿毒癥大鼠心肌保護作用及其可能機制

(青島大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科,山東 青島 266100)

膿毒癥是指機體對感染的反應失調導致的危及生命的器官功能障礙[1]。雖經多年努力，其病死率仍居高不下，最新的流行病學調查顯示，膿毒癥病人的病死率高達64%[2]，繼續(xù)尋找有效的治療藥物對降低病死率至關重要。膿毒癥發(fā)病機制極其復雜，其中包括交感神經過度激活，體內兒茶酚胺大量釋放，心臟是兒茶酚胺超載的主要靶器官[3]，也是膿毒癥發(fā)展過程中最常見的受損靶器官，腎上腺素能系統(tǒng)的激活可能是發(fā)生膿毒癥心功能障礙的重要機制之一。因此，有研究人員試圖應用β1腎上腺素受體阻滯劑拮抗腎上腺素能系統(tǒng)的過度激活。近年來的研究證實，β1受體阻滯劑在拮抗交感神經活性[4]、抑制炎癥反應[5]、減輕高分解狀態(tài)[6]、改善膿毒癥病人預后[7]等方面具有顯著效果，另外，β1受體阻滯劑在心肌保護方面可發(fā)揮獨特作用，對于膿毒癥病人具有良好的臨床應用前景。β腎上腺素受體已被證實表達于外周血單個核細胞，而外周血單個核細胞上存在的Toll樣受體(TLRs)炎癥通路。TLRs是一種跨膜蛋白，它能夠識別病原微生物相關分子模式(PAMPs)，例如革蘭陰性菌脂多糖(LPS)，LPS與脂多糖結合蛋白(LBP)結合形成復合物，LPS/LBP復合物隨即被單核細胞表面的CD14所識別并結合，然后進一步與TLR4相結合，通過髓樣分化蛋白88(Myd88)依賴性信號傳導通路啟動細胞內信號傳導，導致轉錄因子核因子-κB(NF-κB)的激活和易位，釋放多種炎癥因子。艾司洛爾作為一種高選擇性β1受體阻滯劑，具有起效快、作用時間短的特點，且通過紅細胞代謝，不受肝、腎功能的影響，尤其適用于危重病人。前期已有研究證實艾司洛爾可減輕心肌損傷，但其具體機制尚不清楚。因此，本實驗從TLR4/Myd88/NF-κB信號通路角度，探討艾司洛爾在膿毒癥心肌保護中的作用機制，以期為膿毒癥心肌損傷的治療提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取雄性清潔級SD大鼠60只，體質量為330～360 g，由青島大學動物實驗中心提供，于室溫18～28 ℃、相對濕度40%～60%、12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要藥物、試劑與儀器

鹽酸艾司洛爾注射液(山東齊魯制藥有限公司)；肌鈣蛋白I(TnI)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，TLR4抗體(北京索萊寶科技有限公司產品)，Myd88抗體(英國Abcam公司)，NF-κΒ p65抗體(Cell Signaling Technology公司)，β-actin多克隆抗體(Elabscience公司)，山羊抗兔IgG(Elabscience公司)；酶標儀(美國Thermo Fisher，MK3)，顯影儀(法國Vilber Fusion，FX5)，雙目光學顯微鏡(日本Olympus，BX53)。

1.3 動物分組與處理

采用隨機數字法將大鼠分為假手術組(Sham組)、膿毒癥組(Model組)和艾司洛爾組(ES組)，每組20只。所有大鼠術前12 h禁食，可自由飲水。Model組和ES組依照文獻方法行盲腸結扎穿孔術(CLP法)制備膿毒癥動物模型[8]：大鼠以100 g/L水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定后沿腹前正中線切開皮膚約2 cm，沿腹白線切開，打開腹腔，探查并找到盲腸，用3-0絲線結扎盲腸遠端，同時保持腸道通暢，用18號針頭做兩處穿刺，輕輕擠壓盲腸將兩滴腸內容物擠至腹腔，還納盲腸，逐層縫合腹壁切口。Sham組探查盲腸后立即還納關腹，不行盲腸結扎穿孔。造模成功后各組均行右側股靜脈穿刺術，ES組持續(xù)微量泵入艾司洛爾稀釋液1 mL/h(15 mg·kg-1·h-1)，共計6 h；Sham組、Model組持續(xù)泵入等量生理鹽水。各組術后1 h內均經股靜脈給予30 mL/kg生理鹽水模擬液體復蘇。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.4 檢測指標

1.4.1大鼠存活率 由3名研究人員在不知分組情況下觀察所有大鼠一般狀態(tài)，實驗大鼠出現精神萎靡、毛發(fā)豎立、眼鼻出血、腹瀉等癥狀，則提示膿毒癥造模成功。同時，計算各組大鼠的存活率。

1.4.2血清TnI、TNF-α和IL-1測定 所有存活大鼠均于造模后24 h再次麻醉，腹主動脈取血2 mL，靜置30 min后，以3 000 r/min離心15 min，分離上清，按照試劑盒說明書，采用干式免疫熒光定量法測定TnI濃度，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法分別測定TNF-α、IL-1濃度。

1.4.3心肌組織病理學觀察 術后24 h麻醉處死大鼠，分離大鼠心臟，取左心室游離壁，以4 ℃生理鹽水洗凈血污，用40 g/L多聚甲醛固定72 h以上，流水洗凈甲醛，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，經攤片、烤片后進行蘇木精-伊紅染色，封片后在光學顯微鏡下觀察心肌組織學變化。從心肌變性壞死、出血、間質水腫和中性粒細胞浸潤等方面觀察心肌病變分布情況，并采用半定量評分系統(tǒng)進行評分[9]，組織病理評分為0～4分，分別代表病變受累率0、25%、50%、75%和100%。由3名高年資病理科醫(yī)師在不知分組情況下同時進行組織病理學檢查并給出分數，取平均值。

1.4.4Western blot檢測心肌組織TLR4、Myd88和NF-κB蛋白表達 用電子天平稱取100 mg心肌組織，組織剪剪碎后，按每20 mg組織加入200 μg組織細胞裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，裂解后的樣品以12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。配制100 g/L的SDS-PAGE分離膠及50 g/L的濃縮膠，經過上樣、蛋白電泳、轉膜、封閉后，分別加入TLR4(1∶1 000)、Myd88(1∶1 000)及NF-κB(1∶1 000)抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶5 000)稀釋液，于室溫下孵育2 h，洗膜后加入超敏ECL發(fā)光液進行顯影，采用Image J軟件分析各條帶光密度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠存活率的比較

術后24 h，Sham組大鼠死亡2只，存活率為90.0%；Model組死亡9只，存活率為55.0%；ES組死亡7只，存活率為65.0%。Model組大鼠存活率較Sham組顯著降低(χ2=6.14，P<0.05)，而ES組與Model組存活率比較差異無顯著性(χ2=0.42，P>0.05)。盲腸結扎穿孔術后，Model組、ES組大鼠均出現精神萎靡、毛發(fā)豎立、眼鼻出血、腹瀉等膿毒癥癥狀，而Sham組大鼠未出現上述癥狀。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學變化

光鏡下Sham組心肌細胞結構正常，纖維肌絲束排列緊密，未見明顯水腫、充血、變性以及壞死等；Model組可見心肌細胞大量壞死，呈空泡樣變性，心肌纖維明顯水腫，排列疏松，部分心肌纖維斷裂，細胞核腫脹，間質水腫、炎性細胞浸潤；ES組與Model組相比心肌細胞壞死減少，心肌纖維排列欠規(guī)整，間質無明顯水腫，仍有少量炎性細胞浸潤。心肌組織病理評分Model組(2.45±0.69)>ES組(1.77±0.73)>Sham組(0.83±0.71)，差異具有顯著意義(F=18.84，P<0.05)。

2.3 各組大鼠血清TnI含量的比較

Model組大鼠血清TnI含量較Sham組明顯升高，ES組大鼠血清TnI含量較Model組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=231.82，P<0.05)。見表1。

2.4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1含量的比較

Model組大鼠血清TNF-α、IL-1含量較Sham組明顯升高，ES組大鼠血清TNF-α以及IL-1含量較Model組明顯降低，差異有顯著性(F=335.21、602.11，P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清TnI、TNF-α和IL-1含量比較

2.5 各組大鼠心肌組織TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達的比較

Model組大鼠心肌組織中TLR4、Myd88以及NF-κB蛋白表達較Sham組明顯升高，而ES組大鼠心肌組織中TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達較Model組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=17.15～95.92，P<0.05)。表明艾司洛爾可抑制膿毒癥大鼠心肌組織中TLR4、Myd88及NF-κB蛋白的表達。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠心肌組織TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達電泳圖

表2 各組大鼠心肌組織TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表達比較

3 討 論

膿毒癥是重癥醫(yī)學領域的常見病、多發(fā)病，已成為沉重的公共衛(wèi)生負擔。心肌損傷是膿毒癥導致的常見的器官功能障礙之一，其發(fā)病機制復雜，涉及全身炎癥網絡系統(tǒng)激活、免疫功能障礙、冠狀動脈低灌注或不均勻灌注、氧化應激、Ca2+超載、線粒體功能障礙等[10-12]。雖然許多病理生理機制被提出，但每種機制的全部影響尚未闡明。目前臨床上通過測量生物標志物(心肌肌鈣蛋白、腦鈉肽)和使用超聲心動圖，可以很容易地識別膿毒癥病人的心臟功能障礙。然而，尚無針對膿毒癥心肌抑制的特異性治療方法。當前治療常通過液體復蘇、血管活性藥物的支持確保足夠的心室充盈，優(yōu)化血流動力學穩(wěn)定性，在很大程度上仍屬于支持性治療。未來的研究應集中在糾正特定病理生理學異常的靶向治療上。

艾司洛爾作為一種β受體阻滯劑，因具有負性肌力作用以往通常被認為不適合用于膿毒癥休克的治療。隨著對膿毒癥病理機制的不斷深入研究，人們發(fā)現膿毒癥病人的典型特征是腎上腺素能系統(tǒng)過度激活，強烈的腎上腺素能刺激可產生多種毒副作用，包括心臟效應，如心率、心肌收縮力和心肌能量需求增加，以及心臟外效應，如高分解狀態(tài)、高凝狀態(tài)、全身炎癥細胞因子的釋放調節(jié)。因此，人們對在膿毒癥病人中使用β腎上腺素能阻滯劑越來越感興趣，目的是減輕交感神經過度刺激引起的副作用。SUZUKI等[5]的實驗結果顯示，連續(xù)輸注艾司洛爾可改善CLP法所致膿毒癥大鼠的各項心功能指標，表明艾司洛爾可改善膿毒癥大鼠心肌氧利用率，作者認為艾司洛爾的這種心臟保護作用可能是通過阻斷過度的β腎上腺素能刺激、減少β腎上腺素能受體密度而實現的。這一觀點也得到了國內學者的認同[13-14]。另有研究顯示，艾司洛爾還可通過抑制炎癥遞質的表達，提高膿毒癥病人的心臟效應[15-16]。除此之外，β受體阻滯劑在治療膿毒癥方面也表現出生存率上的優(yōu)勢，例如，LIU等[17]研究表明，艾司洛爾可降低膿毒癥休克病人28 d死亡率，同時縮短ICU住院時間。由此可見，艾司洛爾在治療膿毒癥所致心肌損傷方面具有積極作用。

文獻報道，盲腸結扎穿孔術后24 h心肌損傷最明顯，是觀察膿毒癥心肌損傷最合適的時間點[18]。本實驗模型評價結果顯示，造模24 h后開腹可見腹腔大量滲出伴有惡臭，盲腸末端充血壞死，同時心肌組織病理切片鏡下可見心肌細胞大量壞死，心肌纖維明顯水腫、排列疏松，部分心肌纖維斷裂，細胞核腫脹，間質水腫、炎性細胞浸潤，提示膿毒癥造模成功。TnI是目前檢測心肌細胞損傷的“金標準”[19]，不僅可以作為診斷膿毒癥心肌損傷的指標，還可以作為病情嚴重程度和預后的指標[20]。LABUGGER等[21]的研究發(fā)現，在膿毒癥過程中，心肌細胞損害多為細胞亞微結構的改變，心肌內肌鈣蛋白裂解為較小片段，心肌細胞膜通透性增加，從而導致血漿肌鈣蛋白水平的升高。因此，本實驗選擇TnI作為膿毒癥后心肌損傷及其程度的評價指標。本文結果顯示，Model組大鼠的血清TnI濃度較Sham組顯著升高,提示采用CLP法可誘導膿毒癥心肌損害，ES組的TnI濃度較Model組顯著降低，表明艾司洛爾能夠減輕膿毒癥大鼠心肌損傷。

膿毒癥時，LPS可促進大量細胞因子釋放，從而引發(fā)一系列炎癥反應，過度炎癥反應可導致器官功能障礙，尤其是心臟。TNF-α在膿毒癥發(fā)病早期起關鍵作用，它是啟動炎癥級聯(lián)反應的始動因子，抑制TNF-α信號能有效改善內毒素血癥引起的心肌損傷[22]。例如，糖皮質激素在抑制TNF-α的同時，可以減輕膿毒癥大鼠的心肌抑制[23]；阿托伐他汀可以抑制TNF-α的表達，減輕炎癥反應，從而減輕膿毒癥大鼠的心肌損傷[24]。與以往研究相一致，本實驗也證實膿毒癥大鼠血清中TNF-α的表達水平明顯增加，通過外源性給予艾司洛爾，可以明顯降低TNF-α的表達。另外，炎癥因子IL-1也在膿毒癥心肌損傷中發(fā)揮重要作用[25]。例如，黃芪多糖能夠抑制膿毒癥大鼠心肌組織IL-1的表達，從而減輕心臟損害[26]。本文研究結果顯示，Model組大鼠血清中IL-1的表達水平較Sham組明顯增加，而艾司洛爾可以明顯降低IL-1的表達水平。以上結果提示，艾司洛爾可能通過降低炎癥因子TNF-α和IL-1的表達，抑制炎癥反應，從而改善膿毒癥心肌損傷。

TLRs是一種跨膜蛋白，它能識別PAMPs，通過Myd88依賴性信號傳導通路啟動信號傳導，激活細胞內NF-κB信號通路，啟動炎癥因子轉錄[27]。近年來，對TLR4/Myd88/NF-κB信號通路的研究涉及器官移植、神經系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、腫瘤、內分泌系統(tǒng)疾病等多個領域。ZHOU等[28]采用CLP法建立膿毒癥大鼠模型，證實了抗TLR4單抗預處理可抑制TLR4/Myd88信號通路，減輕炎癥反應。本研究進一步探討了艾司洛爾調控膿毒癥大鼠心肌炎癥反應的作用機制，結果顯示，艾司洛爾能顯著抑制TLR4、Myd88、NF-κB蛋白的表達。表明TLR4/Myd88/NF-κB信號通路可能參與了膿毒癥大鼠的心肌損傷及炎癥反應。

綜上所述，艾司洛爾能夠減輕炎癥反應和心肌損傷，其作用機制可能與抑制TLR4/Myd88/NF-κB信號通路的激活有關。這將為膿毒癥大鼠心肌損傷的預防和治療提供新的研究方向。但本實驗存在未設置艾司洛爾濃度梯度、觀察時間短等不足，因此，艾司洛爾在膿毒癥心肌保護中的劑量和作用時間仍需進一步研究。